Yöntem makalesi

Göreli ışık ve hacim elektron mikroskobu ile mitokondri ve endoplazmik reticulum görüntüleme

13K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/59750

⸱

20 Temmuz 2019

 , 
1Neural Circuits Research Group, Korea Brain Research Institute

Bu makalede

Özet

Genetik modifikasyondan sonra tüm hücrelerde mitokondri ve endoplazmik retiplinin dağılımını incelemek için bir protokol sunuyoruz, askorbat peroksidaz 2 ve horserpu peroksidaz boyama da dahil olmak üzere bağıntılı ışık ve hacim Elektron Mikroskopisi kullanılarak aynı bölümde hedef geni olan ve olmayan hücrelerin seri bölümlemesi ve elektron mikroskobu ile seri görüntüleme.

Özet

Mitokondri ve endoplazmik retikulum (er) gibi hücresel organeller, çeşitli fonksiyonları gerçekleştirmek için bir ağ oluşturur. Bu son derece kavisli yapılar, hücresel koşullara bağlı olarak dinamik bir ağ oluşturmak için çeşitli şekillerde katlanmış. Mitokondri ve ER arasında bu ağın görselleştirme süper çözünürlüklü floresan görüntüleme ve ışık mikroskobu kullanılarak denenmiştir; Ancak, sınırlı çözünürlük mitokondri ve ER arasındaki membranları ayrıntılı olarak gözlemlemek için yeterli değildir. Şanzıman Elektron Mikroskopisi, hücresel organizerin gözlem için iyi membran kontrast ve nanometre ölçekli çözünürlük sağlar; Ancak, son derece eğri organelleri üç boyutlu (3B) yapısını değerlendirirken son derece zaman alıcı. Bu nedenle, mitokondri ve er 'in bağıntılı ışık-elektron mikroskobu (Clem) ve hacim elektron mikroskopi teknikleri ile gelişmiş askorbat peroksidaz 2 ve horserpu peroksidaz boyama kullanılarak morfolojisini gözlemledik. 3B yapıyı gözlemlemek için en blok boyama yöntemi, ultra ince seri sekleme (dizi tomografi) ve hacim elektron mikroskobu uygulandı. Bu protokolde, mitokondri ve ER 'in ayrıntılı yapısal çalışmalarını gerçekleştirmek için CLEM ve 3D elektron mikroskobu kombinasyonunu öneriyoruz.

Giriş

Mitokondri ve endoplazmik retikulum (er) membran bağlı hücresel organellerdir. Onların bağlantı fonksiyonları için gerekli olan ve proteinleri ağ ile ilgili1tanımlanmıştır. Mitokondri ve ER arasındaki mesafe yaklaşık 100 Nm ışık mikroskobu kullanarak bildirilmiştir2; Ancak, son süper çözünürlüklü microskopi3 ve elektron mikroskobu (EM)4 çalışmalar yaklaşık 10-25 Nm, önemli ölçüde daha küçük olduğunu ortaya koydu. Süper çözünürlüklü mikroskopide elde edilen çözünürlük EM 'den daha düşüktür ve özel etiketleme gereklidir. EM, mitokondri ve ER arasındaki bağlantıların yapısal çalışmaları için yeterince yüksek çözünürlüklü kontrast elde etmek için uygun bir tekniktir. Ancak, ince bölümler geleneksel iletim elektron mikroskobu (TEM) için yaklaşık 60 Nm veya daha ince olması gerektiğinden, sınırlı z ekseni bilgileri dezavantajı. Yeterli EM z ekseni görüntüleme için üç boyutlu elektron mikroskobu (3DEM)5kullanılabilir. Ancak, bu tüm hücrelerin ince seri bölümlerin yüzlerce hazırlanması içerir, bu çok zor bir iştir sadece birkaç yetenekli teknolojistler hakim var. Bu ince bölümler, kırılgan formvar film kaplı tek delikli TEM ızgaraları üzerinde toplanır. Film bir gird üzerinde kırarsa, seri görüntüleme ve hacim yeniden yapılanma mümkün değildir. Seri blok-yüz tarama elektron mikroskobu (SBEM) bir elmas bıçak (dik-SBEM) ya da bir odaklı iyon ışın (FıB-SEM) ile Tarama elektron mikroskop (SEM) vakum odası içinde yıkıcı en bloğun bölünmesi kullanan 3DEM için popüler bir tekniktir 6. ancak, bu teknikler tüm tesislerinde mevcut olmadığından, biz dizi tomografi7 seri kesme ve SEM kullanarak öneririz. Dizi tomografi, bir ultralotome kullanılarak kesilmiş seri bölümler bir Tem ızgara yerine bir cam lamel magazini aktarılır ve ışık mikroskobu ve SEM8aracılığıyla görselleştirildi. Backscatter Electron (BSE) görüntülemenin sinyalini geliştirmek için, osmiofilik thiocarbohidazid (TCH)9ile sabit hücreler olan bir en bloklu em boyama protokolüne (OSO4) Çift boyama sonrası katıştırma.

