Method Article

In Vitro Bath Fermantasyon Sistemleri Kullanılarak Endobiyotikler ve İnsan Bağırsak Mikrobiyotları Arasındaki Etkileşimlerin Analizi

DOI:

10.3791/59725

⸱

August 23rd, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Comprehensive Utilization of Advantage Plants Resources in Hunan South, College of Chemistry and Bioengineering, Hunan University of Science and Engineering, 2College of Food and Biological Engineering, Zhejiang Gongshang University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan in vitro toplu fermantasyon sistemleri kullanarak endobiyotikler ve insan bağırsak mikrobiyotları arasındaki etkileşimleri araştırmak için bir protokoldür.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan bağırsak mikroorganizmaları son zamanlarda insan sağlığını teşvik ve hastalıkları önlemede araştırma önemli bir hedef haline gelmiştir. Sonuç olarak, endobiyotikler (örneğin, ilaçlar ve prebiyotikler) ve bağırsak mikrobiyotaları arasındaki etkileşimlerin araştırılması önemli bir araştırma konusu haline gelmiştir. Ancak, insan gönüllüleri ile in vivo deneyler biyoetik ve ekonomik kısıtlamalar nedeniyle bu tür çalışmalar için ideal değildir. Sonuç olarak, hayvan modelleri in vivo bu etkileşimleri değerlendirmek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, hayvan modeli çalışmaları hala biyoetik hususlar ile sınırlıdır, hayvanlarda farklı kompozisyonlar ve hayvanlarda mikrobiyota çeşitlemeleri ek olarak insanlara karşı. Alternatif bir araştırma stratejisi endobiyotikler ve in vitro bağırsak mikrobiyota arasındaki etkileşimlerin değerlendirilmesi sağlayan toplu fermantasyon deneyleri kullanımıdır. Bu stratejiyi değerlendirmek için bifidobakteriyel (Bif) eksopolisakkaritler (EPS) temsili ksenobiyotik olarak kullanıldı. Daha sonra, Bif EPS ve insan bağırsak mikrobiyotası arasındaki etkileşimler ince tabaka kromatografisi (TLC), 16S rRNA geni yüksek iş yapma lı analiz ve gaz kromatografisi gibi çeşitli yöntemlerle incelenmiştir. kısa zincirli yağ asitleri (SCFAs). Burada sunulan in vitro toplu fermantasyon sistemleri kullanarak endobiyotikler ve insan bağırsak mikrobiyotları arasındaki etkileşimleri araştırmak için bir protokoldür. Daha da önemlisi, bu protokol aynı zamanda diğer endobiyotikler ve bağırsak mikrobiyotaarasındaki genel etkileşimleri araştırmak için değiştirilebilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gut mikrobiyota insan bağırsaklarının işleyişinde ve konak sağlığında önemli bir rol oynamaktadır. Sonuç olarak, bağırsak mikrobiyota son zamanlarda hastalık önlemeve tedavi için önemli bir hedef haline gelmiştir 1. Ayrıca, bağırsak bakterileri konak bağırsak hücreleri ile etkileşim ve metabolik faaliyetler, besin kullanılabilirlik, bağışıklık sistemi modülasyonu ve hatta beyin fonksiyonu ve karar verme dahil olmak üzere temel konak süreçlerini düzenleyen2,3 . Endobiyotikler bakteri bileşimi ve bağırsak mikrobiyota çeşitliliği etkilemek için önemli bir potansiyele sahip. Böylece, endobiyotikler ve insan bağırsak mikrobiyota arasındaki etkileşimler artan araştırma dikkat çekti4,5,6,7,8,9.

