Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İskemi Reperfüzyon Hasarı Ayarında Metastatik Karaciğer Tümörlerinin Murine Modeli

12.1K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/59748

⸱

30 Ağustos 2019

 , 
1Department of Surgery, University of Pittsburgh

Bu makalede

Özet

Klinik olarak ilgili kolorektal kanser karaciğer metastazları (CRLM) tümör modeli ve karaciğer iskemi reperfüzyonunun (I/R) tümör büyümesi ve metastazdaki etkisini ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Bu model daha iyi karaciğer metastatik büyüme cerrahi kaynaklı promosyon altında yatan mekanizmaları anlamak için yardımcı olabilir.

Özet

Karaciğer iskemi ve reperfüzyon (I / R) yaralanma, ortak bir klinik sorun, birden fazla doku ve organ hasarı neden olduğu gösterilmiştir kaçınılmaz bir patofizyolojik süreç olmaya devam etmektedir. Son gelişmelere ve terapötik yaklaşımlara rağmen, genel morbidite özellikle altta yatan parenkimal anormallikleri olan hastalarda tatmin edici kalmıştır. Agresif kanser büyümesi ve metastaz bağlamında, cerrahi G/R'nin tümör nüksini düzenleyen organizatör olduğundan şüphelenilmektedir. Bu makalede, karaciğer I/R ve kolorektal karaciğer metastazının klinik olarak ilgili bir murine modelini tanımlamayı amaçlamaktadır. Bunu yaparken, karaciğer I/R'nin karaciğer metastazlarını teşvik etme deki etkilerini daha iyi anlamak için rutin araştırma uygulamaları için bu modeli oluşturmada ve mükemmelleştirmede diğer araştırmacılara yardımcı olmayı amaçlıyoruz.

Giriş

Karaciğer metastatik hastalık gelişimi için en yaygın sitelerinden biridir1. Mortalite neredeyse her zaman karaciğerde tümör büyümesi ile ilişkili komplikasyonlar atfedilebilir. Karaciğerde metastatik solid tümörlü hastalarda, cerrahi hastalık kontrolü ve olası bir küratif yaklaşım için önemli bir müdahale olmaya devam etmektedir. Ancak, hastaların büyük çoğunluğu sonuçta tekrarlayan hastalık ile mevcut,ağırlıklı olarak karaciğer2,3. Hepatik cerrahi sırasında intraoperatif kanama yaygındır, genellikle kan transfüzyonu ve kanamakontrolü için vasküler bağlama yöntemleri de dahil olmak üzere farklı teknik yaklaşımlar gerektirir. Ancak bu tür önlemler karaciğer dokusuna hepatik iskemi/reperfüzyona (I/R) neden olur. I/R'nin hepatosellüler fonksiyon üzerindeki yan etkileri iyi belgelenmiştir. Karaciğer I / R hakaret inflamatuar yollar4ile kan akışının restorasyonu sırasında inflamatuar kaskadlar tutuşturur . Sadece karaciğer I / R yaralanma karaciğer yetmezliğine katkıda yok, ama mevcut kanıtlar da I / R yaralanma tümör hücre adezyonu uyarır gösterir, ve metastaz oluşumu ve mevcut mikrometastatik hastalığın büyümesini teşvik5. Biz daha önce cerrahi stres sadece birincil tümörün büyümesine yardımcı olur bağışıklık hücrelerinin aktivasyonu neden olduğunu bildirdin, ama aynı zamanda dolaşım içinde kanser hücrelerini yakalayarak metastaz kolaylaştırır6.

Burada ayrıntılı bir karaciğer metastaz fare tümör modeli kurmak için bir teknik açıklar. Bu modelde, hepatektomiler sırasında klinik olarak mevcut cerrahi strese vekil olarak hareket eden hepatik iskemi reperfüzyon yaralanmasını tetiklemek için bir yöntem de salıyoruz. Kombine kanser enjeksiyonu ve hepatik G/K yöntemleri primer tümör rezeksiyonu geçirmiş hastalarda CRLM gelişimini başarıyla yorumlayabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan protokolleri Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Yönergelerine uyulmaktadır. Herhangi bir cerrahi işlem için kullanılan aletler iyice sterilize edildi.

