Burada sunulan nörosferlerin spontan nesil yüksek yoğunluklu kaplama nöronlardan nöral progenitor hücrelerinde zenginleştirilmiş bir protokoldür. Aynı deney sırasında, nöronlar daha düşük yoğunlukta kaplandığında, protokol aynı zamanda uzun süreli birincil sıçan nöron kültürleri ile sonuçlanır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
E14-E16 Sprague Dawley Sıçan Embriyosu İzole Karışık Primer Hipokampal ve Kortikal Nöronlardan Nörosfer Lerin Üretimi
Bu makalede
Özet
Özet
Birincil nöron kültürü nörobilim alanında önemli bir tekniktir. Beyne daha derin mekanik anlayışlar elde etmek için, çeşitli nörobiyoloji çalışmaları için istismar edilebilir sağlam bir in vitro modeli olması esastır. Birincil nöron kültürleri (yani, uzun vadeli hipokampal kültürler) modelleri ile bilim adamları sağlamıştır rağmen, henüz tamamen beyin ağının karmaşıklığını temsil etmez. Bu sınırlamaların ardından, beyin dokusuna daha yakın bir benzerlik taşıyan nörosferler kullanılarak yeni bir model ortaya çıkmıştır. Bu protokol, embriyonik gün 14-16 Sprague Dawley sıçanlarının embriyosundan izole edilmiş karışık kortikal ve hipokampal nöronların yüksek ve düşük yoğunluklarının kaplamasını tanımlar. Bu nörosferler ve uzun vadeli birincil nöron kültürünün üretimi için iki bağımsız platformlar olarak daha fazla çalışma yürütmek için izin verir. Bu süreç son derece basit ve uygun maliyetli, birkaç adım ve reaktifler daha önce nöron kültürü için gerekli kabul en aza indirir gibi. Bu, ulaşılabilen sonuçlarla yapIlebilen ve nöroloji ile ilgili çeşitli çalışmalarda daha fazla kullanılabilen en az gereksinime sahip sağlam bir protokoldür.
Giriş
Beyin nöronal ve non-nöronal hücrelerin karmaşık bir devre olduğunu. Yıllardır, bilim adamları bu karmaşık makine hakkında bilgi edinmeye çalışıyorlar. Bunu yapmak için, nörologlar başlangıçta çeşitli dönüştürülmüş sinir tabanlı hücre hatları soruşturmalar için başvurdu. Ancak, güçlü sinaptik bağlantılar ve uygun akson veya dendritler oluşturmak için bu klonal hücre hatlarıyetersizlik birincil nöron kültürleri1bilimsel ilgi kaymıştır1 ,2. Birincil nöron kültürünün en heyecan verici yönü gözlemlemek ve yaşayan nöronları işlemek için bir fırsat oluştururolmasıdır 3. Ayrıca, nöral doku ile....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Hayvanlarla ilgili tüm deneysel prosedürler CSIR-Indian Institute of Chemical Biology Kurumsal Hayvan Etik Komitesi (IICB/AEC/Meeting/Npr/2018/1) tarafından onaylanmıştır.
1. Reaktif ve ortam hazırlama
- Poli-D-lizin (PDL) çözeltisi: PDL solüsyonları deiyonize suda 0,1 mg/mL konsantrasyonlarda hazırlayın ve kullanıma kadar 4 °C'de saklayın.
