Yöntem makalesi

İnsan Fibromusküler Doku Görselleştirmek için Fosfotungstik Asit Hazırlık ile Mikro X-Ray Bilgisayarlı Tomografi Kullanımı

DOI:

10.3791/59752

⸱

5 Eylül 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy, Yonsei University College of Medicine, 2Department of Anesthesiology and Pain Medicine, Anesthesia and Pain Research Institute, Yonsei University College of Medicine, 3Surgical Anatomy Education Centre at the Yonsei University College of Medicine

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikro X-ışını bilgisayarlı tomografi, hasar görmemiş insan örneklerinden üç boyutlu bilgi elde etmede etkilidir ancak yumuşak dokuları gözlemlemede sınırlı başarıya sahiptir. Fosfotungstik asit kontrast madde kullanımı bu sorunu çözebilir. Biz insan hassas fibromusküler dokuları incelemek için bu kontrast ajan uygulanan (orbicularis istinligament).

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Manuel diseksiyon ve histolojik gözlem insan dokularını araştırmak için kullanılan yaygın yöntemlerdir. Ancak, manuel diseksiyon hassas yapılara zarar verebilir, işleme ve histolojik gözlem kesitsel görüntüleme yoluyla sınırlı bilgi sağlarken. Mikro X-ışını bilgisayarlı tomografi (mikroCT) örneklere zarar vermeden üç boyutlu bilgi elde etmek için etkili bir araçtır. Ancak, yumuşak doku parçaları ayırt sınırlı verimlilik gösterir. Fosfotungstik asit (PTA) gibi kontrast arttırıcı ajanların kullanımı, yumuşak doku kontrastını geliştirerek bu sorunu çözebilir. Yörünge alanında hassas bir yapı olan insan orbicularis istinat ligamentini (ORL) araştırmak için PTA ile mikroCT uyguladık. Bu yöntemde, hasat edilen numuneler formalin olarak sabitlenir, seri etanol çözeltilerinde susuz kalır ve PTA çözeltisi ile boyanmıştır. Boyama sonrası mikroCT taraması, 3Boyutlu rekonstrüksiyon ve analiz yapılır. Cilt, ligamentler ve kaslar bu yöntemle açıkça görselleştirilebilir. Numune boyutu ve boyama süresi yöntemin temel özellikleridir. Uygun numune kalınlığı yaklaşık 5-7 mm idi ve bu işlem yavaşladı ve optimum süre 5-7 gün idi, aşağıda merkezi alanda bir boşluk zaman zaman oluştu. Kesme sırasında küçük parçaların yerini ve yönünü korumak için, her parçanın aynı bölgesinde dikiş önerilir. Ayrıca, her parçanın doğru bir şekilde tanımlanması için anatomik yapının ön analizlerine ihtiyaç vardır. Parafilm kurumasını önlemek için kullanılabilir, ancak numune bozulmasını önlemeye özen verilmelidir. Çok yönlü gözlemimiz, ORL'nin daha önce bildirildiği gibi iplik benzeri lifler yerine sürekli plakalardan oluşan çok katmanlı bir örgüden oluştuğunu göstermiştir. Bu sonuçlar, PTA ile mikroCT taramasının insan dokusunun karmaşık yapıları içindeki belirli bölmeleri incelemek için yararlı olduğunu göstermektedir. Bu kanser dokularının analizlerinde yararlı olabilir, sinir dokuları, ve çeşitli organlar, kalp ve karaciğer gibi.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Manuel diseksiyon ve histolojik gözlem genellikle kaslar ve bağ dokuları gibi insan dokuları incelemek için kullanılır. Ancak, manuel diseksiyon kolayca hassas yapılara zarar verebilir, ve histolojik gözlem düz kesit yüzeyleri hakkında sınırlı bilgi sağlar1,2. Bu nedenle dokuları daha hassas ve verimli bir şekilde incelemek için geliştirilmiş yöntemlere ihtiyaç vardır.

Konvansiyonel bilgisayarlı tomografi (BT) genellikle klinik uygulamada kullanılır, ancak küçük yapıları ayırt etme yeteneğiyoksundur 2,3. Mikro X-ışını CT (microCT) onları yok etmeden, örneklerden küçük yapıların üç boyutlu (3D) bilgi elde etmek için etkili bir araçtır. Ancak, sadece yoğun dokular açıkça görselleştirilebildiği için microCT sınırlı uygulamalara sahiptir; yumuşak dokuları ayırt etmek için kullanılamaz. Bu sınırlamayı aşmak için boyama maddeleri kullanılabilir. Kontrast arttırıcı ajanlar, fosfotungstik asit gibi (PTA), fosfathomolybdic asit, ve Lugol iyot, tarama sırasında yumuşak doku kontrast oranını artırmak4,5. Bu ajanları karşılaştıran çeşitli çalışmalar PTA iyi performans gösterir ve6,7,8işlemek kolaydır öneririz.