1. İlk hazırlık

  1. Fare dalak içine kanser hücreleri enjekte etmeden önce, otoklav ve işlem sırasında kullanılacak tüm aletleri sterilize.
  2. Bir ısıtma yastığını, cerrahi eldivenleri, gazlı bezi, makas çiftleri, küçük kelepçeler, damar dilatör, cerrahi koplar ve iğne tutucuyu sterilize edin ve/veya otoklavla.
  3. Splenektomi sonrası ve 2 gün boyunca her 12 saat uygulanacak postoperatif analjezik (0.1 mg/kg buprenorfin) hazırlayın.

2. Hücre kültürü

  1. Mikoplazma ELISA kiti kullanarak kanser hücrelerinin mikoplazma kontaminasyonundan arındığından emin olun.
  2. Murine kolorektal kanser hücrelerinin (MC38) kültürü için 4 °C'de Dulbecco'nun Modifiye Kartal ortamının (DMEM) 500 mL çözeltisini hazırlayın. Kültür ortamı %10 ısı yalıtılmış fetal sığır serumu (FBS), 100 U/mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin, 15 mM HEPES ve 200 mM L-glutamin ile takviye edilmelidir.
  3. Bir DNaAse kültür kanser hücreleri- ve RNAse-freeşişesi (75 cm 2). Hücre kültürünü %5 CO2içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde kuluçkaya yatırın. Sıcaklığı 37 °C'de koruyun.
  4. Çoğalan hücreler %90-100 biraraya geldiklerinde, eski ortama aspire edin, hücreleri 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın ve daha sonra 1x tripsin (%0.25) ile tedavi edin şişeden hücreleri ayırmak için.
  5. Hücreleri 15 mL konik tüpte toplayın ve 700 x g'da 5 dk santrifüj.
  6. Ortam aspirasyon ve tekrarlanan santrifüj ile iki kez 1x PBS ile yıkayın.
  7. Hücreleri trypan mavisi lekesi (%0.4) ile boyanarak hücre canlılığını doğrulamaya devam edin.
  8. Hücreleri 1x PBS'de 1 x 106 hücre/ 100 μL konsantrasyonuna geri alın. Pipet hücreleri iyice herhangi bir kümelenmeleri önlemek için. Enjeksiyondan önce kanser hücrelerini buzda tutun.