Biyoetik ve ekonomik kısıtlamalar nedeniyle endobiyotikler ve insan bağırsak mikrobiyotası in vivo arasındaki etkileşimleri değerlendirmek zordur. Örneğin, endobiyotikler ve insan bağırsak mikrobiyotası arasındaki etkileşimleri araştıran deneyler Gıda ve İlaç İdaresi izni olmadan yapılamaz, ve gönüllü alımı pahalıdır. Sonuç olarak, hayvan modelleri genellikle bu tür araştırmalar için kullanılır. Ancak, hayvan modellerinin kullanımı farklı mikrobiyota kompozisyonları ve hayvan-vs insan ilişkili topluluklarda çeşitlilik nedeniyle sınırlıdır. Alternatif in vitro yöntemi endobiyotikler ve insan bağırsak mikrobiyota arasındaki etkileşimleri keşfetmek için toplu kültür deneyleri kullanımı ile.

Eksopolisakkaritler (EPSs) önemli ölçüde insan sağlığının bakımına katkıda prebiyotikler10. Farklı monosakkarit bileşimlerinden ve yapılarından oluşan farklı EPS'ler farklı işlevler sergileyebilir. Daha önceki analizler, mevcut çalışmada hedeflenen temsili ksenobiyotik olan Bif EPSs'nin bileşimini belirlemiştir11. Ancak, konakilişkili metabolik etkileri EPS bileşimi ve çeşitliliği açısından dikkate alınmamıştır.

Burada açıklanan protokol bif EPSs fermantasyon için 12 gönüllü gelen dışkı mikrobiyota kullanır. İnce tabaka kromatografisi (TLC), 16S rRNA geni yüksek iş yapma alanı sıralaması ve gaz kromatografisi (GC) eps ve insan bağırsak mikrobiyotası arasındaki etkileşimleri araştırmak için birlikte kullanılır. Bu protokolün in vivo deneylere göre belirgin avantajları düşük maliyetli ve konak metabolizmasından kaynaklanan etkilerden kaçınmadır. Ayrıca, açıklanan protokol endobiyotikler ve insan bağırsak mikrobiyotaarasındaki etkileşimleri araştırmak diğer çalışmalarda kullanılabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, Hunan Bilim ve Mühendislik Üniversitesi (Hunan, Çin) ve Zhejiang Gongshang Üniversitesi (Zhejiang, Çin) etik komitesinin yönergelerini izler.

1. Bakterilerin hazırlanması

  1. Bifidobacterium orta et suyu hazırlanması
    1. Aşağıdaki bileşenleri 950 mL distile suda birleştirin: et özü, 5 g/L; maya özü, 5 g/L; kazein peptone, 10 g/L; soya tonulu, 5 g/L; glikoz, 10 g/L; K2HPO4, 2.04 g/L; MgSO4·7H2O, 0.22 g/L; MnSO4. H20, 0.05 g/L; NaCl, 5 g/L; Tween 80, 1 mL; tuz çözeltisi, 40 mL (CaCl2.2H2O, 0.25 g/L; KH2PO4, 1 g/L; NaHCO3, 10 g/L; NaCl, 2 g/L); ve resazurin, 0.4 mL (2.5 mg/L). 2 M NaOH ile pH'ı 6,8'e ayarlayın.
    2. 121 °C'de 15 dakika boyunca otoklav ve suyu anaerobik koşullarda oda sıcaklığına (RT) soğumasını bekleyin (%10 H2, %10 CO2,%80 N2). Ortama filtre ile sterilize edilmiş sistein-HCl (0.5 g/L) ve mupirosin (5 mg/L) ekleyin.
  2. Anaerobik koşullarda 5 mL bifidobacterium orta et suyu ile bir kültür tüpüne dondurulmuş Bifidobacterium longum bir aliquot (50 μL) ekleyin, sonra 37 °C'de 24 saat için bir anaerobik kuluçka kültürü.

