Method Article

In Vitro Bath Fermantasyon Sistemleri Kullanılarak Endobiyotikler ve İnsan Bağırsak Mikrobiyotları Arasındaki Etkileşimlerin Analizi

DOI:

10.3791/59725

⸱

August 23rd, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Comprehensive Utilization of Advantage Plants Resources in Hunan South, College of Chemistry and Bioengineering, Hunan University of Science and Engineering, 2College of Food and Biological Engineering, Zhejiang Gongshang University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan in vitro toplu fermantasyon sistemleri kullanarak endobiyotikler ve insan bağırsak mikrobiyotları arasındaki etkileşimleri araştırmak için bir protokoldür.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan bağırsak mikroorganizmaları son zamanlarda insan sağlığını teşvik ve hastalıkları önlemede araştırma önemli bir hedef haline gelmiştir. Sonuç olarak, endobiyotikler (örneğin, ilaçlar ve prebiyotikler) ve bağırsak mikrobiyotaları arasındaki etkileşimlerin araştırılması önemli bir araştırma konusu haline gelmiştir. Ancak, insan gönüllüleri ile in vivo deneyler biyoetik ve ekonomik kısıtlamalar nedeniyle bu tür çalışmalar için ideal değildir. Sonuç olarak, hayvan modelleri in vivo bu etkileşimleri değerlendirmek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, hayvan modeli çalışmaları hala biyoetik hususlar ile sınırlıdır, hayvanlarda farklı kompozisyonlar ve hayvanlarda mikrobiyota çeşitlemeleri ek olarak insanlara karşı. Alternatif bir araştırma stratejisi endobiyotikler ve in vitro bağırsak mikrobiyota arasındaki etkileşimlerin değerlendirilmesi sağlayan toplu fermantasyon deneyleri kullanımıdır. Bu stratejiyi değerlendirmek için bifidobakteriyel (Bif) eksopolisakkaritler (EPS) temsili ksenobiyotik olarak kullanıldı. Daha sonra, Bif EPS ve insan bağırsak mikrobiyotası arasındaki etkileşimler ince tabaka kromatografisi (TLC), 16S rRNA geni yüksek iş yapma lı analiz ve gaz kromatografisi gibi çeşitli yöntemlerle incelenmiştir. kısa zincirli yağ asitleri (SCFAs). Burada sunulan in vitro toplu fermantasyon sistemleri kullanarak endobiyotikler ve insan bağırsak mikrobiyotları arasındaki etkileşimleri araştırmak için bir protokoldür. Daha da önemlisi, bu protokol aynı zamanda diğer endobiyotikler ve bağırsak mikrobiyotaarasındaki genel etkileşimleri araştırmak için değiştirilebilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gut mikrobiyota insan bağırsaklarının işleyişinde ve konak sağlığında önemli bir rol oynamaktadır. Sonuç olarak, bağırsak mikrobiyota son zamanlarda hastalık önlemeve tedavi için önemli bir hedef haline gelmiştir 1. Ayrıca, bağırsak bakterileri konak bağırsak hücreleri ile etkileşim ve metabolik faaliyetler, besin kullanılabilirlik, bağışıklık sistemi modülasyonu ve hatta beyin fonksiyonu ve karar verme dahil olmak üzere temel konak süreçlerini düzenleyen2,3 . Endobiyotikler bakteri bileşimi ve bağırsak mikrobiyota çeşitliliği etkilemek için önemli bir potansiyele sahip. Böylece, endobi....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, Hunan Bilim ve Mühendislik Üniversitesi (Hunan, Çin) ve Zhejiang Gongshang Üniversitesi (Zhejiang, Çin) etik komitesinin yönergelerini izler.

