Yöntem makalesi

Bir on-membran sindirim tekniği kullanılarak protein-protein etkileşimlerinin değerlendirilmesi

DOI:

10.3791/59733

⸱

19 Temmuz 2019

 ,  ,  ,  , 
1Division of Biological Chemistry, Department of Molecular Biology, Showa University School of Pharmacy, 2Department of Biochemistry, Showa University School of Medicine

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, kütle spektrometresi için numunelerin hazırlanması için bir on-membran sindirim tekniği için bir protokol sunuyoruz. Bu teknik, protein-protein etkileşimlerinin uygun analizini kolaylaştırır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çok sayıda hücre içi proteinler, hücre içi ve hücre dışı koşullara uygun olarak fiziksel olarak etkileşime girebilir. Nitekim, hücresel fonksiyonlar büyük ölçüde hücre içi protein-protein etkileşimleri bağlıdır. Bu nedenle, bu etkileşimler hakkında araştırma fizyolojik süreçlerin anlaşılması kolaylaştırılması için vazgeçilmez. İlişkili proteinlerin ortak yağış, ardından kütle spektrometresi (MS) analizi, yeni protein etkileşimlerini tanımlamanıza olanak sağlar. Bu çalışmada, protein-protein etkileşimlerinin analizinde membran sindirimi ile birlikte immünopetoziteksiyon-sıvı kromatografi (LC)-MS/MS analizinin yeni tekniğinin ayrıntılarını sağdık. Bu teknik, ham immünopantitants için uygundur ve proteomik analizlerin verimi artırabilir. Etiketlenmiş rekombinant proteinler belirli antikorlar kullanılarak çöktürülmüş; Sonraki, Poliviniliden difluorid membran parçaları üzerine şişkinlik immünoprecipitants redüktif alkilasyon maruz kalmıştır. Tripsinizasyon sonrasında, sindirilmiş protein kalıntıları LC-MS/MS kullanılarak incelenmiştir. bu tekniği kullanarak, birkaç aday ilişkili proteini tespit edebildik. Böylece, bu yöntem uygun ve yeni protein-protein etkileşimleri karakterizasyonu için yararlıdır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteinler yaşayan organizmalarda kurucu roller oynamakla birlikte, hücre içi ortamlarda sürekli sentezlenmiş, işlenir ve bozulur. Ayrıca, hücre içi proteinler sıklıkla fiziksel ve biyokimyasal olarak etkileşime girebilir, bu da1,2,3' ün fonksiyonunu etkiler. Örneğin, spliceosome ile ilişkili protein homolog CWC22 ökaryotik çeviri başlatma faktörü 4A3 (eIF4A3) ile doğrudan bağlama, eXoN Junction Complex4' ün montajı için gereklidir. Bu ile tutarlı, CWC22 için benzeşimi bulunmayan bir eIF4A3 mutant eXoN kavşak karmaşık güdümlü mRNA yapıştırma4kolaylaştırmak için başarısız olur. Böylece, protein etkileşimlerinin incelenmesi, fizyolojik düzenlemenin yanı sıra hücresel fonksiyonların kesin anlayışı için çok önemlidir.

Kütle spektrometresi (MS) ' deki son gelişmeler protein-protein etkileşimlerinin kapsamlı analizine uygulanmıştır. Örneğin, endojen proteinlerin Co-yağış veya exogenously ilişkili proteinleri ile etiketlenmiş proteinleri tanıttı, MS Analizi tarafından izlenen, yeni protein etkileşimleri belirlenmesi sağlar5. Ancak, MS/MS analizinin büyük bir darboğaz protein numunelerinin triptik diyetleri kötü kurtarma olduğunu. Hücre Lysates üzerinde proteomik analizler yapmak için, in-jel ve on-membran sindirim teknikleri genellikle MS/MS örnekleri hazırlamak için kullanılmaktadır. Daha önce bir on-membran sindirim tekniği ile bir in-jel sindirim prosedürü karşılaştırdık6, ve ikinci daha iyi sıra kapsamı ile ilişkili olduğunu gösterdi. Polyvinylidene difluorid (PVDF) membran bu amaçla uygun olabilir, çünkü mekanik olarak sağlam ve yüksek konsantrasyonlarda organik çözücüler için dayanıklı7,8, immobilize enzimatik sindirim izin % 80 Asetonitril9varlığında proteinler. Ayrıca, bir membran üzerinde immobilizasyon hedef proteinlerde Konformasyonel değişiklikleri neden olabilir, triptic sindirim verimliliği iyileştirmeler yol10. Buna göre, bu yazıda, bir on-membran sindirim tekniği kullanılarak protein etkileşimlerinin ımantioprecipitation-LC/MS/MS analizinin kullanımını tarif ettik. Bu basit yöntem, uzman olmayan laboratuvarlarda bile protein-protein etkileşimlerinin uygun analizini kolaylaştırır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. immünopaperasyonu