2. Bifidobakteriyel EPS hazırlanması

  1. PYG agar orta hazırlanması
    1. Aşağıdakileri birleştirin: peptone, 20 g/L; maya özü, 10 g/L; glikoz, 5 g/L; NaCl, 0.08 g/L; CaCl2, 0.008 g/L; MgSO4·7H2O, 0.008 g/L; K2HPO4, 0.04 g/L; KH2PO4, 0.04 g/L; NaHCO3, 0.4 g/L; agar, 12 g/L. 10 M NaOH kullanarak pH'ı 7,2'ye ayarlayın.
    2. 15 dakika boyunca 121 °C'de otoklav ve ~50 °C'ye kadar soğutun. Daha sonra, orta 1 L başına, filtre sterilize K1 çözeltisi 0.5 mL ekleyin (1 gK 1 vitamini 99% etanol 99 mL çözünmüş), haemin çözeltisi 5 mL (haemin 0.5 g 1 mol /L NaOH 1 mL çözünmüş , daha sonra distile su ile 100 mL kadar getirdi), ve sistein-HCl 0.5 g.
    3. PYG plakalarını dökmeden önce, ortama filtre sterilize edilmiş 5-bromo-4-kloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-Gal, 0.06 g/L), LiCl·3H2O (5.7 g/L) ve mupirocin (5 mg/L) ekleyin.
      NOT: X-Gal ve LiCl.3H2O renklendirme değişiklikleri ile plakalar üzerinde B. longum kolonilerinin tanımlanmasına izin verir.
  2. 20 μL B. longum suşlarını (adım 1.2) PYG plakalarına aşıla ve 37 °C'de 72 saat boyunca anaerobik bir kuluçka makinesine yerleştirin.
  3. Bir tartım kepçesi kullanarak PYG plakalarından mukoid bakteri kolonileri toplayın, sonra bir girdap osilatör kullanarak fosfat tamponlu salin (PBS) 10 mL tamamen askıya.
    NOT: Bakteriyel ve EPS karışımları, lifler PBS'de tamamen eriyene kadar tekrar tekrar yukarı veya aşağı borular girdap veya borulama ile tamamen askıya alınmalıdır.
  4. Süspansiyonu 5 dk için 6.000 x g olarak santrifüj edin.
  5. Supernatants'ı yeni bir santrifüj tüpüne dikkatlice aktarın ve tekrarlanan ters çevirme ve harmanlama ile üç cilt soğuk %99 etanol ile tamamen karıştırın.
  6. Karışımı 5 dk için 6000 x g'da santrifüj edin ve süpernatantları tamamen çıkarın.
  7. Hız vakum kullanarak bir gecede EPS ekstreleri kazıyarak ve kurutarak santrifüj tüpleri çökeltileri çıkarın.

3. Fermantasyon ortamının hazırlanması

  1. Temel kültür ortamının hazırlanması VI
    1. Aşağıdakileri birleştirin: peptone, 3 g/L; tripton, 3 g/L; maya özü, 4.5 g/L; müsin, 0.5 g/L; safra tuzları No. 3, 0.4 g/L; NaCl, 4.5 g/L; KCl, 2.5 g/L; MgCl2·6H2O, 4.5 g/L; 1 mL Tween 80; CaCl2.6H2O, 0.2 g/L; KH2PO4, 0.4 g/L; MgSO4·7H2O, 3.0 g/L; MnCl2·4H2O, 0.32 g/L; FeSO4·7H2O, 0.1 g/L; CoSO4·7H2O, 0.18 g/L; CaCl2·2H2O, 0.1 g/L; ZnSO4·7H2O, 0.18 g/L; CuSO4·5H2O, 0.01 g/L; ve NiCl2·6H2O, 0.092 g/L. PH'ı 1 M HCl ile 6,5'e ayarlayın.
    2. Bölüm 2.1'de yapıldığı gibi haemin ve sistein hazırlayın ve otoklavlama ve soğutmadan sonra ekleyin.
  2. VI temel ortamile farklı karbon kaynakları içeren kültür ortamı hazırlayın. Otoklavlamadan önce, grup VI_Bif'i içeren orta VI'ye 8 g/L Bif EPS lifleri ekleyin. Buna ek olarak, grup VI_Starch temsil etmek için orta VI 8 g / L nişasta ekleyin. Son olarak, bir karbon kaynağı eklenmeden orta VI kontrol (grup VI) olarak kullanılır.
    NOT: Bif EPS ve nişasta önce manyetik bir karıştırıcı kullanılarak sıcak suda çözülür, daha sonra hazır VI ortamı ile karıştırılır.
  3. 15 dakika boyunca 121 °C'deki tüm ortamları otoklavla ve RT'ye soğumaya bırakın.
  4. Her ortamdan bir alt numuneyi (5 mL) anaerobik kuluçka makinesinde kültür tüplerine aktarın ve kalan ortamı 4 °C'de saklayın.