Ayrıca, mitokondriyal Marker SCO1 (sitokrom c oksidaz montaj protein 1) – askorbat peroksidaz 2 (APEX2)10 moleküler etiket em düzeyinde mitokondri görselleştirmek için kullanıldı. APEX2 yaklaşık 28 kDa ve soya askorbat peroksitase11türetilmiştir. Özel proteinlerin EM seviyesinde ayrıntılı yerini, yeşil floresan protein etiketli proteinin ışık mikroskobu içinde kullanıldığı şekilde göstermek için geliştirilmiştir. APEX2, kofaktör hidrojen peroksit (H2O2) varlığında etiketin yerinde çözünebilir bir osmiophic polimer içine 3, 3 '-diaminobenzidine (DAB) dönüştürür. APEX2, tüm hücrenin derinliği boyunca bir protein lokalizasyonu ile EM 'de geleneksel antikor etiketleme alternatifi olarak kullanılabilir. Başka bir deyişle, APEX2-etiketlenmiş protein, Ultra-kriyobölümlemeden sonra immünogeski etiketleme ve geçirgen olmadan spesifik osmikasyon11 ile görselleştirilebilir. Horserpu peroksidaz (HRP) Ayrıca, OsO4ile tedavi EDILDIKTEN sonra em kontrast sağlayan, lokalize bir çökelme Içine DAB H2O2bağımlı polimerizasyonu katalizleyen hassas bir etikettir. ER hedef peptid serisi HRP-KDEL (LYS-ASP-Glu-Leu)12 tüm hücre içinde er görselleştirmek için uygulandı. Genetik etiketlerin kullanılması ve en az osmiyum ve TCH (rOTO yöntemi) ile aynı anda osmikasyon etkisini kullanarak blok boyama ile ilgili protokollerimizi değerlendirmek için, membranı kontrast ile ve rOTO en bloğunda her genetik etiketin kullanmadan karşılaştırdık. Dizi tomografi ve DAB boyama ile APEX ve HRP ile 3DEM, sırasıyla, diğer amaçlar için kullanılmıştır, çünkü biz 3DEM için dizi tomografi ve mitokondri ve ER etiketleme için DAB boyama kombine var bizim protokol benzersizdir. Özellikle, biz hücrelerde genetik modifikasyon etkisini araştırırken destekli aynı bölümde APEX Tagged genleri ile ve olmadan beş hücre gösterdi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. SCO1-APEX2 ve HRP-KDEL Plasmid vektör ile desenli ızgara kültürü çanak ve hücre transfeksiyon ile hücre kültürü

  1. Tohum 1 x 105 HEK293T hücreleri, 35-mm cam ızgara-altta kültür yemekleri içine yerleştirerek% 5 Co2 ' de 37 °c ' de bulunan bir nemlendirici atmosferde, Dulbecco 'nun modifiye kartal Orta (dmem) ile% 10 fetal Sığır serum, 100 U/ml ile tamamlayıcı Penisilin ve 100 U/mL streptomisin.
  2. Hücrelerin tohumlama sonrası gün, onlar% 50-60% konfluency yetiştiği zaman, SCO1-APEX210 ve HRP-kdel12 Plasmid, üreticinin talimatlarına göre transfeksiyon reakajı kullanarak hücrelere tanıtmak (SCO1-APEX2 cDNA 0,5 μg + HRP-KDEL plazmid DNA 0,5 μg başına 3 μL transfeksiyon reaktesi).