1. Bakterilerin hazırlanması

  1. Bifidobacterium orta et suyu hazırlanması
    1. Aşağıdaki bileşenleri 950 mL distile suda birleştirin: et özü, 5 g/L; maya özü, 5 g/L; kazein peptone, 10 g/L; soya tonulu, 5 g/L; glikoz, 10 g/L; K2HPO4, 2.04 g/L; MgSO4·7H2O, 0.22 g/L; MnSO4. H20, 0.05 g/L; NaCl, 5 g/L; Tween 80, 1 mL; tuz çözeltisi, 40 mL (CaCl2.2H2O, 0.25 g/L; KH2PO4, 1 g/....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mukoid EPS üretimi 72 saat anaerobik kuluçka dan sonra PYG plakaları üzerinde B. longum kültürlerde görülebilir (Şekil1A). Kültür kazımalarının santrifüjü, ardından etanol çökeltme ve kuruma, selüloz benzeri EPS toplanması ile sonuçlanır (Şekil 1B). Kurutulmuş EPS ve çözünür nişasta daha sonra fermantasyon kültürleri için karbon kaynağı olarak kullanılmıştır. TLC oligosakkarit ayırma ve saflık analizi nedeniyle düşük maliyet ve hızlı sonuç dönüş

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Son on yılda insan bağırsak mikrobiyota bileşimi ve faaliyetleri anlama yolunda önemli ilerleme yapılmıştır. Bu çalışmaların bir sonucu olarak, holobiont kavramı ortaya çıkmıştır, hangi konaklar ve ilişkili mikrobiyal topluluklar arasındaki etkileşimleri temsil eden, insanlar ve bağırsak mikrobiyota arasında olduğu gibi19,20. Ayrıca, insanlar bile şimdi süperorganizmalar21olarak kabul edilir , bağırsak mikrobiyota insanlarda fonksiyonel or.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar çıkar çatışmaları olmadığını beyan ederler. Rakamlar Yin ve ark belirtilmiştir. 11. Yıl.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 31741109), Hunan Doğa Bilimleri Vakfı (No. 2018JJ3200) ve Hunan Bilim ve Mühendislik Üniversitesi'nde uygulamalı karakteristik disiplinin yapı programı tarafından finanse edilmiştir. LetPub'a (www.letpub.com) bu makalenin hazırlanmasısırasındaki dilsel yardımları için teşekkür ederiz.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 ve mikro; m membran filtrelerKırlangıç SLGP033RBNumuneleri filtrelemek için kullanın
0,4 mm ElekThermo Fischer308080-99-1İnsan dışkı örneklerini hazırlamak için kullanın
5-bromo-4-kloro-3-indolil ve beta;-D-galaktopiranosid (X-Gal)SolarbioX1010Renk plakası hazırlamak için kullanın
AseticSigma-Aldrich71251SCFA
AgarSolarbioYZ-1012214Orta
Anaerobik odaElectrotek bileşeni ve nbsp;AW 400SGBakteri kültürü ve fermantasyon
OtoklavSANYOMLS-3750tonunu otoklavlamak için kullanın
Sigma-Aldrich70178Orta
Pişirme fırınınınShanghai Yiheng Scientific Instruments Co., LtdDHG-9240A
Sığır Eti ÖzüSolarbioG8270Ortamın bileşeni
Bifidobacterium longum ReuterATCCATCC® 51870™bakteri
Safra TuzlarıSolarbioYZ-1071304Orta
ButirikSigma-Aldrich19215bileşeni SCFA
CaCl2SolarbioC7250Orta
Kılcal kolontuz çözeltisi SHIMADZU-GLInertCap FFAP (0,25 mm ve kez; 30 m ve kez; 0,25 μ m)SCFA tespiti için kullanılır
Kazein PeptonSigma-Aldrich39396Orta
Santrifüjbileşeni Thermo ScientificSorvall ST 8Santrifüjleme için kullanın
CoSO4< / sub>.7H < sub>2 < / sub>OSolarbioC7490Orta
CuSO'nun bileşeni 4< / sub>.5H < sub>2 < / sub>OSolarbio203165Orta
Sistein-HClSolarbioL1550Orta
Etanolbileşeni Sigma-AldrichE7023K vitamini hazırlamak için kullanın 1< / sub>
