Protein bağlayıcı mikrodizi (PBM) deneyleri biyokimyasal tahlillerle birleşince, şablon DNA üzerinde RNA astarlarını sentezleyen bir enzim olan DNA primazının bağlayıcı ve katalitik özelliklerini birbirine bağlar. Yüksek iş itrifli primase profilleme (HTPP) olarak tanımlanan bu yöntem, çeşitli enzimlerin DNA bağlayıcı desenlerini ortaya çıkarmak için kullanılabilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Dna İlkase tarafından DNA Dizisi Tanıma Yüksek-Throughput Primase Profilleme kullanarak
Bu makalede
Özet
Özet
DNA primazı, DNA replikasyonu sırasında DNA polimeraz tarafından gecikmeli iplikçikteki Okazaki parçalarının DNA sentezini başlatan kısa RNA astarları sentezler. Prokaryotik DnaG benzeri primazların DNA'ya bağlanması belirli bir trinükleotid tanıma dizisinde gerçekleşir. Okazaki parçalarının oluşumunda önemli bir adımdır. DNA primazlarının DNA tanıma dizilimini belirlemek için kullanılan konvansiyonel biyokimyasal araçlar sadece sınırlı bilgi sağlar. Yüksek iş gücü mikrodizi tabanlı bağlayıcı test ve ardışık biyokimyasal analizler kullanılarak, 1) spesifik bağlayıcı bağlamın (tanıma alanının yan dizileri) DNA primazının şablonuna bağlanma gücünü etkilediği gösterilmiştir. DNA, ve 2) DNA primase daha güçlü bağlanması daha uzun RNA astarları verir, enzimin daha yüksek prosesini gösterir. Bu yöntem PBM ve primaz aktivite testi birleştirir ve yüksek iş itfa primase profilleme (HTPP) olarak belirlenmiş ve dna primaz tarafından benzeri görülmemiş zaman ve ölçeklenebilirlik belirli dizi tanıma karakterizasyonu sağlar.
Giriş
HTPP, DNA primazının enzimatik aktivitesini etkileyen DNA şablonlarının belirli özelliklerini istatistiksel olarak belirlemek için biyokimyasal analizle birlikte DNA bağlayıcı mikrodizi teknolojisini(Şekil 1)kullanır. Bu nedenle HTPP, bu alanda bilgi sıçramasını kolaylaştıran teknolojik bir platform sağlamaktadır. Primaz tanıma sitelerini belirlemek için kullanılan klasik araçlar büyük miktarda veri verme yeteneğine sahip değildir, oysa HTPP bunu yapar.
PBM, transkripsiyon faktörlerinin DNA1,2'yebağlanma tercihlerini belirlemek için rutin olarak kullanı....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Mikrodizi tasarımı
NOT: DNA probları, iki değişken yan bölge arasında yer alan T7 DNA primazının (GTC) tanıma bölgesinden oluşan özel 36 nükleotit dizilerini temsil eder ve ardından cam birslayt3'ebağlı sabit 24 nükleotit dizisi bulunur. 4 x 180.000 mikrodizi formatı kullandık, bu da her DNA dizisinin altı kopyada tespit ini sağladı, slaytta rastgele dağıtıldı.
-
Bilinen tanıma dizilerine sahip primases için DNA kitaplığı tasarımı
- Her dizinin 60 nükleotitten oluştuğundan emin olun. İlk 24 nükleotiti sabit tutun (cam kaydıraä a bayılacak). Değişken bölgeler aşağıdaki genel forma ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Primase bağlama alanlarının haritalanmasındaki bu teknolojik ilerleme, klasik aletler kullanılarak gözlemlemek imkansız olmasa da, zor olan DNA bağlama özelliklerinin elde edilmesine olanak sağlar. Daha da önemlisi, HTPP primase bağlayıcı sitelerin geleneksel anlayış yeniden ziyaret sağlar. Özellikle HTPP, bilinen 5'-GTC-3 tanıma dizilerine ek olarak bağlayıcı özellikleri ortaya çıkarır ve bu da T7 DNA primazının fonksiyonel aktivitelerinde değişikliklere yol açar. Yani, iki dizi grubu ta.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
PBM yöntemi transkripsiyon faktörlerinin bağlayıcı özelliklerini araştırmak için yaygın olarak kullanılmıştır ve düşük afinite ile DNA'ya bağlanan DNA primazgibi DNA işleme enzimlerine de uygulanabilir. Ancak, deneysel prosedürlerin bazı değişiklikler gereklidir. Mikrodizi deneyi birkaç adım içerir: DNA kütüphanesinin tasarımı, çipin hazırlanması, protein hedefinin bağlanması, floresan etiketleme ve tarama. Deterjan içeren solüsyonlar ile uzun yıkamalar zayıf/geçici bağlanma modu nedeniyle DNA şablonundan proteinin parça.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan etmezler.
Teşekkürler
Bu araştırma İsRAİl Bİlİm VAKFI (hibe no. 1023/18) tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| % 40 akrilamid-bisakrilamid (19: 1) çözeltisi | Merck | 1006401000 | |
| % 95 formamid | Sigma-Aldrich | F9037-100ML | |
| Alexa 488-konjuge anti-his antikoru | Qiagen | 35310 | |
| Amonyum persülfat (APS) | Sigma-Aldrich | A3678-100G | |
| ATP, [α-32P] – 3000 Ci/mmol | Perkin Elmer | ||
| Borik asit, granül | Glentham Yaşam Bilimleri | GE4425 | |
| Sığır Serum Albümini (BSA) | Roche | 10735094001 | |
| Bromofenol mavisi | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| Coplin kavanozu | |||
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D0632-25G | |
| DNA mikroarray | Agilent | 4x180K (AMADID #78366) https://www.agilent.com | |
| Etilendiamintetraasetik asit (EDTA) | Acros Organics | AC118430010 | |
| Fujifilm FLA-5100 fosfor görüntüleyici | FUJIFILM Yaşam Bilimleri | ||
| Cam slayt boyama rafı | Thermo Scientific | 12869995 | Birden fazla slayt kullanılıyorsa |
| Laboratuvar döndürücü | Thermo Scientific | 88880025 | |
| Magnezyum klorür | Sigma-Aldrich | 63064-500G | |
| Mikrodizi Hibridizasyon Odası | Agilent | G2534A | https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2534-90004_HybridizationChamber_User.pdf |
| Mikrodizi tarayıcı (GenePix 4400A) | Moleküler Cihazlar | ||
| Fosfat Tamponlu Salin (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| Potasyum glutamat | Alfa Aesar | A172232 | |
| Ribonükleotid Çözelti Karışımı (rNTP'ler) | New England BioLabs | N0466S | |
| Somon testisleri DNA | Sigma-Aldrich | D1626-1G | |
| Yağsız süt tozu | Sigma-Aldrich | 70166-500G | |
| Boyama kabı | Thermo Scientific | ||
| Tetrametiletilendiamin (TEMED) | Bio-Rad | 1610800 | |
| Tris bazı (2-Amino-2- (hidroksimetil) -1,3-propandiol) | Sigma-Aldrich | 93362-500G | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Ara-20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| Üre | Sigma-Aldrich | U6504-1KG | |
| Ksilen siyanol | Alfa Aesar | B21530 |
Kaynaklar
- Berger, M. F., Bulyk, M. L. Protein binding microarrays (PBMs) for rapid, high-throughput characterization of the sequence specificities of DNA binding proteins. Methods in Molecular Biology. 338, 245-260 (2006).
- Berger, M. F., Bulyk, M. L.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