3. Tümör hücrelerinin enjekte

  1. 1 mL 25 G (0.5 mm x 16 mm) iğne kullanarak ketamin (150 mg/kg) ve ksilazin (12 mg/kg) intraperitoneal olarak uygulanarak 8-12 haftalık erkek (C57BL6) fareleri anestezik.
  2. Herhangi bir postoperatif enfeksiyonları önlemek için makas kullanarak farelerin karın deri tıraş.
  3. Fareleri manyetik fiksatör geri çekme sistemine yerleştirin. Farelerin bir parmak veya kuyruk çimdikleme tarafından anestezi etkisi tamamen altında olduğunu onaylayın.
  4. İşlem sırasında kuruluk önlemek için gözlere tuzlu damla ekleyin.
  5. Scrub povione-iyot çözeltisi (%7.5) cerrahi bir kesi yapmadan önce cildi dezenfekte etmek için tıraş karın duvarına.
  6. Başlangıçta dişli forseps ile cilt kaldırın ve cerrahi makas yardımı ile bir orta hat kesi yapmak. Daha sonra, yaklaşık 3 cm uzunluğunda bir orta hat kesi oluşturmak için karın kası ve periton kaldırın (karın içeriğini ortaya çıkarmak için ksifoid süreci midabdominal. Yoğun kanamayı önlemek için kesiyi ksifoid işleminin ötesine uzatmamaya dikkat edin.
  7. Hemostatı kesiğin her iki tarafına ve ksifoid prosesin altına yerleştirin. Kuyruğu aşağı doğru çekerek ve bantlayarak karnı uzatın. Ayırmak ve pankreas yağ dokusundan dalak maruz bırakmak için 6-inç steril pamuk ucu aplikatör kullanın.
  8. Dalak içine enjeksiyondan önce, herhangi bir hücre kümeleri önlemek için kanser hücrelerini girdap.
  9. Enjeksiyon için 0,5 mL 28 G (0,36 mm x 13 mm) insülin şırıngası kullanın. Hava kabarcıkları kaçının.
  10. Yavaşça ve dikkatlice dalak ucuna 100 μL hücre enjekte edin. Bir pamuk ucu yerleştirin ve karın bölgesine geri akışını önlemek için hafif basınç ekleyin. Başarılı bir enjeksiyon enjeksiyon sırasında karaciğer renginde değişiklik tespit ederek görülebilir.
  11. Steril bir gazlı bezi 1x PBS ile nemlendirin ve parçalanmış alanın üzerine yerleştirin.
  12. Kanser hücrelerinin sistem içinde dolaşmasını sağlamak için fareleri 15 dakika lığına bir ısıtma yastığına aktarın.
  13. Cerrahi iskemi ve reperfüzyon yaralanması ile devam etmek için, adımları izleyin 5.3-5.10.
    NOT: Bu işlem, Metastatik fokların I/R kaynaklı kurulmasının etkisini incelemektir.

4. Splenektomi

  1. Splenektomi yapmak için, elle tutulan bir kateter cihazı kullanın. Dikkatli bir şekilde pürüzsüz forseps ile dalak kaldırın ve aşırı kanamayı önlemek için dalak kan damarları cauterize. Koterize bölümünde damarları çevirerek dalak çıkarın.
  2. İşlemden hemen sonra, önce kas tabakasını, sonra da deriyi dikerek kesiyi çift katmanlı bir desenle kapatın. Hem karın duvarı hem de cilt için 4-0 polipropilen sütür kullanın.
  3. Başka bir hayvan üzerinde prosedürü tekrarlamadan önce, ya% 70 izopropanol ile püskürtme veya bir boncuk banyosu içine yerleştirerek tüm aletleri dezenfekte.
  4. Fareleri orijinal kafeslere geri yerleştirin ve sıkıntı ve ameliyat sonrası ağrı belirtileri arayın.
  5. Ameliyat sonrası ağrıyı önlemek için 2 gün boyunca her 12 saatte bir ameliyat sonrası analjezik (Buprenorfin 0.1 mg/kg) enjekte edin.

