Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Streptococcus mutans'larda Yüksek Moleküler Kütle Proteininin Saflaştırılması

5.6K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/59804

⸱

14 Eylül 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Translational Research, Tsurumi University School of Dental Medicine, 2Laboratory for Oral Health Science

Bu makalede

Özet

Burada açıklanan Streptococcus mutansbir gen ürün saflaştırma için basit bir yöntemdir. Bu teknik proteinlerin saflaştırılmasında, özellikle membran proteinlerinde ve yüksek moleküler kütle proteinlerinde avantajlı olabilir ve diğer çeşitli bakteri türleri ile birlikte kullanılabilir.

Özet

Bir genin işlevinin açıklanması genellikle ilgi geninin bozulduğunu zinde tip suşların ve suşların fenotipik özelliklerinin karşılaştırılmasını içerir. Gen bozulmasından sonra fonksiyon kaybı, bozulan genin ürününün eksojen eklenmesiyle geri kazanılır. Bu genin işlevini belirlemek için yardımcı olur. Daha önce açıklanan bir yöntem gtfC gen sekteye uğrayan Streptococcus mutans suşu oluşturmayı içerir. Burada, gtfC gen ürününü gen bozulmasından sonra yeni üretilen S. mutans suşundan arındırmak için talepedilmeyen bir yöntem tanımlanmıştır. Bu immobilize metal afinite kromatografi kullanarak gen ürün basit saflaştırma sağlayan ilgi geninin 3 ' sonunda bir polihistidin kodlama dizisi nin eklenmesini içerir. Bu yöntemde genetik modifikasyon için PCR dışında enzimatik reaksiyonlara gerek yoktur. Gen bozulmasından sonra gen ürününün ekolarak restorasyonu, farklı türlere de adapte edilebilen gen fonksiyonunu belirlemek için etkili bir yöntemdir.

Giriş

Bir genin işlevinin analizi genellikle ilgi geninin bozulduğunu suşlar için yabani tip suşların fenotibik özelliklerinin karşılaştırılmasını içerir. Gen bozan suşu üretildikten sonra, gen ürününün eksojen eklenmesi fonksiyonel restorasyona olanak sağlar.

Sonraki restorasyon tahlilleri için gerekli saflaştırılmış gen ürünleri elde etmek için en yaygın yöntem Escherichia coli1heterolog ifade gerçekleştirerek gereğidir. Ancak, membran proteinleri veya yüksek moleküler kütleli proteinlerin ekspresyonu genellikle bu sistemi kullanarak zordur1. Bu gibi durumlarda, hedef protein genellikle doğal olarak gen ürün kaybına yol açabilir adımlar, karmaşık bir dizi yoluyla protein sentezler hücrelerden izole edilir. Bu sorunların üstesinden gelmek için, gen bozulma yöntemi2, PCR tabanlı DNA birleştirme yöntemi3 (belirlenen iki aşamalı füzyon PCR) ve genetik için elektroporasyon aşağıdaki gen ürün arınması için basit bir prosedür geliştirilmiştir Streptococcus mutansdönüşüm . Gen ürününün C-terminusuna bir polihistidin etiketi (His-tag) eklenmesi, immobilize metal afinite kromatografisi (IMAC) ile arınmasını kolaylaştırır.

O-tag-ifade suş izole etmek için, ilgi geninin tüm genomik DNA (bu Onun etiketi ifade gen-bozulmuş suş) bir antibiyotik dirençli marker geni ile değiştirilir. His-tag-ifade gerginlik üretmek için prosedür daha önce açıklandığı gibi bir gen bozulmuş gerginlik üretmek için hemen hemen aynıdır4,5. Bu nedenle, fonksiyonel analiz için seri deney olarak gen bozulması ve gen ürün izolasyonu yöntemleri yapılmalıdır.