Orbicularis istinat ligament (ORL) yörünge etrafında hassas bir yapıdır, hangi kolayca konvansiyonel gözlem sırasında zarar görebilir9. Kontrast madde olarak PTA ile mikroCT kullanarak bu yapıdaki 3Boyutlu bilgileri inceledik ve başarıyla aldık. Bu yöntem, kalp ve karaciğer gibi diğer insan dokuları üzerinde yapılan çalışmalara uygulanabilir, uygun değişiklikler ile10,11,12.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada kullanılan tüm kadavralar yasal olarak Yonsei Üniversitesi Tıp Fakültesi Cerrahi Anatomi Eğitim Merkezi'ne bağışlandı.

1. Numune alma

  1. Örnek hasat için kesme alanını belirtmek için renkli bir kalemle kadavraüzerine bir kesi çizgisi çizin. Çizilen kesi çizgisinin medial kanthus'a, yanal olarak yanal bir kanthusa, alt göz kapağının üstün bir sınırına ve orbital jantın 1 cm altına kadar aşağı bir şekilde uzanıp inferiora uzandığını kontrol edin.
    NOT: Mikro-CT ekipmanının maksimum tarama boyutuna göre numune boyutunu göz önünde bulundurun (ekipmanımız maksimum nesne boyutu7 × 7 cm olan bir görüntü elde edebilir). Burada ORL bölgesinden yaklaşık 1 cm genişliğinde, 3 cm uzunluğunda ve 1,25 g ağırlığında bir numune alındı.
  2. Kesi çizgisini takip eden yüz dokularını bıçakla kesin. Bıçağın ucunun kemiğe değecek kadar derin olduğundan emin olun. Örnek deri, deri altı doku, kas, yağ ve periost içermelidir.
  3. Numuneyi hemen %10 formalin olarak sabitle ve oda sıcaklığında 5-7 gün saklayın(Şekil 1A).
    NOT: Bu çalışmaiçin hem mumyalanmış hem de taze kadavralar kullanılabilir. Ancak kadavralar için fiksasyon çözümü biyolojik bir deneyde kullanılan çözeltiden biraz farklı olabilir. Bu nedenle, mumyalanmış kadavralardan numune alındıktan sonra bile numunenin %10 formalin ile sabitlenmesini öneririz.

2. Boyama için hazırlık

  1. Sabitleme den sonra numuneyi 3 parçaya (5-7 mm kalınlığında) dilimleyin. Bu işlem sırasında her parçanın konumunu ve yönünü kaybetmeyin.
    NOT: Kullandığımız microCT tarayıcı sıc7 cm³ maksimum boyutu kapsayabilir, ancak PTA çözeltisi çok kalın sayılsa bile numuneye başarılı bir şekilde nüfuz edemez.
  2. Numunenin yönü daha sonra kontrol edilebilen bir iğne ve siyah iplik kullanarak her parçanın süperolateral tarafını dikin.
  3. Numuneyi %30, %50 ve %70 etanol çözeltisi halinde 1'er gün boyunca susuz kalın.
  4. Boyama kadar% 70 etanol örnek yerleştirin.

3. PTA hazırlama

  1. MikroCT taraması planlanmadan 1 hafta önce PTA boyama işlemine başlayın.
  2. 210 mL %70 etanol çözeltisi hazırlayın ve 2,1 g PTA gücü ekleyin. 55-60 rpm bir shaker kullanarak iyice karıştırın.
    NOT: PTA çözeltisinin konsantrasyonu etanolde %1 olmalıdır.
  3. Her dilimlenmiş parça için üç adet 70 mL plastik kap hazırlayın. Kapları PTA çözeltisi ile doldurun. Numuneleri kaplara batırın ve etkili penetrasyon için bir çalkalayıcının üzerine yerleştirin. Örnekleri 5-7 gün bekletin (Şekil 1B).
  4. Boyama tamamlandığında, tarama için hazırlamak için% 70 etanol içinde örnek saklayın.
    NOT: Lekeli numuneler aylarca saklanabilir, ancak tam boyama sağlamak için numunelerin mümkün olan en kısa sürede taranması önerilir.