5. İskemi reperfüzyon yaralanması

  1. İlk laparotomiden 5 gün sonra, 1 mL 25 G (0.5 mm x 16 mm) iğne kullanarak ketamin (150 mg/kg) ve ksilazin (12 mg/kg) intraperitoneal olarak uygulayarak fareleri anestezi edin. 3.3-3.4 adımlarını izleyin.
  2. Scrub povione-iyot çözeltisi (%7.5) farenin tıraşkarında cildi dezenfekte etmek ve yukarıda 3.6 adımda açıklandığı gibi orta hat laparotomi yapmak.
  3. İki nemlendirilmiş pamuk uçları kullanarak, yavaşça portal ven de dahil olmak üzere ilişkili yapıları ortaya çıkarmak için kavite bağırsak hareket ettirin. Karaciğer hilumunçevredeki dokulardan arındırılmış olarak inceleyin.
  4. Diyafram karşı ortanca ve sol lateral loblar kaldırın. Portal triad yapısına doğru net bir görüş sağlamak için bir işletim mikroskobu kullanarak bahar makas ile karaciğer hilum keserek sol lateral lob dan quadrate lob ayırın.
  5. Kenetleme için yeterli alan oluşturmak için median lob ve sağ lateral lob arasında küçük bir nemli pamuklu bez yerleştirin. Damar dilatör forsepskullanarak, portal triad kaldırmak için dikkatle 10 cm iplik (4.0 polipropilen sütür) geçmek. Portal triad tüm yapıları okşamak (hepatik arter, portal ven, ve safra kanalı) sol ve medyan karaciğer lobları kilit ile mikro-serrefine kelepçe aplikatör kullanarak mikrovasküler kelepçe yerleştirerek.
  6. Loblar önemli beyazlatma görünmüyorsa, kaldırarak ve yeniden uygulayarak kelepçe yeniden.
    NOT: Eğer kıskaç ı redikten sonra bile karaciğerin hemen beyazlatma meydana gelmezse, G/M ile devam edip etmeyeceğini dikkatlice düşünün.
  7. Ortanca ve sağ lateral loblar arasına yerleştirilen küçük pamuklu bezi çıkarın. Yavaşça karın boşluğuna bağırsak değiştirin. Nemli bir gazlı bez ile karın duvarı kaplayın (1x PBS ile ıslatılmış) ve buharlaştırıcı kaybı en aza indirmek için plastik bir şal ile kaplayın.
  8. Fareyi ısıtma yastığına yerleştirin ve kelepçeyi 60 dk.lık bir süre uygulayın.
  9. Iskemik aralık boyunca, sağ medial ve sol medial ve lateral lobların soluk beyazlatma görselleştirerek iskemi yaralanma kanıt aramak.
  10. 60 dk'lık süre den sonra kelepçeleri çıkararak reperfüzyonu başlatın.
    NOT: Reperfüzyon kanıtları median ve sol lateral lobların hemen renk değişimi ile görülebilir.
  11. Reperfüzyondan hemen sonra, önce kas tabakasını sonra da deriyi dikerek kesiyi çift katmanlı dikiş deseni ile kapatın. Karın duvarı ve cilt kapatmak için bir iğne tutucu yardımı ile 4-0 polipropilen sütür kullanın.
  12. Başka bir hayvan üzerinde prosedürü tekrarlamadan önce, ya% 70 izopropanol ile püskürtme veya ısıtmalı boncuk banyosu içine yerleştirerek tüm aletleri dezenfekte.
  13. Fareleri orijinal kafeslere geri yerleştirin ve sıkıntı ve ameliyat sonrası ağrı belirtileri arayın.
  14. Ameliyat sonrası ağrıları önlemek için 2 gün boyunca her 12 saatte bir ameliyat sonrası analjezik (0.1 mg/kg buprenorfin) enjekte edin.
  15. Karaciğer I / R sahte fareler için, laparotomi gerçekleştirmek, hilum diseksiyonu ve karın sütür.
    NOT: Karaciğer metastazlarının kurulmasını etkileyen cerrahi stresin rolü iki farklı deneysel tasarımla araştırılabilir. Yukarıdaki protokol(Model-1)mikrometastatik karaciğer hastalığını saptamak ve karaciğer I/R'nin büyüme üzerindeki etkisini incelemek için kullanılır (Şekil 1A). Alternatif olarak, karaciğer I/R ve tümör enjeksiyonu aynı anda yapılabilir (Model-2) Yeni metastatik fokların kurulmasında I/R yaralanmasının etkisini incelemek için (Şekil 1B). Bunu yapmak için, yukarıda açıklandığı gibi dalak içine kanser hücreleri enjekte ve onları 15 dakika boyunca sirkülasyon sağlar. 60 dk. Lateral splenektomi 60 dk sonra sirkülasyon döneminden sonra karaciğer I / R veya sahte cerrahi gerçekleştirin, ve sonra laparotomi kesikapatın.