Bu çalışmada, bir polihistidin kodlama dizisi gtfC 3 ' sonuna eklenir (GenBank çekirge etiketi SMU_1005) gen, kodlama glukozyltransferase-SI (GTF-SI) S. mutans6. Daha sonra streptokok türlerinde ekspresyon çalışmaları yapıldı. E. coli ile heterolog gtfC ekspresyonuna ulaşmak, gtf-SI'nin yüksek moleküler kütlesi nedeniyle zordur. Bu tür S. mutans His-gtfC olarak adlandırılır. GtfC ve spectinomisin direnç gen kasetinin organizasyonunu gösteren şematik bir illüstrasyon (spcr) yabani tip S. mutanlarda 7 loci (S. mutans WT) ve türevleri Şekil 1. GTF-SI, karojenik dişbiyofilminingelişimine katkıda bulunan bir salgı proteinidir 6. Sakaroz varlığı altında, bir yapışık biyofilm WT S. mutans zorlanma düz bir cam yüzey üzerinde gözlenir ama S. mutans gtfC-bozulmuş suşu (S. mutans ΔgtfC)2,5 . Biyofilm oluşumu rekombinant GTF-SI ekselansları üzerine S. mutans ΔgtfC'de geri yüklenir. Suşu, S. mutans His-gtfC , daha sonra rekombinant GTF-SI üretmek içinkullanılır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Astar tasarımı

  1. S. mutans His-gtfCinşaatı için astar hazırlayın.
    NOT: Bu protokolde kullanılan astar dizileri Tablo 1'degösterilmiştir. S. mutans Üretimi için iki aşamalı füzyon PCR yöntemiHis-gtfC şematik Şekil 2'degösterilmiştir.
    1. Tasarım astarları (gtfC-ters ve spcr-ileri) His-tag kodlama dizisinin eki için, gtfC geni ve spcr (Şekil 2A)arasında müdahale.
      1. GS bağlantı ve His-tag-kodlama dizisini gtfC-reverse ve spcr-forward astarlarına ekleyin, 5' bölgelerdeki 24 taban birbirini tamamlayıcı dır.
        NOT: GS bağlayıcısı ve Onun-tag amino asit dizisi (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-His-His-His-His-His) gen çevirisi yoluyla GTF-SI C-terminus bağlı.
      2. S. mutans WT genomunda gtfC genini hedeflemek için gtfC-ileri astar tasarla >1 kb genin aşağı akışı ve spcr-ters astar, spc r'nin aşağı yakan bölgesini hedeflemek için S. mutans içinde •gtfC. GTFC -forwardve spcr-reverse astarların erimesıcaklığını gtfC-ters ve spcrerime sıcaklıklarıile eşleşecek şekilde ayarlayın - ileri astarlar, sırasıyla.
    2. İkinci PCR(Şekil 2B)için iç içe astar (iç içe dönük ve iç içe dönük-ters) tasarla.
    3. Transformantın genomik DNA'sına özgü tasarım astarları(gtfC-ileri ve koloni-ters)(Şekil 2C; koloni PCR için astarlar kullanılır).
      NOT: Amplicons gtfC ve spcrarasındaki sınır straddle . GTFC-forwardastarı ileri astar olarak uygulanabilir.
    4. S. mutans His-gtfC (Şekil 2C;astarlar tarafından amplifiye PCR ürün DNA dizileme için kullanılır) üretimi son onay için tasarım astar (yukarı-ileri ve aşağı-ters).

2. S. mutanlardan genomik DNA Çıkarma

NOT: Her S. mutans suşu anaerobik koşullarda 37 °C'de beyin kalp infüzyonu (BHI) orta kültüre olmalıdır. S. mutanların mutant suşları •gtfC ve S. mutans His-gtfC BHI 100 μg/mL spectinomycin ile desteklenmektedir.

  1. Streak S. mutans WT ve S. mutans •gtfC ayrı ayrı BHI agar plakaları her üzerine. 37 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın.
  2. S. mutans WT veya S. mutans • sterilize kürdan kullanarakgtfC tek kolonileri seçin ve BHI suyu 1,5 mL içine aşılamak. 37 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın.
    NOT: Koloniler ilk PCR için şablon DNA kaynağı olarak kullanılabilir (adım 3.1).
  3. Her bakteri kültürünün 1 mL'sini 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe aktarın. 15.000 x g1 dakika için kültür santrifüj .
  4. Süpernatant çıkarın ve hücre pelet yeniden askıya almak için Tris-EDTA tampon (pH 8.0) 1 mL ekleyin.
  5. 15.000 x g1 dakika için süspansiyon santrifüj . Supernatant çıkarın. Hücre peletini 50 μL Tris-EDTA tamponunda (pH 8.0) yeniden askıya alın.
  6. Süspansiyonu blok kuvöz kullanarak 95 °C'de 5 dakika ısıtın. Santrifüj süspansiyon için 5 dakika 15.000 x g.
  7. Supernatant'ı yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe aktarın (supernatant ilk PCR için şablon DNA olarak hizmet verecektir).