Not: aşağıdaki bölümlerde açıklandığı gibi, sodyum olmayan dodecil sülfat (SDS) liziz tamponu ve sitrat elüsyonu kullandık. Ancak, alternatif olarak ev içi immünopresipitasyon tekniğinin kullanımı da LC-MS/MS örnekleri hazırlamak için uygulanabilir.

  1. Bir epitopu etiketi tek başına veya bir füzyon proteini kodlama vektörler ile kültürsüz hücreler transfect. Temsili veri edinme için, J774 hücrelerini (1 x 106) vektörler ile yeşil floresan proteini (Gfp) tek başına veya Gfp-Fused Capn6 (calpain-6 gen) cationıc lipozomları kullanarak aktarabilir.
  2. Manyetik boncuklar için antikor Konjugat.
    1. Bu amaçla, 500 μL sitrat fosfat tamponunun (24,5 mM sitrik asit, 51,7 mM ditemel sodyum fosfat; pH 5,0) bir 1,5 mL test tüpünde manyetik boncuk (25 μL/reaksiyon) ile Anti-GFP antikor (2 μL/reaksiyon) karıştırın.
    2. 1 saat oda sıcaklığında 50 RPM 'de karışımı döndürün. Sonra, IgG-konjugasyonlu boncukları üç kez sitrat fosfat tampon ile yıkayın 0,1% Polyoxyethylene (20) Sorbitan monolaurate.
  3. Uygun bir liziz tamponu kullanarak nakil hücreleri Lyse. Temsilci veri edinme için, 400 μL lizis tampon (50 mm Tris-HCL) içinde buz üzerinde 30 dk nakli hücreler Lyse; pH 7,5, 120 mm NaCl, 0,5% Poly (oxyethelene) octylphenyl eter) içeren 40 μmol/L fenilmetilsülfonil fluorid, 50 μg/ml leupeptin, 50 μg/ mL Aprotinin, 200 μmol/L sodyum ortoovanadat, ve 1 mM etilen glikol tetraasetik asit (EGTA) içinde 1,5 mL test tüpleri 24 saat transfeksiyondan sonra.
  4. 5 dakika 15.000 x g santrifügleme ile lysate temizleyin ve supernatant toplamak.
  5. Lysate precleer. 1,5 mL-test tüpünde etiketli olmayan manyetik boncuk (25 μL/reaksiyon) ekleyin. 500 μL sitrat fosfat tampon ile boncukları üç kez yıkayın. Son yıkama sitrat fosfat tampon kaldırıldıktan sonra, manyetik boncuk üzerinde hücre lysate ekleyin. 50 RPM 'de Rotator kullanarak karışımı, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca döndürün.
  6. Manyetik ayırıcı için 5 dakika boyunca test tüpünü manyetik stand üzerine yerleştirin ve hücre lysate 'i toplayın. Üretici tarafından belirlenmiş manyetik stand kullanımı tavsiye edilir.
  7. Hedef proteinleri konjugasyonlu boncuklarla bağlar. Immunoglobulin (Ig) G-konjuge boncukları manyetik ayırma için 5 dakika boyunca manyetik stand üzerine yerleştirin, sitrat tamponunu atın ve sonra hücre lysate 'yi Ayrı boncuklarla ekleyin.
  8. 1 saat oda sıcaklığında 50 RPM 'de karışımı döndürün.
  9. Hedef proteinleri serbest hedef olmayan proteinlerden ayırın. 500 μL kullanarak boncukları üç kez yıkayın 0,1% Polyoxyethylene içeren sitrat fosfat tampon (20) Sorbitan monolaurat. Son yıkamadan sonra, 30 μL sitrat tamponu (pH 2 – 3) ekleyin ve hedef proteinlere elute etmek için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inküye yapın.
    Not: immünopresipitasyon kurtarma yetersiz ise, flag veya It gibi alternatif epitopu etiketleri kullanımı, verimliliği artırabilir. Elüsyonun verimliliği yetersiz ise, SDS tabanlı bir çözüm gibi diğer eluants kullanımı verimliliği artırabilir.