6. İşletilen farelerin değerlendirilmesi

  1. Cerrahi işlem sırasında farelerin palpebral ve kornea refleks testi yaparak evre III anestezietkisi altında olduğundan emin olun. Ek anestezik doz reflekslerin belirtileri üzerine verilmelidir.
  2. Ameliyat sonrası ağrıyı önlemek için ameliyat sonrası analjezik (Buprenorfin 0.1mg/kg) sağ ameliyat tan sonra ve her 12/2 gün süreyle sağlayın.
  3. Anesteziden 30-60 dk. Fareleri sürekli olarak izleyin ve tamamen iyileşene kadar onları gözetimsiz bırakmayın.
  4. Kambur sırt, kapalı gözler, yavaş hareket ve damat başarısızlığı gibi sıkıntı işaretleri arayın. Fareler normal aktivitelerine dönene kadar buna göre davranın.
  5. Sıvılar dahil supplimental bakım, ısı, xylazine için Yohimbin ters ajan, yumuşak kağıt havlu yatak (aspirasyon önlemek için) iyileşme süresini iyileştirmek için ameliyattan sonra sağlanmalıdır.

7. Karaciğer iskemi reperfüzyon uyrağı hasarının değerlendirilmesi

  1. Kelepçeyi uyguladıktan hemen sonra, ortanca ve sol lateral lobların soluk beyazlatmanın kaudate ve quadrate loblara göre oluştuğundan emin olun.
  2. Serum alanin transaminaz (sALT), serum aspartat transaminaz (sAST) ve serum laktat dehidrogenaz (sLDH) düzeylerini ölçerek karaciğer iskemi yaralanmasını değerlendirin. Kan reperfüzyon başladıktan sonra serum 3-6 h ayıklamak için yüz ven çekilebilir. Iskemik lob içindeki yüzde tümör bölgesini analiz etmek için karaciğer histolojisi yapın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Tüm yabani tip (C57BL6) fareler (n = 20) yukarıda açıklanan protokol kullanılarak karaciğer metastaz modeline tabi tutuldu. Iskemi reperfüzyon uyrama yaralanması olan veya olmayan tüm enjekte edilen fareler kurban tarihine kadar hayatta kaldılar. Kanserenjekte edilen karaciğerin şematik diyagramı Şekil 1A, kısmi karaciğer iskemikine neden olan portal triadın (hepatik arter, portal ven ve safra yolu) kenetlenmesine neden olur (p) ortanca ve sol lateral loblara karşı hakaret. Karaciğer metasta...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu el yazmasında açıklanan hayvan modeli iki ana yaklaşıma dayanmaktadır. Birincisi, kanser hücrelerinin karaciğer loblarında lokalize ve çoğalabilir yeteneğini tanımaktır. İkincisi ise tümör büyümesini ve metastazları etkileyen hepatik iskemi reperfüzyon hasarının etkisini incelemektir. Bu model, immünyonidik bir farede sekonder metastaz yokluğunda karaciğer metastazlarının ilgili çalışmasına izin verir. Model metastatik verimlilik sorularını ele yararlıdır, hücre sağkalım ekstravazasyonları ve çoğalması gibi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar bu çalışmaile ilgili çıkar çatışmaları ifşa.