3. PCR Amplifikasyon

NOT: Tablo 1, Tablo 2ve Tablo 3, sırasıyla PCR astarlarını, reaktifleri ve amplifikasyon döngülerini özetler.

  1. PCR şablonları olarak S. mutanve S. mutans •gtfC genomu kullanarak ilk PCR'yi gerçekleştirin. GTFC geninin aşağı kısmını barındıran bölgeleri ve adım 1.1.1.2'de tanımlanan astarları kullanarak spcr'yi barındıran bölgeleri güçlendirin(Şekil 2A).
  2. Her PCR ürününü %1 agarose jel üzerinde elektrofore edin. Yaklaşık 1.000 bp ve 2.000 bp. Silika membran bazlı jel çıkarma yöntemi kullanarak jellerden parçaları arındırmak için istenilen DNA parçaları excise.
    NOT: PCR9,DNA jel elektroforezi10ve DNA arınması11 için temel prosedürler başka bir yerde ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.
  3. İç içe ve iç içe dönük astarlarla PCR şablonları olarak ilk PCR (yaklaşık equimolar) ürünlerini kullanarak ikinci bir PCR gerçekleştirin(Şekil 2B).
  4. Agarose jel üzerinde PCR karışımının onda biri elektrofore. Yaklaşık 3.000 bp uygun amplicon üretimi onaylayın.
  5. Kalan PCR ürüne çökeltin.
    NOT:     İkinci PCR tarafından üretilen spesifik olmayan amplikonlar homolog rekombinasyona müdahale etmediğinden, PCR ürününün saflaştırılması gerekli değildir.
    1. PCR karışımına çekirdeksiz su ekleyin ve toplam hacmi 100°L'ye getirin ve ardından 0,1 hacim (10°L) 3 M sodyum asetat (pH 5,2) ve 2,5 hacim (250°L) mutlak etanol ekleyin. Karışımı oda sıcaklığında (RT) 10 dakika boyunca karıştırın ve saklayın.
    2. Numuneyi 4 °C'de 15.000 x g'de 20 dk santrifüj edin. Supernatant atın. DNA peletini yıkamak için %70 etanol1 mL ekleyin.
    3. Numuneyi 4 °C'de 15.000 x g'de 5 dk santrifüj edin. Supernatant atın. Hava kuruve 10 μL nükleaz içermeyen su ile DNA pelet eritin.

4. Hücre Dönüşümü

  1. Önceki yayında açıklanan adımları izleyerek ikinci PCR ürün tanıtmak için yetkili S. mutans WT hazırlayın5. Hücreleri -80 °C'de saklayın.
    NOT: Bu deney için, yetkin S. mutans WT hücreleri zaten -80 °C'de S. mutans oluşturmakiçin korunmuştur .
  2. Konsantre ikinci PCR ürününün 5 μL'sini daha önce dondurulmuş buz gibi donmuş 50 μL'lik buz gibi yetkin hücrelerle karıştırın. Elektroporasyon cuvettes içine karışımı ekleyin. Elektroporasyon cihazını kullanarak hücrelere tek bir elektrik darbesi (1,8 kV, 2,5 ms, 600 Ω, 10 μF) verin.
  3. BHI suyu 500 μL hücreleri resuspend. Hemen, spektinomisin içeren BHI agar plakaları üzerine süspansiyon 10-100 μL yayıldı. 37 °C'de 2-6 gün boyunca kolonyalar alınacak kadar büyüyüp, 2-6 gün kuluçkaya yatırın.

5. Genome Rekombinasyon ve Depolama Doğrulama

  1. Rekombinasyon için ekrangtfC ileri ve koloni-ters astar kullanarak koloni PCR gerçekleştirin. Elektroforse bir agarose jel üzerinde her koloni PCR ürün. Yaklaşık 1500 bp'lik DNA parçasını doğrulayın.
  2. Bir steril kürdan ve subculture kullanarak pozitif kolonilerden birini seçin bhi brop spectinomycin içeren 2 mL bir gecede hücreleri.
  3. 0,8 mL bakteri kültürünü 0,8 mL steril %50 gliserol ve -80 °C veya -20 °C'de stokla karıştırın.
  4. Kalan 1 mL hücre süspansiyonunu 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe aktarın. Genomik DNA'yı hücrelerden çıkarmak için 2.3-2.7 adımlarını tekrarlayın.
  5. Bir şablon olarak ileri ve aşağı-ters astarlar ve genomik DNA kullanarak PCR gerçekleştirin. Güçlendirilmiş DNA ürününü jellerden arındırmak için 3.2 adımını tekrarlayın.
  6. Saflaştırılmış amplikontenin DNA dizilimini DNA dizilimi ile belirleyin.
    NOT: S. mutans His-gtfC'nin neslini DNA dizilimi ile doğruladıklarından emin olun.

