Dairesel RNA'lar üreten muhabir genleri klonlayıp analiz ediyoruz. Bu muhabir genler doğrusal birleştirme analiz etmek ve Alu elemanları içeren yapılar daha büyüktür. Dairesel RNA'ları araştırmak için yapılar hücrelere dönüştürülr ve doğrusal RNA çıkarıldıktan sonra RT-PCR kullanılarak ortaya çıkan RNA analiz edilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Dairesel RNA'ları Analiz Etmek Için Minigen İçeren Alu Elementin Kullanımı
Bu makalede
Özet
Özet
Lineer mRNA'lara ek olarak, birçok ökaryotik gen dairesel RNA'lar üretir. Çoğu dairesel RNA, 5'li bir splice sitesine, bir ön mRNA içinde 3' splice sitesi ile katılarak oluşturulur, bu süreç geri birleştirme olarak adlandırılır. Bu daireselleştirme büyük olasılıkla pre-mRNA ikincil yapılar tarafından desteklenir yakın içine splice siteleri getirmek. İnsan genlerinde, Alu elementleri bu ikincil RNA yapılarını teşvik eder, çünkü Alu elementleri bol miktarda bulunur ve mRNA öncesi zıt yönlerde mevcut olduğunda birbirleriyle baz tamamlayıcılıkları sergilerler. Burada dairesel RNA'lar oluşturan muhabir genleri içeren büyük Alu elementinin üretimini ve analizini tanımlıyoruz. Klonlama protokollerinin optimizasyonu ile 20 kb kesici uç uzunluğuna sahip muhabir genler oluşturulabilir. Ortak transfeksiyon deneylerindeki analizleri düzenleyici faktörlerin tanımlanmasına olanak sağlar. Böylece, bu yöntem dairesel RNA oluşumunda yer alan RNA dizilerini ve hücresel bileşenleri tanımlayabilir.
Giriş
Dairesel RNA'lar
Dairesel RNA'lar (circRNA'lar) kovalent olarak kapalı tek iplikçikli RNA'lar çoğu organizmada ifade edilir. Onlar bir downstream 5 'splice site, bir upstream 3' splice siteye katılarak oluşturulur, bir süreç geri birleştirme denir (Şekil 1A)1. 30-40 nt gibi kısa baz tamamlayıcı sergileyen pre-mRNA dizileri circRNA oluşumu2için uygun hizalama içine geri-splice siteleri getirmek . İnsanlarda, Alu elemanları1,genomunyaklaşık% 11 temsil 3 , kendi kendini tamamlayıcılık nedeniyle pre-mRN....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Yapıların tasarımı
- Dairesel RNA oluşumu için gerekli tekrarlayan elementleri belirlemek ve bunları yapılara dahil etmek için UCSC genomtarayıcısı 24'ü kullanın. Daha da önemlisi, amplifikasyon için astartekrarlayan elemanların dışında olması gerekir.
- Dairesel RNA dizisini(Tamamlayıcı Şekil 1 bir test dizisidir) https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start yapıştırın ve doğru organizmayı seçin. Sırayı gönderin ve tarayıcı görünümüne gidin, 1.5x'i uzaklaştırın veya uygun şekilde uzaklaştırın (Şeki....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Muhabir genleri dairesel RNA oluşumunu etkileyen düzenleyici faktörlerin belirlenmesine olanak sağlar. Ancak, bu muhabir genler büyük tür ve genellikle DNA yapılarını kararsız hale getiren tekrarlayan elementler içerir. Büyük boyutları nedeniyle, genellikle eksonve daha küçük yan intronic parçalar içeren genomik parçaların yükseltilmesi ile elde edilen intronların bazı kısımlarını silmek gerekir. Bu DNA parçaları enzimatik olarak biraraya getirilerek konstrüksiyon enzimleri olmadan yapılmasına izin verilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Genel olarak, dairesel RNA'lar düşükboldur 1, bu da onların fonksiyon ve oluşumunun incelenmesini zorlaştırır. Lineer RNA13benzer , muhabir minigenlerin kullanımı dairesel RNA oluşumunu düzenleyen cis ve trans-etkili faktörlerin belirlenmesini sağlar. Böylece, bu yaklaşım daha da endojen genler kullanılarak test edilebilir hipotezler oluşturur.
En kritik adım muhabir genin tasarımıdır. DNA parçalarının enzimatik montajı ("Gibson klonlama"
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Açıklayacak bir şey yok.
Teşekkürler
Bu çalışma Savunma Bakanlığı DoD hibe AZ180075 tarafından desteklenmiştir. Stefan Stamm teşekkürler Jacqueline Noonan Vakfı. Anna Pawluchin DAAD, Alman akademik değişim programı tarafından desteklenen, Justin R. Welden University of Kentucky Max Steckler Ödülü'nü aldı.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| (PEI) Hydrochloride | Polysciences | 24765-1 | |
| Oluşturucu aracı | NEB | https://nebuilder.neb.com/#!/ | |
| Dark Reader Transilluminator. | Clare Kimyasal Araştırma | ||
| Enzimatik DNA montaj kiti | NEB | E2621S | |
| Jel ve PCR temizleme kiti | Promega | A9282 | |
| Glyco | Blue Thermo Fisher | AM9516 | |
| pcDNA3.1 klonlama sitesi | Çoklu klonlama sitesi | https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf | |
| Polimeraz 1 | NEB | M0491L | Q5 DNA polimeraz |
| Polimeraz 2 | Biorad | 1725310 | Uzun menzilli polimeraz (NEB), iproof (BioRad) |
| Polimeraz 2 | Qiagen | 206402 | Qiagen uzun menzilli polimeraz kiti |
| Ters Transkriptaz | Thermo Fisher | 18080044 | |
| RNA izolasyon kiti | Life Technologies | 12183025 | Ambion by Life Technologies |
| RNAse R | Lucigen | RNR07250 | Epicenter/Lucigen |
| Kararlı yetkin hücreler | NEB | C3040H | NEB kararlı hücreler |
| Standart klonlama bakterileri | NEB | C2988J | NEB5-alpha astar |
| tasarımı için yetkin Web aracı | NEB | https://nebuilder.neb.com/#!/ | |
| Web tabanlı sıcaklık hesaplamaları | NEB | https://tmcalculator.neb.com/#!/main |
Kaynaklar
- Jeck, W. R., et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. 19 (2), 141-157 (2013).
- Zhang, X. O., et al. Complementary sequence-mediated exon circularization. Cell. 159 (1), 134-147 (2014).
- Deininger, P.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