FeSO4< / sub>.7H < sub > 2 < / sub>OSolarbioYZ-111614Orta
Formik AsitSigma-Aldrich399388TLC
Gaz kromatografisiShimadzu CorporationGC-2010 PlusSCFA tespiti için kullanılır
Cam beherFisher ScientificFB10050Bulamaç hazırlama için kullanılır
GlikozSolarbioG8760Orta
HaeminSolarbioH8130bileşeni Orta
HCl'ninbileşeniSigma-Aldrich30721Tamponların pH'ını ayarlamak için kullanılan temel çözelti
İzobütirikSigma-Aldrich46935-USCFA
İzovalerik AsitlerSigma-Aldrich129542SCFA
K2HPO<>sub4SolarbioD9880Orta
KClSolarbioP9921Orta
KH2< / sub>PO 4< / sub>Solarbiobileşeni P7392Orta
LiCl.3H2< / sub>OSolarbioC8380Renkli plaka hazırlamak için kullanın
Et ÖzüSigma-Aldrich-Aldrich70164bileşeni
B7350SCFA
MgCl için standart numune MgCl<>2< / sub>.6H < sub>2< / sub>OSolarbioM8160Orta
MgSO4< / sub>.7H 2< / sub>OSolarbioM8300
MISEQIlluminaMiSeq 300PE sistemininDNA dizilimi
MnSO4< / sub>. H20Sigma-AldrichM8179Orta
Mupirosintuz çözeltisi SolarbioYZ-1448901Antibiyotik
NaClSolarbioYZ-100376Orta
NaHCO3< / sub>Sigma-Aldrich 792519Tuz çözeltisi Orta
NanoDrop ND-2000tuz çözeltisi NanoDrop TeknolojileriND-2000DNA konsantrasyonlarını belirleyin
NaOHSigma-Aldrich30620Tamponların pH'ını ayarlamak için kullanılan bazik çözelti
n-bütanolChemSpider71-36-3
NiCl2Solarbio746460Ortamın bileşeni
OrcinolSigma-Aldrich447420Orsinol reaktiflerini
hazırlamak için kullanılırPropiyonikSigma-Aldrich94425SCFA
QIAamp DNA Dışkı Mini KitiQIAGEN51504Bakteriyel genomik DNA
Özü Kullanıma hazır PBS tozuSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A610100-0001Lipid süspansiyonunu hazırlamak için kullanılır
ResazurinSolarbioR8150Anaerobik Ekipman
Hızlı Vakum KonsantratörüLABCONCOCentriVapEPS'leri hazırlamak için kullanın
NişastaSolarbioYZ-140602Karbon kaynağına kullanın
Sülfürik AsitSigma-Aldrich150692Orsinol reaktiflerini
T100 PCRBIO-RADPCR amplifikasyonu
TLC alüminyum levhalarMerckMillipore116835TLC
Triptikaz PeptonSigma-AldrichZ699209için kullanılır Orta
TriptonSigma-Aldrichbileşeni T7293Ortamın bileşeni
Tween 80SolarbioT8360Ortamın tuz çözeltisi
ValericSigma-Aldrich75054SCFA Vitamini K için standart numune
1< / sub>Sigma-AldrichV3501
Vorteks osilatörününScientific IndustriesVortex.Genie2Maya Ekstraktını girdaplamak için kullanın
Sigma-AldrichY1625Orta
ZnSO4.7H bileşeni2OSigma-AldrichZ0251Ortamın bileşeni
için standart numune Bacto soya bileşeni bileşeni bileşeni için kullanılır için standart numune tuz çözeltisi için standart numune Orta Metafosforik Asit Sigma-Aldrich'in Orta tuz çözeltisi için standart numune hazırlamak için kullanılır 1861096 Orta bileşeni

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Maarten, V. D. G., Blottière Hervé, M., Doré, J. Humans as holobionts: implications for prevention and therapy. Microbiome. 6 (1), 81(2018).
  2. Allen, A. P., Dinan, T. G., Clarke, G., Cryan, J. F. A psychology of the human brain-gut-microbiome axis. Social and Personalit....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Endobiotics Gut MicrobiotaIn Vitro FermentationBifidobacterial EPSThin Layer ChromatographyGas Chromatography16S rRNA SequencingShort Chain Fatty AcidsAnaerobic IncubationFecal Sample PreparationPolysaccharide Degradation

Related Articles