- Ayrıştırma ortamı: 1 L steril, filtrelenmiş deiyonize su, ilgili konsantrasyonlarda aşağıdaki bileşenleri birleştirmek: sodyum klorür (8 mg /mL), potasyum klorür (0.4 mg/mL), potasyum fosfat monobasic (0.06 mg/mL), D-glukoz (1 mg/mL), sodyum fosfat dibazisi (0.479 mg/mL) ve 1 M HEPES [4....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu protokolde, iki farklı nöral tarama platformundan değişken hücre kaplama yoğunluklarının elde edildiği basit bir strateji ortaya çıkarılmıştır. Şekil 1A,B yüksek ve düşük yoğunluklu kaplamalı hücrelerde nöronların kaplama 4 saat sonra hücrelerin yapışmasını göstermektedir, sırasıyla. Şekil1'de gösterildiği gibi nöronların uygun yapışmasını gözlemleyerek, kaplama ortamı kuyuların her birinde bakım ortamı ile de.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokol, primer nöronların hücre kaplama yoğunluklarını değiştirerek iki değişken nöronal platformun nasıl elde edildiğini açıklar. Bu basit bir yöntem olmasına rağmen, istenilen sonuçları elde etmek için her adım titizlikle yapılmalıdır. Diğer önceki yöntemler ya uzun vadeli primer nöron kültürleri veya nörosfer kültürleri bildirilmiştir. En birincil nöron kültür protokolleri için hipokampal nöronların kültürdahil 3-5 hafta, ama çoğu başarısız oldu, nöronlar ölmek ve bağlantı kaybı nedeniyle solmaya gibi. Protokolün.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları beyan.
Teşekkürler
CSIR-IICB hayvan tesisine teşekkür ederiz. G. D. teşekkür ICMR, J. K. ve V. G. teşekkür DST Inspire, ve D. M. teşekkür DBT, Hindistan onların burs için. S. G. mali destek sağladığı için Serb (EMR/2015/002230) Hindistan'ı kabul eder.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Anti-GFAP | Abcam | AB7260 | |
| Anti-Nestin | Abcam | AB92391 | |
| Anti-O4 | Millipore | MAB345 | |
| Anti-Tau | Abcam | AB76128 | |
| Anti-Tuj1 | Millipore | MAB1637 | |
| B27 Serum İçermeyen Takviye | Gibco | 17504-044 | |
| Hücre Sayacı | Ömrü teknolojileri | Kontes II FL | |
| CO2 İnkübatörü | Eppendorf | Galaxy 170 R | |
| D-glikoz ve nbsp; | SDFCL | 38450-K05 | |
| Etanol | Merck Kırlangıç 100983 | ||
| Floresan Mikroskobu | Olympus | IX83 Modeli | |
| Formaldehit | Sigma Aldrich | 47608 | |
| GlutaMax-I Takviyesi | Gibco | 35050-061 | |
| GtXMs IgG Fluor | Millipore | AP1814 | |
| GtXMs IgG (H+L) | Millipore | AP124C | |
| HEPES | SRL | 16826 | |
| Hoechst 33258 | Calbiochem | 382061 | |
| At Serumu | HiMedia | RM10674 | |
| Hidroklorik Asit | Rankem | H0100 | |
| Laminer Başlık | BioBase | BBS-V1800 | |
| MEM Eagle' Earle' ile birlikte s BSS | Sigma Aldrich | M-2279 | |
| Mikroskop | Dewinter | Zafer Modeli | |
| Nörobazal Ortam | Gibco | 21103-049 | |
| Plastik Gereçler (24 oyuklu plaka, hücre süzgeçleri ve düşük yapışma plakaları) | BD Falcon | 353047, 352350 ve 3471 | |
| 90 mm Petridish | Himedia | PW001 | |
| Penisilin / Streptomisin ve nbsp; | Gibco | 15140-122 | |
| Poli-D-Lizin | Millipore | A.003.E | |
| Potasyum Klorür | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Potasyum Fosfat Monobazik | Merck | MI6M562401 | |
| Sodyum Klorür | Qualigem | 15918 | |
| Sodyum Fosfat Dibazik | Merck | MI6M562328 | |
| Stereomicrosope | Dewinter | Zoomstar Model | |
| Triton-X 100 | SRL | 2020130 | |
| Tripan Mavisi Çözeltisi | Gibco | 15250-061 | |
| % 0.25 Tripsin-EDTA | Gibco | 25200-072 |
Kaynaklar
- Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. Fixing problems with cell lines. Science. 346 (6216), 1452-1453 (2014).
- Masters, J. R. W. Cell line misidentification: the beginning of the end. Nature Reviews Cancer. 10 (6), 441-448 (2010).
- Banker, G.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