2. proteinler üzerinde membran sindirim

Not: eksojen proteinlerle kontaminasyonu önlemek için protein içermeyen malzeme ve ekipmanların kullanılması gereklidir. Ayrıca, operatörün insan proteinlerinin kontaminasyonunu önlemek için cerrahi maske ve eldiven takması önerilir.

  1. PVDF membranlarını, metanol ile silinmiş ve kullanmadan hemen önce kurutulmuş cerrahi makas kullanarak 3 mm x 3 mm 'lik parçalara ayırın.
  2. Temiz alüminyum folyo üzerinde PVDF membran parçaları üzerinde 2 – 5 μL etanol ekleyin.
  3. Tamamen kurumadan önce, hidrofilik PVDF membranlarına (numune başına 2 – 5 μL, 4 – 6 adet) eluant ekleyin ve membran yüzeyi mat olana kadar membranları hava kurutun. Kurutulmuş membranlar 4 °C ' de saklanabilir.
  4. Tüm membranları 1,5 mL plastik tüplere aktarın, membranları hidrofilik yapmak için 20 – 30 μL etanol ekleyin ve sonra bir pipet kullanarak etanol çıkarın.
  5. Membran tamamen kurmadan önce, 200 μL ditiyotreitol (DTT) tabanlı reaksiyon çözeltisi (80 mm NH4HCO3, 10 mm DTT ve% 20 acetonitrile) ekleyin ve 1 h için 56 °c ' de inküye yapın.
  6. Reaksiyon solüsyonu 300 μL iodoacetamid çözeltisi ile değiştirin (80 mM NH4HCO3, 55 mm iodoacetamid, ve 20% Asetonitril), ve karanlıkta oda sıcaklığında 45 dk için inküye.
  7. Membranları iki kez 1 ml distile su ile yıkayın ve bir kez 1 ml% 2 Asetonitril Vortex karıştırma tarafından > 10 s.
  8. Liyofilize MS-Grade tripsin (malzeme tablosu) doğrudan reaksiyon çözeltisi (30 mm NH4HCO3 içeren% 70 acetonitrile) çözülür. 1 μg tripsin (malzeme tablosu) (30 mm NH4hco3 içeren 70% acetonitrile) Içeren reaksiyon çözeltisi 100 μl ekleyin ve bir gecede 37 °c ' de inküye yapın.
  9. Triptik kazılar içeren reaksiyon çözümünü bir pipet kullanarak temiz 1,5 mL test tüpüne aktarın.
  10. Membran için 100 μL yıkama çözeltisi (70% Asetonitril/1% trifluoroasetik asit) ekleyin ve 2 h için 60 °C ' de kulkarın. yıkama çözümünü toplayın ve reaksiyon çözeltisi ile karıştırın. Membran için başka bir 100 μL yıkama solüsyonu ekleyin ve 10 dakika boyunca sonlayın. Sonra yıkama solüsyonu toplayın ve reaksiyon çözeltisi ile karıştırın.
  11. Laboratuvar filmi bir parça ile test tüpü kapak ve bir iğne ile küçük delikler bir çift olun. Solüsyonu vakum konsantratörü ile kurutun.
  12. 10 μL% 0,2 formik asit içinde kalıntı çözülür. Santrifüjden sonra (12.000 × g, oda sıcaklığında 3 dk), süpernatant 'ı örnek bir tüpün içine aktarın.
    Not: Bu bölümün kritik adımları yıkıyor. On-membran protein sindirimi sırasında, azaltma ve damıtılmış su ile alkilasyon sonra immobilize proteinlerin içeren membranların yıkama, takip 2% Asetonitril, daha fazla için 10 sn, her biri için, reaktiflerin kaldırılması için önemlidir.