2. APEX2 ve HRP için desenli kültür yemekleri ve DAB boyama üzerinde büyüyen hücrelerin ışık mikroskopisi

  1. Transfeksiyondan sonra 16-24 h 'de, tüm kültür medyasını çıkarın ve hemen 250 μL sıcak (30-37 °C) sabitleme çözeltisi (Tablo 1) yumuşak pipetleme ile ekleyin. Hemen sabitleme çözümünü çıkarın ve 1,5 mL taze sabitleme çözeltisi ile değiştirin. 60 dk için buzda inküye ve sonra 1 mL buz-soğuk 0,1 M sodyum cacodylate tampon (Tablo 1) her 10 dakika için üç kez yıkayın.
    DIKKAT: aldehit dumanları son derece zehirlidir. Tüm çalışmaları havalandırmalı bir duman kaputu altında gerçekleştirin.
  2. 1 ml soğuk (0-4 °C) 20 mM gcine solüsyonu ekleyin ve 10 dakika boyunca buzun üzerinde 3 adet 5 dk, 1 mL soğuk 0,1 M sodyum cacodylate tamponunun ardından inküye yapın.
  3. Yeni bir 1x DAB çözümü hazırlayın (3,33 mL 0,3 M cacodylate çözeltisi + 10 μL, 30% H2O2 + 5,67 ml soğuk su + 1 ml 10X DAB çözeltisi).
  4. Taze hazırlanmış 1x DAB çözeltisi (adım 2,3) 500 μL ekleyin ve hafif kahverengi leke ters ışık mikroskobu altında görünür olana kadar yaklaşık 5-45 dakika boyunca buzun üzerinde inküye yapın (Şekil 1a).
  5. DAB çözümünü yavaşça çıkarın ve 1 mL soğuk 0,1 M sodyum cacodylate tamponu ile üç kez durulayın ve her biri 10 dk.
  6. 100 x veya daha yüksek bir büyütmede DAB boyama görselleştirmek için faz kontrast ters mikroskop (veya parlak alan ışık mikroskop) kullanın. İlgi alanı (ROı) bulunduğu bölgenin (Şekil 1B, C) bulunduğu camın alt kısmına işaretlemek için bir işaret kalemi kullanın.

3. EM bloğu için numune hazırlama

  1. 2.1-2.6 adımda açıklandığı gibi hücre kültürünü ve DAB boyama gerçekleştirin.
  2. 1 mL% 2 azaltılmış OsO4 ' ü 4 °c ' de 1 h 'ye kadar olan örnekleri Post-Fix.
    DIKKAT: OsO4 dumanı son derece zehirlidir. Tüm çalışmaları havalandırmalı bir duman kaputu altında gerçekleştirin.
  3. 3,2 adım sırasında yeni TCH çözümü (Tablo 1) hazırlayın ve 0,22-μm filtresine geçin.
    DIKKAT: TCH dumanları son derece zehirlidir. Tüm çalışmaları havalandırmalı bir duman kaputu altında gerçekleştirin.
  4. Oda sıcaklığında (RT) her biri 5 dakika boyunca 1 mL distile su ile sabitleme ve durulama üç kez çıkarın.
  5. Hücreleri, RT 'de 20 dakika boyunca önceden hazırlanmış ve filtrelenmiş TCH çözeltisi 1 mL 'ye yerleştirin.
  6. Hücreleri üç kez 1 mL distile su ile 5 dakika boyunca RT 'de durulayın.
  7. Hücre, RT 'de 30 dakika boyunca damıtılmış suda% 2 osmiyum tetrokid 1 mL 'ye ikinci kez maruz bırakmayın.
  8. Her RT 'de 5 dakika boyunca 1 mL distile su ile sabitleme ve durulama üç kez çıkarın. 1% 1 mL uranyl asetat (sulu) ekleyin ve gece 4 °C ' de karanlıkta bırakın.
  9. Hücreleri üç kez 1 mL distile suda 5 dakika boyunca RT 'de yıkayın.
  10. 60 °C ' de 30 dakika boyunca sıcak Walton 'ın kurşun aspartat çözeltisi (Tablo 1) bir fırında.
  11. Ön ısıtılmış kurşun aspartat çözeltisi 1 mL ekleyerek Walton 'un kurşun aspartat solüsyonu ile hücreleri leke ve daha sonra 60 °C ' de 30 dakika için bir fırında yerleştirin.
  12. Hücreleri üç kez 1 mL distile su ile 5 dakika boyunca RT 'de durulayın.
  13. 2-ml etanol plakaya (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%,% 100) dereceli bir dizi içinde inküat RT 'de 20 dk.
  14. Etanol ve 1 mL 3:1 etanol: düşük viskozite gömme karışımı orta RT olarak 30 dakika boyunca inkük.
  15. Orta çıkarın ve 1 mL 1:1 etanol ekleyin: düşük viskozite gömme karışımı orta. RT 'de 30 dakika boyunca inküye yapın.
  16. Orta çıkarın ve 1 mL 1:3 etanol ekleyin: düşük viskozite gömme karışımı orta. RT 'de 30 dakika boyunca inküye yapın.
  17. Orta kaldırın ve 1 mL 100% düşük viskozite gömme ortam ekleyin ve bir gecede inküye.
  18. Numuneyi 100% düşük viskoziteli gömme karışımıyla katıştırın ve 60 °C ' de 24 saat boyunca inküye yapın.
  19. 90-nm kalın bölümleri ultrayicrotome kullanarak hazırlayın.
  20. 200 kV 'de TEM altında ızgaraya uyun.

