Burada, apoptotik tirositler ve periton makrofajlar hazırlamak ve effersitoz verimliliğini ve apoptotik tirositlerin özel inhibitörü-aracılı engellemesini analiz etmek için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol yapay boncuk ve bakteri dahil olmak üzere diğer parçacıklar hücre aracılı boşluk geniş bir uygulama vardır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Makrofajlar tarafından apoptotik thymocyte engulfment deneysel Analizi
Bu makalede
Özet
Özet
Hücre apoptozis doğal bir süreçtir ve embriyonik gelişim, homeostatik düzenleme, bağışıklık toleransı indüksiyon ve inflamasyonun çözünürlüğü önemli bir rol oynar. Vücutta apoptotik enkaz birikimi zaman içinde sistemik otoimmün hastalıklara yol açan kronik inflamatuar tepkiler tetikleyebilir. Engelli apoptotik hücre boşluğu, çeşitli otoimmün hastalıklarda karışmıştır. Apoptotik boşluk fizyolojik koşullarda nadiren algılanan karmaşık bir süreçtir. Bu bol yüzey reseptörleri ve sinyalizasyon molekülleri içerir. Apoptotik hücre boşluğu sürecini incelemek, yeni terapilerinin gelişmesine yol açabilecek anlayışlı moleküler mekanizmalar ve sonraki biyolojik tepkiler sağlar. Burada, apoptotik tirositlerin indüksiyonu, periton makrofajların hazırlanması, ve osiyometri ve mikroskopi ile apoptotik hücre boşluğu analizi için protokoller açıklanmaktadır. Tüm hücreler belirli bir aşamada apoptozis geçecek, ve birçok konut ve dolaşım hücreleri apoptotik enkaz alabilir. Bu nedenle, burada açıklanan protokol birçok uygulamada apoptotik hücre bağlama ve diğer birçok hücre türleri tarafından yutulması karakterize etmek için kullanılabilir.
Giriş
Vücudumuzun günlük olarak 1-10 milyar apoptotik hücreler üretir. Apoptotik hücrelerin böyle çok sayıda bağışıklık tepkiler sessiz kalır bir şekilde temizlenmelidir. Apoptotik hücrelerin zamanında temizlenmesini sağlamak için, çok sayıda doku yerleşik hücresi ve dolaşım hücresi apoptotik hücreleri yutan mekanizmalar geliştirir1. Çeşitli enflamatuar hastalığın ve otoimmün2' nin başlangıcı ve progresyonunda apoptozin işlevsiz olarak düzenlenmesi ortaya çıkarılmıştır. Apoptosis Ayrıca kanser gelişiminin patogenezinde ve Konvansiyonel tedavilere karşı sonraki direncinde kritik bir rol oynamaktadır3
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Deneysel fareler, fareler kolonisinde yetiştirilen ve sürdürülür. Tüm hayvan çalışmaları, Cincinnati Üniversitesi 'nin kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi 'nin (ıERUC) yönergelerine göre yapılmıştır.
1. CFD etiketli apoptotik thymosit hazırlanması
- İki naif C57/B6 fareler tarafından Co2 inhalasyon için 10 dakika ve göğüs boşluğu açmak için ortadan kaldırmak, çıkarmak (dışarı çekin) eğri ince uçlu forseps ile doku kültürü Petri yemek içine timus 10 ml RPMI1640 orta.
- Mikroskop slaytlar iki buzlu uçları karşı tüm timus taşlama ve sonra 100 μm hücre süzgeci ile süspansiyon filtre tek hücreli süspansiyon eld....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Apoptotik tirmositlerin periton makrophaj aracılı Yutulmaları analizi. Peritoneal makrofajlar ve apoptotik hücreler, protokolde açıklandığı gibi hazırlanmış ve kültürlü bir şekilde hazırlanmıştır. Macrofajlar müstakil ve buz üzerinde 20 dakika boyunca PE konjuza Anti-CD11b antikor ile lekelenmiş. Makrofajlar sonra yıkanır ve bir akış cytometer işlenir. Görüldüğü gibi, kültürde hiçbir apoptotik hücre eklenmediği zaman sağ alt çeyreğinde CFSE pozitif makrophaj bulunmamaktadır (Şekil 1<.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Apoptozis birçok sinyal Cascades içeren ve protein ifadesi, salgılanması ve ulaşım indükler bir son derece uyumlu hücre ölüm sürecidir. Apoptozis genellikle hücresel morfoloji değişiklikleri ile ilişkilidir17. Apoptotik hücreler, site 'ye göç etmek için fagositler çeken sitokinleri ve kemokinlere aktif olarak serbest bırakır ve sıkı kontrol18' in altında son derece karmaşık bir yol olan alay sürecini başlatır. Öte yandan, necrotik hücre ölümü iltihaplı tepkiler tetikleyen t.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Teşekkürler
Shao laboratuvarında yapılan araştırmalar, tıp fakültesinden araştırma yenilikçi Ödülü ve Iç tıp bölümü 'nden küçük fakülte pilot Ödülü, Cincinnati Üniversitesi ve NIDDK/NıH 'dan Grant DK K01_095067 tarafından desteklenmektedir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Ack parçalama tamponu | GIBCO | A10492 | |
| Annexin V/7-AAD | BD Pharmingen | 559763 | |
| Anti-Mer antikoru | R& D Systems | BAF591 | |
| CD11b-PE (klon M1 / 70) | BD Pharmingen | 553311 | |
| CFSE | Invitrogen | C1157 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-2650 | |
| EDTA (0.5 mM) | GIBCO | 15575-020 | |
| FACS tüpleri | BD Biosciences | 352017 | |
| Buzlu slaytlar | Fisher Scientific | 12-552-343 | |
| At Serumu (Isı ile Aktive Edilmiş) | İnvitrojen | 26050088 | |
| Lidokain | Sigma-Aldrich | L-5647 | 1x PBS |
| PBS, 1x | Corning | 21040CV | |
| RPMI-1640'ta | Corning | 10040CV | |
| RXDX-106 | Selleck Kimyasalları | CEP-40783 | |
| Staurosprine (100mg) | Fisher Scientific | BP2541-100 | 1mM stoklama çözeltisi yapmak için 100 mg'a 214.3 ml DMSO ekleyin |
| Tiyoglikolat Orta Brewer Modifiye BD | Biosciences | 243010 | 1 akut% 3 tiyoglikolat tamponu hazırlayın; PBS, otoklavlanmış ve 3 ay boyunca karanlıkta saklanmalıdır. |
Kaynaklar
- Shao, W. H., Cohen, P. L. Disturbances of apoptotic cell clearance in systemic lupus erythematosus. Arthritis Research and Therapy. 13 (1), 202(2011).
- Cohen, P. L. Apoptotic cell death and lupus. Springer Seminars in Immunopathology. 28 (2), 1....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