6. Polihistidin arınması-etiketli GTF-SI

  1. Streak S. bir spectinomycin içeren BHI agar plaka üzerineHis-gtfC mutans. 37 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın.
  2. BHI suyu 3 mL sterilize kürdan ve alt kültür hücreleri kullanarak tek bir koloni pick up. Bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
  3. Spectinomycin olmadan BHI suyu 1 L ile iki konik şişeleri hazırlayın. BHI suyu 1 L içine gece kültürü süspansiyon 1 mL aşılamak. Bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
  4. Amonyum sülfat çökelti ile kültür supernatant konsantre proteinler.
    NOT:     Hedef protein hücre içi ise hücre cisimlerinden ayıklayın. Amonyum sülfat çökeltisi için temel prosedürler başka bir yerdeayrıntılı 12.
    1. 4 °C'de 10.000 x g'de 20 dk için bakteri kültürü süspansiyonuna santrifüj edin. 3 L cam bir kabın içine kültür supernatant kurtarın.
    2. 1.122 g amonyum sülfat ekleyin 2 L supernatant (80% doygunluk) bir manyetik karıştırıcı kullanarak güçlü karıştırma ile. Çökeltinin 4 °C'de 4 saat veya daha fazla süreyle karıştırılarak oluşmasına izin verin.
      NOT: Çökelti oluşumu bir gecede devam edilebilir.
    3. 4 °C'de 20 dk için 15.000 x g amonyum sülfat çökelmiş çözeltiyi santrifüj edin. Süpernatant'ı decant.
    4. Bir spatula ile çökelti toplamak ve 200 mL cam kabıiçine aktarın. Bağlayıcı tamponun 35 mL'lik peletlerini yeniden askıya alın (50 mM NaH2PO4,300 mM NaCl, 5 mM imidazol, pH 8.0).
    5. 4 °C'de, yeniden üretilen selüloz diyaliz tüpü kullanılarak bağlayıcı tamponun 2.500 mL'lik süspansiyonu karıştırarak diyalize karşı diyalize titretin. 2 saat sonra diyaliz solüsyonu değiştirin ve bir gecede diyalize devam edin.
    6. Diyaliz solüsyonunu tekrar değiştirin. Ek bir 2 saat için diyaliz devam edin.
  5. 4 °C'de 10 dakika boyunca 20.000 x g'de diyaliz süspansiyonu santrifüj edin. Emme filtrasyon ekipmanı kullanarak süpernatant'ı bir membran filtreden geçirin. Filtrat'ı 75 cm2'lik bir şişeye aktarın.
  6. Immobilize metal afinite kromatografisi (IMAC) tarafından filtröz süspansiyondan polihistidin etiketli GTF-SI'yi fraksiyone alın.
    1. Ni yüklü IMAC reçine bulamacının 2 mL'sini (yaklaşık 1 mL reçine) çıkış çıkışı silikon bir tüpe monte edilmiş bir kromatografik kolona aktarın. Yerçekimi akışı ile depolama çözeltisi çıkarın.
      DİkKAT: Resenin IMAC boyunca kurumasını izin verme.
    2. Reçine yıkamak için sütuniçine distile su 3 mL ekleyin. Rezorsu dengelemek için bağlama arabelleği 5 mL ekleyin.
    3. Bir Hoffmann çimdik horoz ile akışı kapatın. Bulamaç yapmak için adım 6.5 filtreli süspansiyon 5 mL ekleyin.
    4. Kalan filtreli süspansiyon tüm bulamaç ekleyin. Karışımı 4 °C'de 30 dk hafifçe döndürün.
    5. Karışımı sütuna geri yükleyin. Yerçekimi akışı ile süspansiyon kaldırın. IMAC reçiyi 20 mL bağlayıcı arabellekle yıkayın.
      NOT: Sonraki IMAC boyunca bir Hoffmann çimdik horoz ile yaklaşık 2 mL / dk akış hızı ayarlayın.
    6. Elüsyon tamponunun 20 mL'si (50 mM NaH2PO4,300 mM NaCl, 500 mM imidazol, pH 8.0) rekombinant GTF-SI'yi eleştirmek.
      NOT: Protokol burada duraklatılmış olabilir. Eluat 4 °C'de depolanmalıdır. IMAC reşini yeniden kullanılabilir. IMAC rezorinin talimatlarına bakın.
  7. Elüsyon tamponu depolama tamponu (50 mM fosfat tamponu, pH 6.5) ile değiştirin ve rekombinant GTF-SI çözeltisini santrifüj ultrafiltrasyon ünitesi kullanarak yaklaşık 1 mL'ye yoğunlaştırın. Rekombinant GTF-SI çözeltisini 4 °C'de saklayın.
    NOT: SDS-PAGE13 ve batı lekeleme14 kullanarak polihistidin etiketli GTF-SI arınma doğrulayın bir horseradish peroksidaz-konjuge anti-polihistidin monoklonal antikor kullanarak. CHAPS ilavesi (son konsantrasyon, %0.1) eluent için hedef proteine bağlı olarak, birim nonspesifik adsorpsiyon önlemek için gerekli olabilir.