4. İnsan dışkı örnek hazırlama

  1. Sağlıklı yetişkin insan gönüllülerdışkı kapları kullanarak taze dışkılama hemen sonra taze dışkı örnekleri toplamak ve daha sonra bulamaç hazırlanması için kullanın.
    NOT: Örnek toplama öncesinde, tüm gönüllüler antibiyotik, probiyotik veya prebiyotik tedavilerin en az 3 ay boyunca örnek bağışı ndan önce alınmaması için taranmalıdır. Buna ek olarak, tüm bağışçılar bilgilendirilmiş, yazılı onay vermelidir.
  2. Taze dışkı örneğini (1 g) ila 0,1 M anaerobik PBS (pH 7,0) cam gagalara aktarın, ardından %10 (w/v) bulamaç hazırlamak için cam çubuklar kullanın.
  3. Dışkı bulamacını filtrelemek için 0,4 mM elek kullanın. Daha sonra, toplu kültür fermantasyon deneylerini aşılamak için filtrelenmiş bulamaç alt örneğini kullanın ve geri kalanını daha fazla analiz için -80 °C'de saklayın.
    NOT: 4.2-4.3 basamakları anaerobik bir odada gerçekleştirilir.

5. In vitro toplu fermantasyon

  1. Bir anaerobik oda içinde adım 3.2 hazırlanan fermantasyon ortamına filtrelenmiş dışkı bulamacı (500 μL) ekleyin, ardından 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
  2. 24 h ve 48 h'de mayalanmış numunelerden 2 mL'yi anaerobik odada toplayın ve 3 dk için 6.000 x g'da odanın dışında santrifüj edin.
  3. Süpernatanları polisakkarit bozunma analizi ve kısa zincirli yağ asitleri (SCFA) ölçümleri için kullanılacak yeni bir santrifüj tüpüne dikkatlice aktarın.
  4. Santrifüj peletlerini -80 °C'de saklayın ve daha sonra bakteriyel genomik DNA ekstraksiyonu için kullanın.

6. İnsan dışkı mikrobiyotası tarafından EPS bozulması

  1. Önceden kaplanmış silika jel-60 TLC alüminyum plakalara fermente edilmiş süpernatantların 0,2 μL'sini yükleyin, ardından saç kurutma makinesi kullanarak kurulayın.
  2. Plakaları formik asit/n-butanol/su (6:4:1, v:v:v) çözeltisi içinde 20 mL'lik bir çözeltide geliştirin ve saç kurutma makinesi kullanarak kurulayın.
  3. Boya için orsinol reaktif plakaları ıslatın, sonra bir saç kurutucu kullanarak kuru.
    1. Distile su 25 mL içinde Likenol 900 mg eriterek orsinol reaktifleri hazırlayın sonra etanol 375 mL ekleyerek. Daha sonra, konsantre sülfürik asit yavaş yavaş eklenmelidir ve çözelti iyice karıştırılmalıdır.
  4. 120 °C'de bir fırında 3 dk ısı tonuyla pişirilir ve TLC bantlarını ölçerek EPS'nin bozulmasını değerlendirir.