3. LC – elektrosprey iyonizasyon (ESı)-MS/MS Analizi

  1. Bir IR-MS/MS cihazı (malzeme tablosu) bir nano-LC HPLC sistemi (malzeme tablosu) ile birlikte etkinleştirin. Ön sütun (malzeme tablosu) ve analitik sütun (malzeme tablosu) bağlayın.
  2. Analiz öncesinde, standart peptidler sağlayan 0,2% formik asit içinde çözünmüş Sığır serum albümin triptik yemleri kullanarak kütle spektrometresi kalibre.
  3. Pozitif iyon modunu ve 400 – 1250 m/z kütle aralığını kullanarak numuneleri analiz edin; sonra 10 MS/MS spektrum (100 ms her) 100 – 1600 m/z Kütle aralığı ve% 2 – 80% Asetonitril ve 0,2% formik asit için 80 dk için bir akış hızında 300 nL/dak.
  4. İlgili proteinleri tanımlamak için protein tanımlaması (malzeme tablosu) yazılımını kullanarak çıkış verilerini analiz edin. Bir aday protein pozitif tanımlanması için, en az bir yüksek sadakat peptit parçası tespiti (> 95% sadakat) gereklidir.
  5. Aynı şekilde Gfp ifade endoglikozidazları (tek başına bir Gfp etiketi ifade vektör transfeksiyon) aday proteinleri listesinden çöktürülmüş proteinleri atlayın.
    Not: birkaç proteinler veritabanı analizinde tanımlanırsa, MS/MS edinme koşullarının değiştirilmesi (örn., 100 ms 'den her 50 MS 'ye kadar olan süreyi değiştirmek), tanımlanan proteinlerin sayısını artırabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yukarıda açıklanan prosedür sayesinde, immünopmanitants LC-MS/MS (Şekil 1) kullanılarak analiz edildi. Exojen türev proteinlerin (diğer türler ve IgG 'Ler) dışlandıktan sonra, calpain-6 ' d a ilişkili immünopmasitantlar (Tablo 1) ve Gfp ile ilişkili immünopoitantlara 15 proteinler tespit edildi ( Tablo 2). Calpain-6 ve GFP ilişkili proteinlerin, 11 ' i her iki immünopabitantında da tespit edildi (Şekil 2<...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Daha önce bir on-membran sindirim tekniği6Ile önceden LC-MS/MS kullanarak okside düşük yoğunluklu lipoprotein apolipoprotein B-100 oksidatif modifikasyonları bir analiz tarif ettik. Bu çalışmada, bu tekniği immünopresipitasyon ile birleştirdik ve birkaç calpain-6-ilişkili protein tespit ettik. Bu roman tekniği, aday ilişkili proteinler için tarama uygun bir yöntem temsil eder. Kalpain-6, protein-protein etkileşimi12,13ile hücresel fonksiyo...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada bilim kakenhi Grant numarası 17K09869 (AM), bilim KAKENHI Grant numarası 15K09418 (TM), tanıtımı için Japonya Derneği tanıtımı için Japonya toplum tarafından kısmen destekleniyordu Kanehara Ichiro tıp bilimi Vakfı bir araştırma hibe ve Suzuken Memorial Vakfı (tüm TM) bir araştırma hibe.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AsetonitrilWako014-00386
Sitrik asitWako030-05525
DiNAKYA Tech Co.nanoflow yüksek performanslı sıvı kromatografisi
DiNa AIKYA Tech Co.otomatik örnekleyici ile donatılmış nanoflow yüksek performanslı sıvı kromatografisi
DTTNacalai tesque14112-94
Dynabeads protein GThermo Fisher Scientific10003D
Formik asitWako066-00461
HiQ Sil C18W-3KYA Tech Co.E03-100-1000.10mmID * 100mmL
İyodoasetamidWako095-02151
Lipofektamin 3000Thermo Fisher ScientificL3000008
Yaşam Renkleri AV Monoklonal Antikor (JL-8)Clontech632380
NaClWako191-01665
NH < alt > 4 < / sub > HCO< sub>3< / sub>Wako018-21742
Nonidet P-40SigmaN6507poli (oksietelelen) oktilfenil eter (n = 9)
peptit standardıKYA Tech Co.tBSA-04sığır serum albümininin triptik sindirmeleri
PP flakonKYA Tech Co.03100Splastik numune tüpü
Proteaz inhibitörü koktailSigmaP8465
ProteinPilot yazılımıProtein tanımlaması içinSciex5034057
Sıralama Sınıfı Modifiye TripsinPromegaV5111tripsin
Sodyum ortovanadatSigmaS6508
Sodyum fosfat dibazik dihidratSigma71643
TFAWako206-10731
tuzak sütunuKYA Tech Co.A03-05-0010.5mmID * 1mmL
TripleTOF 5600 sistemiSciex4466015Hibrit dört kutuplu uçuş süresi tandem kütle spektrometresi
TrisWako207-06275
Ara-20Wako160-21211
yazılımı