4. SEM görüntüleme için ındum-kalay-oksit kaplı coverfon seri sekleme ve montaj

  1. Substrat hazırlama
    1. 30-60 s için izopropanol içinde nazik ajitasyon ile temiz indium-kalay-oksit (ITO) kaplı cam Cover, (22 mm x 22 mm).
    2. Kapağı çıkarın, aşırı isopropanol boşaltın ve kuru kadar tozsuz bir ortamda bırakın.
    3. 1 dakika boyunca bir plazma kaplayıcı kullanarak Ito-kaplamalı cam coverl 'i kızdırma deşarj ile tedavi edin.
      Not: plazma aktivasyonu, substrat yüzeyinde hidrofilik bir özellik oluşturmaktadır. Bu bölüm substrat bağlı olduğunda bölümlerde kırışıklık oluşumu önlemek için substrat su çok ince bir film oluşturur.
    4. ITO-kaplamalı cam kaplamaları, substrat tutucusuna yerleştirin ve bıçak teknesine yerleştirin.
  2. Numune bloğunun ve seri bölümleme, kırpma
    1. Örnek bloğu ultrayicrotome örnek tutucusuna yerleştirin ve kırpma bloğuna ayarlayın.
    2. Hedef pozisyondaki tüm aşırı reçineyi kırpmak için bir jilet kullanın (adım 2,6, Şekil 1D-Golarak tanımlanır). Blok yüzün şekli yamuk veya dikdörtgen olmalıdır. Önde gelen kenar ve sondaki kenar kesinlikle paralel olmalıdır (Şekil 1h, ı).
    3. Örnek tutucuyu ultraticrotomenin kolunun üzerine takın ve elmas bıçağı bıçak tutucusuna yerleştirin. ITO cam kaplamaları şerit taşıyıcısına takın ve taşıyıcıyı kolu (Şekil 1J) ile kelepçeler. Şerit taşıyıcıyı bıçak teknesine ayarlayın ve bıçak teknesini filtrelenmiş damıtılmış suyla doldurun (Şekil 1K).
    4. ITO camının kenarını bıçağa yakın bir şekilde ayarlamak için tutucunun kolunu dikkatlice itmek suretiyle taşıyıcı pozisyonunu bıçağın kaydırağı ile ayarlayın (Şekil 1L).
    5. Bölümü kestikten sonra, kesit sürecini durdurun ve tüpün sıkma vidasını yavaşça açın ve su teknesini (saniyede bir damla su debisi) boşaltın.
    6. Şerit toplama sürecini tamamladıktan sonra, sıkıştırma cihazının kolu ile substrat çıkarın ve şeridini kurutun (Şekil 1m).