7. EPS'nin insan bağırsak mikrobiyotası üzerindeki etkileri

  1. Adım 4.3'te hazırlanan orijinal dışkı örneklerini ve 5.4 adımda hazırlanan fermente numuneleri dondurun-eritin.
  2. Üreticinin talimatları doğrultusunda bir dışkı bakteriyel genomik DNA çıkarma kiti kullanarak tüm örneklerden bakteriyel genomik DNA (gDNA) ayıklayın.
  3. Mikro spektrofotometre ve agar jel elektroforezi kullanarak DNA konsantrasyonlarını, bütünlüklerini ve boyut dağılımlarını belirleyin.
  4. Daha önce açıklanan ileri ve ters astarlar12aşağıdakileri kullanarak çıkarılan gDNA'dan bakteriyel 16S rRNA genlerinin PCR'sini gerçekleştirin:
    -ileri astar (barkodlu astar 338F): ACTCCTACGGGAGGCAGCA
    -ters astar (806R): GGACTACHVGGGTWTCTAAT
    Aşağıdaki termal döngü koşullarını kullanın:
    1. 5 dk için 94 °C.
    2. 30 s için 94 °C.
    3. 30 s için 55 °C.
    4. 1 dk için 72 °C.
    5. 35 döngü için 2-4'u tekrarlayın
    6. 5 dk için 72 °C.
    7. 4 °C, termal döngüden çıkarılana kadar bekletin.
  5. PCR ürünlerinin yüksek iş yapma elde sini, ultra yüksek üretim mikrobiyal topluluk analizini kullanarak BIR DNA sıralama şirketinde gerçekleştirin.
  6. Mikrobiyal Ekoloji (QIIME) dizi analizi boru hattı13içine Nicel Insights kullanarak temiz, yüksek kaliteli diziler elde edin.
  7. Mothur yazılım paketi14gibi biyoinformatik araçları kullanarak %97'den fazla nükleotit benzerliği ile 16S rRNA gen dizileri için operasyonel taksonomik birimleri (Otus) tanımlayın.
  8. Her OTU'dan bir temsilci sıra seçin ve temsili dizileri15sınıflandırmak için SILVA taksonomik veritabanı ile birlikte RDP sınıflandırıcısını kullanın.
  9. Biyoinformatik araçları 16 kullanarak Good'un kapsamını, alfa çeşitliliği ölçümlerini (Simpson ve Shannon indeksidahil) ve zenginliği (gözlenen OTÜs sayısı) hesaplayın.

8. EPS'nin insan bağırsak mikrobiyotası ile SCFA üretimiüzerine etkileri

  1. Adım 5,3 ila 2 mL santrifüj tüpler hazırlanan fermente supernatants (1 mL) ekleyin.
  2. Numunelerin her birine %0,2 mL (w/v) metafosforik asit ekleyin ve girdap yaparak çözeltileri iyice karıştırın.
  3. Karışımları 13.000 x g'de 20 dk için santrifüj edin ve süpernatantları taze tüplere aktarın.
  4. Buna eşlik etmek üzere, 120 mM asetik, propiyonik, bütirik, izobütirik, valerik ve izovalerik asitlerin çözeltilerini hazırlayın. Daha sonra, her bir hazırlanan asit 1 mL ekleyin 1.2 mL 25% (w / v) metafosforik asit ve standart kokteyller olarak kullanın.
  5. Örnekleri 0,22 μM membran kullanarak filtreleyin.
  6. Daha önce açıklanan protokollere göre yüksek performanslı gaz kromatografisi kullanarak SCFA konsantrasyonlarını saptamak11,17.
    NOT: Gaz kromatografisi (GC) için InertCap FFAP kolonu (0.25 mM x 30 m x 0.25 μM) kullanılır. SCFA konsantrasyonları daha sonra GC Solution yazılım paketinde tek noktalı dahili standart yöntemi kullanılarak en yüksek alanlara göre ölçülür.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mukoid EPS üretimi 72 saat anaerobik kuluçka dan sonra PYG plakaları üzerinde B. longum kültürlerde görülebilir (Şekil1A). Kültür kazımalarının santrifüjü, ardından etanol çökeltme ve kuruma, selüloz benzeri EPS toplanması ile sonuçlanır (Şekil 1B). Kurutulmuş EPS ve çözünür nişasta daha sonra fermantasyon kültürleri için karbon kaynağı olarak kullanılmıştır. TLC oligosakkarit ayırma ve saflık analizi nedeniyle düşük maliyet ve hızlı sonuç dönüş