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thommen, M., Holtkamp, W., Rodnina, M. V. Co-translational protein folding: progress and methods. Current Opinion in Structural Biology. 42, 83-89 (2017).
  2. Miyazaki, T., Miyazaki, A. Defective protein catabolism in atherosclerotic vascular inflammation. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 79(2017).
  3. Miyazaki, T., Miyazaki, A. Dysregulation of calpain proteolytic systems underlies degenerative vascular disorders. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 25 (1), 1-15 (2018).
  4. Steckelberg, A. L., Boehm, V., Gromadzka, A. M., Gehring, N. H. CWC22 connects pre-mRNA splicing and exon junction complex assembly. Cell Reports. 2 (3), 454-461 (2012).
  5. Turriziani, B., von Kriegsheim, A., Pennington, S. R. Protein-protein interaction detection via mass spectrometry-based proteomics. Advances in Experimental Medicine and Biology. 919, 383-396 (2016).
  6. Obama, T., et al. Analysis of modified apolipoprotein B-100 structures formed in oxidized low-density lipoprotein using LC-MS/MS. Proteomics. 7 (13), 2132-2141 (2007).
  7. Matsudaira, P. Sequence from picomole quantities of proteins electroblotted onto polyvinylidene difluoride membranes. The Journal of Biological Chemistry. 262 (21), 10035-10038 (1987).
  8. Yamaguchi, M., et al. High-throughput method for N-terminal sequencing of proteins by MALDI mass spectrometry. Analytical Chemistry. 77 (2), 645-651 (2005).
  9. Iwamatsu, A. S-carboxymethylation of proteins transferred onto polyvinylidene difluoride membranes followed by in situ protease digestion and amino acid microsequencing. Electrophoresis. 13 (3), 142-147 (1992).
  10. Strader, M. B., Tabb, D. L., Hervey, W. J., Pan, C., Hurst, G. B. Efficient and specific trypsin digestion of microgram to nanogram quantities of proteins in organic-aqueous solvent systems. Analytical Chemistry. 78 (1), 125-134 (2006).
  11. Miyazaki, T., Miyazaki, A. Emerging roles of calpain proteolytic systems in macrophage cholesterol handling. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (16), 3011-3021 (2017).
  12. Miyazaki, T., et al. Calpain-6 confers atherogenicity to macrophages by dysregulating pre-mRNA splicing. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3417-3432 (2016).
  13. Tonami, K., et al. Calpain-6, a microtubule-stabilizing protein, regulates Rac1 activity and cell motility through interaction with GEF-H1. Journal of Cell Science. 124 (Pt 8), 1214-1223 (2011).
  14. Rodnina, M. V., Wintermeyer, W. Protein elongation, co-translational folding and targeting. Journal of Molecular Biology. 428 (10 Pt B), 2165-2185 (2016).
  15. Bunai, K., et al. Proteomic analysis of acrylamide gel separated proteins immobilized on polyvinylidene difluoride membranes following proteolytic digestion in the presence of 80% acetonitrile. Proteomics. 3 (9), 1738-1749 (2003).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

mm nopresipitasyon LC MS MSPVDF MembranTripsin SindirimiManyetik BoncuklarK tle SpektrometrisiProteomik AnalizHam mm nopresipitanlarRed ktif Alkilasyon

İlgili makaleler