Burada açıklanan kas kriyokesitlerinde nekrotik miyofiberlerin doğrudan immünolabelling için bir protokoldür. Nekrotik hücreler immünglobulin G (IgG) dahil olmak üzere serum proteinlerine geçirilebilir. Miyofiberler tarafından IgG alımının ortaya çıkması, kas durumuna bakılmaksızın nekroz geçiren miyoliflerin tanımlanmasını ve ölçülmesine olanak sağlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Kas Biyopsilerinde İmmünlabelling Miyofiber Dejenerasyon
Bu makalede
Özet
Özet
Kas liflerinin nekrozu (mionekrozisi) kas distrofileri de dahil olmak üzere çeşitli kas hastalıklarının patogenezinde merkezi bir rol oynar. Kas dejenerasyonu hafifletmek için kas distrofi patogenezi nedenleri ele terapötik seçenekler bekleniyor. Bu nedenle kas biyopsilerinde hücre ölümünün derecesini hesaplamak ve hesaplamak için bir yöntem gereklidir. Yerinde miyofiber dejenerasyongözlemlemek için geleneksel yöntemler ya kötü kantitatif ya da hayati boyaların enjeksiyonu güveniyor. Bu makalede, immünofloresan protokolü, miyolifler tarafından immünglobulin G (IgG) alımını hedefleyerek nekrotik miyoliflerin lekelerinin nekrotik miyokerruz lar olduğu tanımlanmıştır. IgG alım yöntemi nekrotik ölümü karakterize eden hücre özelliklerine dayanır, dahil 1) hasara bağlı moleküler desenlerin salınımı ile plazma membran bütünlüğünün kaybı ve 2) plazmatik proteinlerin alımı. Murine kesitlerinde, miyoliflerin, hücre dışı matriks proteinlerinin ve fare IgG'nin birlikte immünetiketlemesi miyoliflerin nekrotik kaderle temiz ve anlaşılır bir şekilde tanımlanmasını sağlar. Bu basit yöntem kantitatif analiz için uygundur ve insan örnekleri de dahil olmak üzere tüm türler için geçerlidir ve hayati boya enjeksiyonu gerektirmez. IgG alımı ile nekrotik miyofiberlerin boyanması da diğer co-immünlabelling ile eşleşebilir.
Giriş
Striated iskelet kası esas olarak karakteristik gönüllü kontraktil fonksiyon sorumludur kas lifleri (miyofiberler), oluşur. Bu hücreler daralma sırasında meydana gelen mekanik stresi destekleyen çok çekirdekli, post-mitotik yapılardır. Miyofiber membranın yapısal stabilitesi (sarkolemma) ve hücre dışı matriks doku homeostazisi için çok önemlidir. Uydu hücreleri olgun iskelet kası ana kas atası popülasyonunu oluşturur ve sağlıklı kaslarda kin halinde bulunur. Miyofiber ölümden sonra, kas rejenerasyonuydu hücre aktivasyonu içeren bir miyojenik programı takip uydu hücreleri tarafından desteklenir, çoğalma, farklılaşma, ve füzyon sonuçta yeni multinükleli miyofonlar oluşt....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Deneyler Fransız ve Avrupa Topluluğu mevzuatına (lisans numarası 11-00010) uygun olarak yapılmıştır.
1. Tragacanth sakız hazırlama
- Bir cam kabında, 100 mL deiyonize suda 6 g tragacanth tozunu çözün. Folyo ile kaplayın ve en az 3 saat bekletin.
- Tragacanth karışımını bir gece leme 60 °C'de bir su banyosunda veya fırında bırakın. Kurumasını önlemek için kabı dikkatlice kapatın. Aliquoting önce en az bir kez karıştırın.
- Aliquot ve 2 hafta ya kadar 4 °C'de saklayın.