Teşekkürler

Yazarlar sara Minemyer ve Alexander Comerci dilsel revizyon için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Dulbecco'nun Modifiye Kartal OrtaLonza12-614F
Fetal Sığır SerumuLonza900-108
L-GlutaminGibco25030-081
PenisilinFisher bilimsel15-140-122
StretomisinFisher bilimsel15-140-122
HEPESFisher Bilimsel
Tripsin Hidroklonsh30042.02
Hücre kültürü Şişesi 75cm5 Hücreli Yıldız658170
15ml PP Konik TüplerBioExcell41021037
Tripan Mavi LekeGiibco15250-061
Gazlı BezFisherbrand1376152
CautryBovieAA01
Mikrovasküler kelepçeFinescience araçları18055-03
Kilitli Mikro-Serrefine kelepçe aplikatörüGüzel bilim tooslFST-18056-14
Yaylı makasGüzel bilim tooslFST-15021-15
Damar DilatörGüzel bilim tooslFST-00276-13
Manyetik fiksatör Retraksiyon sistemiİnce bilim tooslFST-18200020
Mikro Adson ForsepsGüzel bilim tooslFST-11019-12
Mikro Adson ForsepsGüzel bilim tooslFST-11018-12
4-0 polipropilen sütürEthiconK881H
İğne tutucuHarvard Aparatı72-8826
Isıtma YastığıFisher bilimsel
MakasıOster559A
Povidon-İyot çözeltisiMedlineMDS093945
Şırınga 1ml 25GBD güvenlik Glide305903
İnsülin şırıngası 0.5 mlBD insülin Şırıngaları32946
Pamuk Uçlu AplikatörFisher Scientific23-400-101
Cerrahi MikroskopLeicaLR92240
Mikoplazma Elisa KitiRoche11663925910
KetaminPutney# 056344
KsilazinNADA# 139-236
ALT şeritHeska15809554
AST şeritHeska15809542
LDH şeritHeska15809607
SH30237011443915

Kaynaklar

  1. Riihimäki, M., Hemminki, A., Sundquist, J., Hemminki, K. Patterns of metastasis in colon and rectal cancer. Scientific Reports. 6 (1), 29765(2016).
  2. Oki, E., et al. Recent advances in treatment for colorectal liver metastasis. Annals of gastroenterological surgery. 2 (3), 167-175 (2018).
  3. Wolpin, B. M., Mayer, R. J. Systemic treatment of colorectal cancer. Gastroenterology. 134 (5), 1296-1310 (2008).
  4. van Golen, R. F., Reiniers, M. J., Olthof, P. B., van Gulik, T. M., Heger, M. Sterile inflammation in hepatic ischemia/reperfusion injury: present concepts and potential therapeutics. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 28 (3), 394-400 (2013).
  5. Demicheli, R., Retsky, M. W., Hrushesky, W. J. M., Baum, M., Gukas, I. D. The effects of surgery on tumor growth: a century of investigations. Annals of Oncology. 19 (11), 1821-1828 (2008).
  6. Tohme, S., et al. Neutrophil Extracellular Traps Promote the Development and Progression of Liver Metastases after Surgical Stress. Cancer Research. 76 (6), 1367-1380 (2016).
  7. Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. Orthotopic mouse model of colorectal cancer. Journal of Visualized Experiments. (10), 484(2007).
  8. Elkin, M., Vlodavsky, I. Tail vein assay of cancer metastasis. Current Protocols in Cell Biology. 19 (19.2), (2001).
  9. Thalheimer, A., et al. The intraportal injection model: A practical animal model for hepatic metastases and tumor cell dissemination in human colon cancer. BMC Cancer. 9 (1), 29(2009).
  10. Frampas, E., Maurel, C., Thedrez, P., Le Saëc, P. R. emaud-, Faivre-Chauvet, A., Barbet, J. The intraportal injection model for liver metastasis: Advantages of associated bioluminescence to assess tumor growth and influences on tumor uptake of radiolabeled anti-carcinoembryonic antigen antibody. Nuclear Medicine Communications. 32 (2), 147-154 (2011).
  11. Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
  12. Limani, P., et al. Selective portal vein injection for the design of syngeneic models of liver malignancy. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 310 (9), G682-G688 (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Karaciğer İskemi ReperfüzyonuKolorektal Karaciğer MetastazıPortal Ven KlemplemesiDalak Enjeksiyon TekniğiCerrahi Stresin EtkileriMetastatik Tümör BüyümesiKaraciğer Lob OklüzyonuKanser Hücresi Sirkülasyonu
İskemi Reperfüzyon Hasarı Ayarında Metastatik Karaciğer Tümörlerinin Murine Modeli
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.