7. Rekombinant GTF-SI tarafından Fonksiyonel Restorasyon

    Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

    Sonuçlar

    Şekil 3, ilk PCR(Şekil 3A)ve ikinci PCR(Şekil 3B)her bir amplicon boyutunu gösterir. Her amplicon boyutu Tablo 1'deaçıklandığı gibi, öngörülen boyutu ile karşılık gelir. Şekil 4A, ikinci PCR ürünü ile dönüştürülmüş ve spectinomisin içeren BHI agar plakaları üzerine kaplanmış S. mutans kolonilerini göstermektedir. Colony PCR ürünleri daha sonra a...

    Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

    Tartışma

    Astar tasarımı protokolün en kritik adımıdır. GTFC-reverse ve spcr-forward astarlarının dizileri, gtfC'nin 3' son bölgesi nin ve spcr'nin5' uç bölgesinin dizilerine göre otomatik olarak belirlenmiştir. Her astar, 5'bölgelerine bir GS bağlantı layıcısını kodlayan 24 tamamlayıcı temel ve His-tag-kodlama dizisini içerir. Yukarı yayılım bölgelerinde bulunan yerel düzenleyici dizilerin bozulması, 3' sonuna His-tag-kodlama dizilerinin eklenmesiyle önlenebilir. DNA stop ...

    Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

    Açıklamalar

    Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

    Teşekkürler

    Bu çalışma Japonya Bilimi Destekleme Derneği (JSPS) (16K15860 ve 19K10471 ile T. M., 17K12032 to M. I., ve 18K09926 to N. H.) ve SECOM Bilim ve Teknoloji Vakfı (SECOM) (sayı hibe 2018.09.10 No. 10 10) tarafından desteklenmiştir.

    Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

    Malzemeler

    Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
    AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
    Agarozelektroforezi içinNippon GeneticsNE-AG02
    AnaeropackMitsubishi Gas ChemicalA-03Anaerobik kültür sistemi
    Anti-His-Tag monoklonal antikorMBLD291-7HRP konjuge
    BCA protein test kitiThermo Fisher Scientific23227Protein konsantrasyonunun
    ölçülmesiBeyin kalp infüzyon suyuBecton, Dickinson237500Bakteri kültürü ortamı
    CBB R-250Wako031-17922Biyofilm boyama için
    Santrifüj ultrafiltrasyon ünitesiSartoriusVS2032Tampon değişimi ve protein konsantrasyonu
    SantrifüjKubota7780II
    Kromatografik kolonBio-Rad7321010IMAC
    Diyaliz membran kelepçesiFisher marka21-153-100
    Diyaliz tüpüAs One2-316-06
    DNA polimerazTakaraR045AYüksek kaliteli DNA polimeraz
    DNA dizilimiEurofins Genomics
    ECL substratBio-Rad170-5060Batı blot için
    EDTA (0,5 M pH 8,0)Wako311-90075Tris-EDTA tampon hazırlama
    Elektroporasyon küvetiBio-Rad16520860,2 cm boşluk
    ElektroporatörBio-Rad1652100
    EtBr çözeltisiNippon Gene315-90051Agaroz jel elektroforezi için
    Jel bant kesiciNippon GeneticsFG-830
    Jel ekstraksiyon kitiNippon GeneticsFG-91202agaroz jel Görüntüleyiciden DNA ekstraksiyonu
    GE Healthcare29083461SDS-PAGE ve batı blotlama için
    İmidazolWako095-00015Bağlayıcı tampon ve elüsyon tamponu hazırlama
    İnkübatörNippon Medical & Kimyasal AletlerEZ-022Sıcaklık ayarı: 4 &�; C
    KuvözNippon Medikal & Kimyasal AletlerLH-100-RDSSıcaklık ayarı: 37 °C C
    Membran filtreMerck MilliporeJGWP047000.2 &mikro; m çaplı
    MikrosantrifüjKubota3740
    NaClWako191-01665Bağlanma tamponu ve elüsyon tamponu
    NaH2PO4· 2H < > 2 < / sub>OWako192-02815Bağlanma tamponu ve elüsyon tamponu
    NaOHWako198-13765Bağlanma tamponu ve elüsyon tamponunun hazırlanması
    (NH < alt > 4 < / alt >) < alt > 2 < / alt > SO< alt >4< / alt >Wako015-06737Amonyum sülfat çökeltme
    Ni yüklü reçineBio-Rad1560133IMAC için
    PCR primerleriEurofins GenomicsÖzel sipariş
    edilen Protein standardıBio-Rad161-0381SDS-PAGE ve western blotting için
    Solvent filtrasyonaparatı BirFH-1G
    SpektinomisinWako195-11531Antibiyotikler olarak; 100 & mu'da kullanın; g / mL
    Steril şırınga filtresiMerckmilliporeSLGV004SL0.22 &mikro; m çap
    Streptococus mutans Δ gtfCLaboratuvarda stok suşu.gtfC spcr<><>em
    Streptococus mutans UA159Laboratuvarda stok suşu.S. mutans ATCC 700610, Yabani tip suş
    SucroseWako196-00015Biyofilm gelişimi için
    TAE (50 > )Nippon Gene313-90035Agaroz jel elektroforezi için
    Termal döngüleyiciBio-RadPTC-200
    Tris-HCl (1 M, pH 8.0)Wako314-90065Tris-EDTA tampon hazırlama
    jel Agarose için

    Kaynaklar

    1. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).
    2. Murata, T., Ishikawa, M., Shibuya, K., Hanada, N. Method for functional analysis of a gene of interest in Streptococcus mutans: gene disruption followed by purification of a polyhistidine-tagged gene product. Journal of Microbiological Methods. 155, 49-54 (2018).
    3. Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. Biotechniques. 54 (3), 129-133 (2013).
    4. Murata, T., Hanada, N. Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans. FEMS Microbiology Letters. 363 (11), 101(2016).
    5. Murata, T., Okada, A., Matin, K., Hanada, N. Generation of a gene-disrupted Streptococcus mutans strain without gene cloning. Journal of Visualized Experiments. (128), (2017).
    6. Hanada, N., Kuramitsu, H. K. Isolation and characterization of the Streptococcus mutansgtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans. Infection and Immunity. 56 (8), 1999-2005 (1988).
    7. LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 35 (9), 1804-1810 (1991).
    8. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998(2012).
    9. Database, J. S. E. PCR: The Polymerase Chain Reaction. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
    10. Database, J. S. E. DNA Gel Electrophoresis. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
    11. Database, J. S. E. Gel Purification. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
    12. Wingfield, P. T. Protein precipitation using ammonium sulfate. Current Protocols in Protein Science. 84 (1), (2016).
    13. Database, J. S. E. Separating Protein with SDS-PAGE. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
    14. Database, J. S. E. The Western Blot. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
    15. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
    16. Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans. Infection and Immunology. 41 (2), 722-727 (1983).
    17. Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency. Journal of Microbiological Methods. 49 (2), 193-205 (2002).
    18. Ge, X., Xu, P. Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).

    Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

    Yeniden basım ve izinler

    Etiketler

    Gen BozulmasProtein Safla t rmammobilize Metal Afinite KromatografisiAmonyum S lfat kt rmesiSDS PAGEWestern BlotElektroporasyonJel EkstraksiyonuPCR Amplifikasyonu
    Streptococcus mutans'larda Yüksek Moleküler Kütle Proteininin Saflaştırılması
    Bize Ulaşın
    Kütüphaneye Öner

    Gizlilik

    Kullanım Koşulları

    Politikalar

    Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.