5. SEM ve SEM görüntü yığını hizalama görüntüleme

  1. Ito kaplı lamel magazini yapışkan karbon bant ile alüminyum tutucular monte edin. Cam yüzeyini ve yüzeyi yapışkan karbon bant ile mühürleyin ve sonra 10 Nm kalınlığında karbon katmanıyla kat (Şekil 1N).
  2. 5 kV 'lik düşük ivme voltajında bir alan emisyonu SEM 'de Ito kaplı lamel magazini ve verimli bses koleksiyonu için uygun bir çalışma mesafesi gözleyin.
  3. Seri görüntüleri görüntü J yazılımı (Fiji)13 sanal yığın seçeneğini kullanarak alın. Yeni bir TrakEM14açın ve trakem içine görüntü yığını alın. Sağ fare düğmesini tıklatın ve Hizalama menüsünü seçin.
  4. Ardından görüntü aralığını seçin (ilk görüntüden son görüntüye). Otomatik hizalamayı tamamlayın, hizalanmış veri kümesini kaydedin ve seçili görüntü aralığından (ilk görüntüden son görüntüye) düz bir görüntü derlemek için Dışa Aktar 'ı seçin. Son olarak, düz görüntü verilerini görüntü J ana menüsünde AVI formatında kaydedin.
    Not: ek film 1 ve ek film 2 , sırasıyla SEM Image yığınını ve kırpılmış görüntü yığınını göster.

6. seri görüntülerden mitokondri ve ER segmentasyon

  1. IMOD15 yazılım ve açık görüntü dosyalarında 3dmod başlatın.
  2. ZaP penceresinde, orta fare düğmesini kullanarak mitokondri ve ER kontur çizin.
  3. Bölümlere ayrılmış birimi görselleştirmek için model görünümü penceresini açın (ek film 3).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şekil 1 , bu protokol için zamanlama ve iş akışını açıklar. Protokol 7 gün gerektirir; Ancak, SEM görüntüleme için harcanan zamana bağlı olarak, bu artabilir. Hücre transfeksiyon için, hücrelerin konflukans tüm ızgara plaka alt kapak değil olarak kontrol edilmelidir (Şekil 1a). Yüksek hücreli yoğunluk, ışık mikroskobu ve EM gözlem sırasında ilgi hücresinin tanımlanmasını engelleyebilir. Biz APEX2 ve HRP verimli kültür çanak sayısız kültürlü hücreler arasında transfekte hücreleri seçmek i...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

EM kullanarak bir nanometre çözünürlükte belirli proteinlerin hücresel lokalizasyonu belirlenmesi proteinlerin hücresel işlevlerini anlamak için çok önemlidir. Genellikle, EM aracılığıyla bir hedef protein lokalizasyonu incelemek için iki teknikleri vardır. Bir immünogold tekniği, hangi EM 1960 beri kullanılan ve diğer bir teknik son zamanlarda geliştirilen genetik kodlu Etiketler16kullanarak olduğunu. Geleneksel immünogold teknikleri, etiketli protein yerini göstermek için antikor-konjuçe altın p...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Bu araştırma tarafından desteklenmektedir KBRI temel araştırma programı Kore beyin Araştırma Enstitüsü Bakanlığı Bilim ve BIT tarafından finanse (19-BR-01-08), ve Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NRF) Grant Kore hükümeti tarafından finanse (MSIT) (No. 2019R1A2C1010634). SCO1-APEX2 ve HRP-KDEL plazmids, Hyun-Woo Rhee (Seul Ulusal Üniversitesi) tarafından temin edildi. TEM verileri KBRı 'deki Brain Research Core tesisleri 'nde elde edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
GluteraldehitEMS16200Sadece çeker ocakta kullanım
ParaformaldehitEMS19210Sadece çeker ocakta kullanın
Sodyum kakodilatEMS12300
Osmiyum tetroksit %4 sulu çözeltiEMS16320Sadece çeker ocakta kullanın
Epon 812EMS14120EMbed 812- 20 ml/ DDSA- 16 ml/ NMA- 8 ml/ DMP-30 - 0.8 ml
Ultra mikrotom Leica ARTOS 3DLeicaARTOS 3D
Uranil asetatEMS22400Tehlikeli kimyasal
Kurşun sitratEMS17900
35mm Izgaralı lamel çanakMattekP35G-1.5-14-CGRD
Kızdırma boşaltıcıPelcoeasiGlow
Formvar karbon kaplı Bakır IzgaraTed Pella01805-F
Hidroklorik asitSIGMA258148
Fugene HDPromegaE2311
GlisinSIGMAG8898
3,3 & prime; -diaminobenzamidin (DAB)SIGMAD8001Tehlikeli kimyasal
% 30 Hidrojen peroksit çözeltisiMerck107210
Potasyum hekzasiyanoferrat(II) trihidratSIGMAP3289
0.22 um şırınga filtresiSartorius16534
TiyokarbonildihidrazidSIGMA223220Sadece davlumbazda kullanın
Potasyum hidroksitFluka10193426
L-aspartik asitSIGMAA9256
EtanolMerck100983
Transmisyon elektron mikroskobuFEITecnai G2
İndiyum kalay oksit (ITO) kaplı cam lamellerSPI06489-ABkırılgan cam
İzopropanolFisher BiyoreaktiflerBP2618-1
Elmas bıçakLeicaAT-4
Inveted ışık mikroskobuNikonECLipse TS100
Taramalı elektron mikroskobuZeissAuriga