2. Kas toplama
NOT: Bu deney için servikal çıkığı ile 4 haftalık erkek mdx faresi kurban edi....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Miyofiberler lamina içeren hücre dışı bir matrisle çevrilidir. Kırmızı boyama miyofiberlerin çevresini sınırlar ve kimliklerinin belirlenmesini sağlar. IgG yeşil olarak gösterilir. Çekirdekler DAPI ile boyanmış ve mikroskop altında mavi bulunur. Ancak, çekirdekleri burada beyaz olarak gösterilir (Şekil 1). Zayıf bir IgG immünoreaktivite ekstrasellüler bölmesi bekleniyor, hangi inflamasyon durumunda artabilir. Miyofiberler içinde yeşil boyama IgG varlığını yan.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Miyofiber nekrozu normal kaslarda travmatik egzersizin yaygın bir sonucudur. Bu iyi yerel kas atalarının güçlü bir rejeneratif kapasitesi ile telafi edilir. Ancak, MDs gibi çeşitli kas koşullarında, uydu hücrelerinin rejeneratif kapasitesi kronik mionekroz isi ve aşırı fibrozis tarafından tehlikeye. Son bulgular kas liflerinin nekrozun düzenlenmiş bir formu olan nekroz ile ölebileceğini göstermektedir. Daha spesifik olarak, nekroz inhibisyonu DMD tedavisi için yeni bir tedavi stratejisi haline gelebilir.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Bu çalışma Translamuscle programı ile Dernek Française contre les Myopathies tarafından desteklenmiştir. Yazarlar dr Perla Reyes-Fernandez ve Dr Matthew Borok onların el yazması dikkatli okuma için teşekkür ederiz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Dairesel mantar diskler | Piramit İnovasyonu | R30001-E | Dondurulduktan sonra numunenin kimliğinin belirlenebilmesi için mantarı net bir şekilde etiketlemeyi unutmayın |
| Kriyostat | Leica | CM3050 sn34 | Kas kriyoseksiyonu -20 ile -25 °C arasında yapılmalıdır. Kalınlık: 7-10 mikrometre. |
| Dakopen | Dako | S2002 | Kas bölümlerinin etrafında hidrofobik bir bariyer. İnkübasyon sırasında ortamın dağılmasını önler Forseps |
| FST | 91117-10 | / | |
| Keçi anti-Fare IgG (H + L) antikoru, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFischer Scientific | A-11029 | Seyreltme: 1/500 |
| Keçi anti-Tavşan IgG (H + L) antikoru Alexa Fluor Plus 594 | ThermoFischer Scientific | A32740 | Seyreltme: 1/500 |
| Keçi serumu | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | Engelleme adımında, PBS'de %10 seyreltme kullanın. Antikor inkübasyonu için, PBS |
| Isopentan | Sigma Aldrich | 78-78-4 | Dondurma ortamında% 5 seyreltme kullanın. Sıvı nitrojen içine yerleştirilmiş bir beherde soğutulmalıdır. |
| mdx fare | Jackson Laboratuvarı | C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J | Mdx fareleri distrofin geni için mutasyona uğrar. Üç haftalıktan itibaren kaslar kronik dejenerasyon ile karakterizedir |
| Mikroskop | Zeiss | Imager.D1 | / |
| OCT | Hücre yolu | KMA-0100-00A | Gömme matrisi |
| PFA (Paraformaldehit) | ThermoFischer Scientific | 28908 | Kriyoseksiyonu sabitlemek için kullanılır (%2 veya %4 PFA kullanılabilir) |
| PBS | Eurobio | CS3PBS00-01 | Seyreltme ortamı immünoetiketleme |
| Hassas makaslar | FST | fst 14001-12 ve fst 14001-14 | Kas toplama için kullanılır |
| Fare pan-Laminin | Sigma Aldrich | L9393'e | Seyreltme: 1/1000 |
| Tragacanth | Sigma Aldrich | G1128 | Aliquots +4&°C'de tutulacak; Ç |
Kaynaklar
- Carpenter, S., Karpati, G. Duchenne muscular dystrophy: plasma membrane loss initiates muscle cell necrosis unless it is repaired. Brain. 102 (1), 147-161 (1979).
- Cornelio, F., Dones, I.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