4. MikroCT tarama

  1. Kurutmayı önlemek için numuneyi parafilm ile sarın. Deformasyona yol açabileceğinden örnekleri çok sıkı sarmayın.
  2. Tarayıcıyı açın ve örneği tepsiye yerleştirin (Şekil 2).
  3. Tarama parametrelerini aşağıdaki gibi ayarlayın: kaynak gerilimi (kV) = 70, kaynak akımı (μA) = 114, Al filtresi = 0,5 mm, görüntü piksel boyutu (μm²) = 20, piksel = 2240 × 2240, pozlama (ms) = 500, dönüş adımı (deg) = 0,3.
    NOT: Parametreler kullanılan numunelere ve/veya tarayıcılara göre değiştirilebilir.
  4. Taramaya başla.
    NOT: Tarama, tarayıcının istenilen çözünürlüğe ve hızına bağlı olarak 30 ila 60 dakika sürer.

5. Verilerin yeniden yapılandırılması ve optimizasyonu

  1. Yeniden yapılandırma yazılımını çalıştırın. Taranan dosyaları başlatmak için Eylemler menüsünde Veri Kümesi'ni Aç'ı seçin.
  2. Yeniden Yapılandırma penceresindeayarlar sekmesini seçin. Parametreleri aşağıdaki gibi ayarlayın: Halka yapıları azaltma = 7, Işın sertleştirme düzeltmesi (%) = 40.
    NOT: Parametreler örneğe göre değiştirilebilir.
  3. Başlat sekmesinde Başlat'ı seçerek yeniden yapılandırmaya başlayın. Son veriler belirlenen klasörde depolanır.
  4. Dosya yeniden boyutlandırma yazılımını çalıştırın. Yeniden oluşturulan dosyaları başlatmak için Kaynak veri kümesini seçin.
  5. Hedef veri kümesi sekmesinde jpg'yi seçin.
  6. Hiçbir enterpolasyon (hızlı) Kalite seçeneği ile Yeniden Boyutlandırma seçeneğini 1/2 seçin.
  7. Slayt çubuğunu Resim sıkıştırma sekmesinde 100 (en yüksek) olarak ayarlayın. Dönüştürmeye başlayın.
    NOT: Yeniden boyutlandırma seçeneği, 3B işlendiğinde bilgisayar hızını yavaşlatmamaktır; ancak, kapsamlı olarak yeniden boyutlandırıldığında daha düşük çözünürlükneden olabilir. Daha iyi kullanımla kabul edilebilir çözünürlük için ikiye yeniden boyutlandırmanızı öneririz.

6. 3D rekonstrüksiyon

  1. 3B ses oluşturma yazılımını çalıştırın.
  2. Veri kümesini başlatmak için Eylemler > Yük hacmi verilerini seçin.
  3. Aktarım Fonksiyonu Düzenleyicisi sekmesinde histogramında şekil aktarım işlevini değiştirerek parlaklık ve kontrast düzeyini ayarlayın.
  4. Seçenekler > Aydınlatma'yıseçin.
  5. Gölgeler ve Yüzey Aydınlatma simgelerini seçin. Bu efektler gerçekçi bir modelleme sesi sağlar.
  6. Modeli hareket ettirerek(tıklatıp sürükleyin),döndürerek(sağ tıklatArak ve sürükleyerek)ve(kaydırma)modeli yakınlaştırarak veya kaydırarak en iyi görünümü bulun.
  7. Kesit resimlerini göstermek için düzlemi kaydırın(shift + click and drag in inner direction ( Şekil3).
  8. Işık simgesini açın. Aydınlatma gösterge çubuğunu ayarlayın ve görüntülemek için en iyi aydınlatmayı bulun. Ardından simgeyi kapatın ve Aydınlatma sekmesini kapatın.
  9. Son görüntü için kutuyu gizlemek için Seçenekler > Göster > Kırpma Kutusu'nu seçin.
  10. Görüntüleri depolamak için Eylemler > Görüntüyü kaydet'i seçin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ORL'nin detaylı rekonstrüksiyonu PTA preparatı ile mikroCT ile sağlanmıştır (Şekil 4). Dermis ve periost arasında eğik olarak uzanan bağsel fibromusküler yapı belirgin bir şekilde gözlenmiştir(Şekil 4A). Koronal görünümde(Şekil 4B),liflerin miktarı ve karmaşıklığı yanal olarak artmıştır. Yatay görünümde(Şekil 4C),ağaçlandırmalı bir formasyona sahip ayrıntılı bir örgü çalışması gözlenmiştir. Daha önce bi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan yumuşak dokularının incelenmesinde PTA preparatlı mikroCT uyguladık. Kısaca, numuneler hasat edilir ve birkaç gün formalin sabit, seri etanol çözeltilerinde dehidratasyon takip. Resmiin fiksasyonundan hemen sonra numunenin PTA çözeltisine yerleştirilmesi, hızlı dehidratasyon nedeniyle bazı doku çatlamalarına neden olabilir. Bu nedenle PTA boyamadan önce seri dehidratasyon gereklidir. Daha sonra, örnekler yaklaşık bir hafta boyunca PTA çözeltisi kullanılarak lekelenir. MikroCT taraması, 3D rekonstrüksiyonu ve analiz...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Yonsei Üniversitesi Tıp Fakültesi'nin araştırma bursu (6-2018-0099) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar çok cömertçe Yonsei Üniversitesi Tıp Fakültesi'ne vücutlarını bağışladı insanlara teşekkür ederim. Biz Jun Ho Kim ve Jong Ho Bang onların teknik destek için müteşekkiriz (Cerrahi Anatomi Eğitim Merkezi'nde Cerrahi Anatomi Eğitim Merkezi'nde Personel Tıp Fakültesi). Biz de genoss Co, Ltd yüksek kaliteli microCT tarama sistemi bu araştırmada kullanılan için müteşekkiriz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
12 Tungsto(VI)fosforik asit n-hidrat
Fosfotungstik asit		Junsei84220-0410PTA tozu
CTvoxBrukerver 2.73D keşif yazılımı
NreconBrukerver 1.7.0.4Yeniden yapılandırma yazılımı
SkyscanBruker1173MicroCT tarayıcı
TconvBrukerver 2.0Dosyası yeniden boyutlandırma yazılımı