Kaynaklar

  1. Krols, M., et al. Mitochondria-associated membranes as hubs for neurodegeneration. Acta Neuropathologica. 131 (4), 505-523 (2016).
  2. Svendsen, E. J., Pedersen, R., Moen, A., Bjork, I. T. Exploring perspectives on restraint during medical procedures in paediatric care: a qualitative interview study with nurses and physicians. International Journal of Qualitative Studies on Health and Well-being. 12 (1), 1363623(2017).
  3. Shim, S. H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (35), 13978-13983 (2012).
  4. Csordas, G., et al. Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria. The Journal of Cell Biology. 174 (7), 915-921 (2006).
  5. Kremer, A., et al. Developing 3D SEM in a broad biological context. Journal of Microscopy. 259 (2), 80-96 (2015).
  6. Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
  7. Burel, A., et al. A targeted 3D EM and correlative microscopy method using SEM array tomography. Development. 145 (12), (2018).
  8. Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).
  9. Seligman, A. M., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. A new staining method (OTO) for enhancing contrast of lipid--containing membranes and droplets in osmium tetroxide--fixed tissue with osmiophilic thiocarbohydrazide(TCH). The Journal of Cell Biology. 30 (2), 424-432 (1966).
  10. Lee, S. Y., et al. APEX Fingerprinting Reveals the Subcellular Localization of Proteins of Interest. Cell Reports. 15 (8), 1837-1847 (2016).
  11. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
  12. Schikorski, T., Young, S. M., Hu, Y. Horseradish peroxidase cDNA as a marker for electron microscopy in neurons. Journal of Neuroscience Methods. 165 (2), 210-215 (2007).
  13. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  14. Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLOS ONE. 7 (6), 38011(2012).
  15. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
  16. Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLOS Biology. 9 (4), 1001041(2011).
  17. Kijanka, M., et al. A novel immuno-gold labeling protocol for nanobody-based detection of HER2 in breast cancer cells using immuno-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 199 (1), 1-11 (2017).
  18. Ariotti, N., Hall, T. E., Parton, R. G. Correlative light and electron microscopic detection of GFP-labeled proteins using modular APEX. Methods in Cell Biology. 140, 105-121 (2017).
  19. Hua, Y., Laserstein, P., Helmstaedter, M. Large-volume en-bloc staining for electron microscopy-based connectomics. Nature Communications. 6, 7923(2015).
  20. Shu, X., et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. PLOS Biology. 9 (4), 1001041(2011).
  21. Horstmann, H., Vasileva, M., Kuner, T. Photooxidation-Guided Ultrastructural Identification and Analysis of Cells in Neuronal Tissue Labeled with Green Fluorescent Protein. PLOS ONE. 8 (5), 64764(2013).
  22. Martell, J. D., Deerinck, T. J., Lam, S. S., Ellisman, M. H., Ting, A. Y. Electron microscopy using the genetically encoded APEX2 tag in cultured mammalian cells. Nature Protocols. 12 (9), 1792-1816 (2017).
  23. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
  24. Shi, Y., Wang, L., Zhang, J., Zhai, Y., Sun, F. Determining the target protein localization in 3D using the combination of FIB-SEM and APEX2. Biochemistry and Biophysics Reports. 3 (4), 92-99 (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Mitokondri Endoplazmik RetikulumKorelatif I k Elektron MikroskobuGeli tirilmi Askorbat Peroksidaz 2Yaban Turpu Peroksidaz BoyamaEn Bloc Boyama Y ntemiUltrathin Seri KesitlemeDizi TomografisiTransmisyon Elektron MikroskobuTaramal Elektron Mikroskobu

İlgili makaleler