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Son on yılda insan bağırsak mikrobiyota bileşimi ve faaliyetleri anlama yolunda önemli ilerleme yapılmıştır. Bu çalışmaların bir sonucu olarak, holobiont kavramı ortaya çıkmıştır, hangi konaklar ve ilişkili mikrobiyal topluluklar arasındaki etkileşimleri temsil eden, insanlar ve bağırsak mikrobiyota arasında olduğu gibi19,20. Ayrıca, insanlar bile şimdi süperorganizmalar21olarak kabul edilir , bağırsak mikrobiyota insanlarda fonksiyonel or...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar çıkar çatışmaları olmadığını beyan ederler. Rakamlar Yin ve ark belirtilmiştir. 11. Yıl.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 31741109), Hunan Doğa Bilimleri Vakfı (No. 2018JJ3200) ve Hunan Bilim ve Mühendislik Üniversitesi'nde uygulamalı karakteristik disiplinin yapı programı tarafından finanse edilmiştir. LetPub'a (www.letpub.com) bu makalenin hazırlanmasısırasındaki dilsel yardımları için teşekkür ederiz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 ve mikro; m membran filtrelerKırlangıç SLGP033RBNumuneleri filtrelemek için kullanın
0,4 mm ElekThermo Fischer308080-99-1İnsan dışkı örneklerini hazırlamak için kullanın
5-bromo-4-kloro-3-indolil ve beta;-D-galaktopiranosid (X-Gal)SolarbioX1010Renk plakası hazırlamak için kullanın
AseticSigma-Aldrich71251SCFA
AgarSolarbioYZ-1012214Orta
Anaerobik odaElectrotek bileşeni ve nbsp;AW 400SGBakteri kültürü ve fermantasyon
OtoklavSANYOMLS-3750tonunu otoklavlamak için kullanın
Sigma-Aldrich70178Orta
Pişirme fırınınınShanghai Yiheng Scientific Instruments Co., LtdDHG-9240A
Sığır Eti ÖzüSolarbioG8270Ortamın bileşeni
Bifidobacterium longum ReuterATCCATCC® 51870™bakteri
Safra TuzlarıSolarbioYZ-1071304Orta
ButirikSigma-Aldrich19215bileşeni SCFA
CaCl2SolarbioC7250Orta
Kılcal kolontuz çözeltisi SHIMADZU-GLInertCap FFAP (0,25 mm ve kez; 30 m ve kez; 0,25 μ m)SCFA tespiti için kullanılır
Kazein PeptonSigma-Aldrich39396Orta
Santrifüjbileşeni Thermo ScientificSorvall ST 8Santrifüjleme için kullanın
CoSO4< / sub>.7H < sub>2 < / sub>OSolarbioC7490Orta
CuSO'nun bileşeni 4< / sub>.5H < sub>2 < / sub>OSolarbio203165Orta
Sistein-HClSolarbioL1550Orta
Etanolbileşeni Sigma-AldrichE7023K vitamini hazırlamak için kullanın 1< / sub>
FeSO4< / sub>.7H < sub > 2 < / sub>OSolarbioYZ-111614Orta
Formik AsitSigma-Aldrich399388TLC
Gaz kromatografisiShimadzu CorporationGC-2010 PlusSCFA tespiti için kullanılır