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nierenberger, M., Remond, Y., Ahzi, S., Choquet, P. Assessing the three-dimensional collagen network in soft tissues using contrast agents and high resolution micro-CT: Application to porcine iliac veins. Comptes Rendus Biologies. 338 (7), 425-433 (2015).
  2. Vymazalová, K., Vargová, L., Zikmund, T., Kaiser, J. The possibilities of studying human embryos and foetuses using micro-CT: a technical note. Anatomical Science International. 92 (2), 299-303 (2017).
  3. Tesařová, M., et al. Use of micro computed-tomography and 3D printing for reverse engineering of mouse embryo nasal capsule. Journal of Instrumentation. 11 (3), 1-11 (2016).
  4. Nemetschek, T., Riedl, H., Jonak, R. Topochemistry of the binding of phosphotungstic acid to collagen. Journal of Molecular Biology. 133 (1), 67-83 (1979).
  5. Rao, R. N., Fallman, P. M., Falls, D. G., Meloan, S. N. A comparative study of PAS-phosphotungstic acid-Diamine Supra Blue FGL and immunological reactions for type I collagen. Histochemistry. 91 (4), 283-289 (1989).
  6. Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9 (11), (2009).
  7. Metscher, B. D. MicroCT for Developmental Biology: A Versatile Tool for High-Contrast 3D Imaging at Histological Resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
  8. Nieminen, H. J., et al. Determining collagen distribution in articular cartilage using contrastenhanced micro-computed tomography. Osteoarthritis Cartilage. 23 (9), 1613-1621 (2015).
  9. Kwon, O. J., Kwon, H., Choi, Y., Cho, T., Yang, H. Three-dimensional structure of the orbicularis retaining ligament: an anatomical study using micro computed tomography. Scientific Reports. 8 (1), 17042(2018).
  10. Dullin, C., et al. μCT of ex-vivo stained mouse hearts and embryos enables a precise match between 3D virtual histology, classical histology and immunochemistry. PLoS One. 12 (2), e0170597(2017).
  11. Zikmund, T., et al. High-contrast differentiation resolution 3D imaging of rodent brain by X-ray computed microtomography. Journal of Instrumentation. 13 (2), 1-12 (2018).
  12. Anderson, R., Maga, A. M. A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with MicroCT using iodine-based contrast. PLoS One. 10 (11), e0142974(2015).
  13. Nieminen, H. J., et al. 3D histopathological grading of osteochondral tissue using contrast-enhanced micro-computed tomography. Osteoarthritis Cartilage. 26 (8), 1118-1126 (2018).
  14. Greef, D. D., Buytaert, J. A. N., Aerts, J. R. M., Hoorebeke, L. V., Dierick, M., Dirckx, J. Details of Human Middle Ear Morphology Based on Micro-CT Imaging of Phosphotungstic Acid Stained Samples. Journal of Morphology. 276 (9), 1025-1046 (2015).
  15. Sutter, S., et al. Contrast-Enhanced Microtomographic Characterisation of Vessels in Native Bone and Engineered Vascularised Grafts Using Ink-Gelatin Perfusion and Phosphotungstic Acid. Contrast Media & Molecular Imaging. 2017, (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Orbicularis Tutucu LigamentYumu ak Doku Kontrast3D Rekonstr ksiyonNumune BoyamaParafilm Korumasok Y nl G zlemDoku G rselle tirme

İlgili makaleler