Cam beherFisher ScientificFB10050Bulamaç hazırlama için kullanılır
GlikozSolarbioG8760Orta
HaeminSolarbioH8130bileşeni Orta
HCl'ninbileşeniSigma-Aldrich30721Tamponların pH'ını ayarlamak için kullanılan temel çözelti
İzobütirikSigma-Aldrich46935-USCFA
İzovalerik AsitlerSigma-Aldrich129542SCFA
K2HPO<>sub4SolarbioD9880Orta
KClSolarbioP9921Orta
KH2< / sub>PO 4< / sub>Solarbiobileşeni P7392Orta
LiCl.3H2< / sub>OSolarbioC8380Renkli plaka hazırlamak için kullanın
Et ÖzüSigma-Aldrich-Aldrich70164bileşeni
B7350SCFA
MgCl için standart numune MgCl<>2< / sub>.6H < sub>2< / sub>OSolarbioM8160Orta
MgSO4< / sub>.7H 2< / sub>OSolarbioM8300
MISEQIlluminaMiSeq 300PE sistemininDNA dizilimi
MnSO4< / sub>. H20Sigma-AldrichM8179Orta
Mupirosintuz çözeltisi SolarbioYZ-1448901Antibiyotik
NaClSolarbioYZ-100376Orta
NaHCO3< / sub>Sigma-Aldrich 792519Tuz çözeltisi Orta
NanoDrop ND-2000tuz çözeltisi NanoDrop TeknolojileriND-2000DNA konsantrasyonlarını belirleyin
NaOHSigma-Aldrich30620Tamponların pH'ını ayarlamak için kullanılan bazik çözelti
n-bütanolChemSpider71-36-3
NiCl2Solarbio746460Ortamın bileşeni
OrcinolSigma-Aldrich447420Orsinol reaktiflerini
hazırlamak için kullanılırPropiyonikSigma-Aldrich94425SCFA
QIAamp DNA Dışkı Mini KitiQIAGEN51504Bakteriyel genomik DNA
Özü Kullanıma hazır PBS tozuSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A610100-0001Lipid süspansiyonunu hazırlamak için kullanılır
ResazurinSolarbioR8150Anaerobik Ekipman
Hızlı Vakum KonsantratörüLABCONCOCentriVapEPS'leri hazırlamak için kullanın
NişastaSolarbioYZ-140602Karbon kaynağına kullanın
Sülfürik AsitSigma-Aldrich150692Orsinol reaktiflerini
T100 PCRBIO-RADPCR amplifikasyonu
TLC alüminyum levhalarMerckMillipore116835TLC
Triptikaz PeptonSigma-AldrichZ699209için kullanılır Orta
TriptonSigma-Aldrichbileşeni T7293Ortamın bileşeni
Tween 80SolarbioT8360Ortamın tuz çözeltisi
ValericSigma-Aldrich75054SCFA Vitamini K için standart numune
1< / sub>Sigma-AldrichV3501
Vorteks osilatörününScientific IndustriesVortex.Genie2Maya Ekstraktını girdaplamak için kullanın
Sigma-AldrichY1625Orta
ZnSO4.7H bileşeni2OSigma-AldrichZ0251Ortamın bileşeni
için standart numune Bacto soya bileşeni bileşeni bileşeni için kullanılır için standart numune tuz çözeltisi için standart numune Orta Metafosforik Asit Sigma-Aldrich'in Orta tuz çözeltisi için standart numune hazırlamak için kullanılır 1861096 Orta bileşeni

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Maarten, V. D. G., Blottière Hervé, M., Doré, J. Humans as holobionts: implications for prevention and therapy. Microbiome. 6 (1), 81(2018).
  2. Allen, A. P., Dinan, T. G., Clarke, G., Cryan, J. F. A psychology of the human brain-gut-microbiome axis. Social and Personality Psychology Compass. 11 (4), e12309(2017).
  3. Arora, T., Bäckhed, F. The gut microbiota and metabolic disease: current understanding and future perspectives. Journal of Internal Medicine. 280, 39-349 (2016).
  4. Maurice, C., Haiser, H., Turnbaugh, P. Xenobiotics shape the physiology and gene expression of the active human gut microbiome. Cell. 152 (1-2), 39-50 (2013).
  5. Carmody, R. N., Turnbaugh, P. J. Host-microbial interactions in the metabolism of therapeutic and diet-derived xenobiotics. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4173-4181 (2014).
  6. Lu, K., Mahbub, R., Fox, J. G. Xenobiotics: interaction with the intestinal microflora. ILAR Journal. 56 (2), 218-227 (2015).
  7. Taguer, M., Maurice, C. The complex interplay of diet, xenobiotics, and microbial metabolism in the gut: implications for clinical outcomes. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 99 (6), 588-599 (2016).
  8. Anubhav, D., Meenakshi, S., Shankar, G. T., Mande, S. S., Wilson, B. A. Xenobiotic metabolism and gut microbiomes. PLoS One. 11 (10), e0163099(2016).
  9. Koppel, N., Rekdal, V. M., Balskus, E. P. Chemical transformation of xenobiotics by the human gut microbiota. Science. 356 (6344), 1246-1257 (2017).
  10. Hidalgo-Cantabrana, C., et al. Genomic overview and biological functions of exopolysaccharide biosynthesis in Bifidobacterium spp. Applied and Environmental Microbiology. 80 (1), 9-18 (2014).
  11. Liu, G., et al. Effects of bifidobacteria-produced exopolysaccharides on human gut microbiota in vitro. Applied Microbiology and Biotechnology. , 1-10 (2018).
  12. Tang, R., et al. Gut microbial profile is altered in primary biliary cholangitis and partially restored after UDCA therapy. Gut. 67 (3), 534-541 (2018).
  13. Kuczynski, J., et al. Using QIIME to analyze 16S rRNA gene sequences from microbial communities. Current Protocols in Microbiology. 27 (1), 1-28 (2012).
  14. Hiltemann, S. D., Boers, S. A., van der Spek, P. J., Jansen, R., Hays, J. P., Stubbs, A. P. Galaxy mothur Toolset (GmT): a user-friendly application for 16S rRNA gene sequencing analysis using mothur. GigaScience. , giy166 (2018).
  15. Wang, Q., Garrity, G. M., Tiedje, J. M., Cole, J. R. Naïve Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterial taxonomy. Applied and Environmental Microbiology. 73 (16), 5261-5267 (2007).
  16. Schloss, P. D., et al. Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7537-7541 (2009).
  17. Bai, S., et al. Comparative study on the in vitro effects of pseudomonas aeruginosa and seaweed alginates on human gut microbiota. Plos One. 12 (2), e0171576(2017).
  18. Zhang, Z., Xie, J., Zhang, F., Linhardt, R. J. Thin-layer chromatography for the analysis of glycosaminoglycan oligosaccharides. Analytical Biochemistry. 371, 118-120 (2007).
  19. Simon, J. C., Marchesi, J. R., Mougel, C., Selosse, M. A. Host-microbiota interactions: from holobiont theory to analysis. Microbiome. 7 (5), (2019).
  20. Postler, T. S., Ghosh, S. Understanding the Holobiont: how microbial metabolites affect human health and shape the immune system. Cell Metabolism. 26 (1), 110-130 (2017).
  21. Kramer, P., Bressan, P. Humans as superorganisms: how microbes, viruses, imprinted genes, and other selfish entities shape our behavior. Perspectives on Psychological Science. 10 (4), 464-481 (2015).
  22. Malfertheiner, P., Nardone, G. Gut microbiota: the forgotten organ. Digestive Diseases. 29 (6), (2011).
  23. Andoh, A. The gut microbiota is a new organ in our body. The Japanese journal of Gastro-Enterology. 112 (11), 1939-1946 (2015).
  24. Mika, A., Van, W. T., González, A., Herrera, J. J., Knight, R., Fleshner, M. Exercise is more effective at altering gut microbial composition and producing stable changes in lean mass in juvenile versus adult male f344 rats. PLoS One. 10 (5), e0125889(2015).
  25. Hugenholtz, F., de Vos, W. M. Mouse models for human intestinal microbiota research: a critical evaluation. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (1), 149-160 (2018).
  26. Takagi, R., et al. A single-batch fermentation system to simulate human colonic microbiota for high-throughput evaluation of prebiotics. PLoS One. 11 (8), e0160533(2016).
  27. Ning, T., Gong, X., Xie, L., Ma, B. Gut microbiota analysis in rats with methamphetamine-induced conditioned place preference. Frontiers in Microbiology. 8 (1), 1620(2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Endobiotics Gut MicrobiotaIn Vitro FermentationBifidobacterial EPSThin Layer ChromatographyGas Chromatography16S rRNA SequencingShort Chain Fatty AcidsAnaerobic IncubationFecal Sample PreparationPolysaccharide Degradation

Related Articles