Farklılaşmış HepaRG hücrelerinde veziküler steatozu indükleyen ve karakterize etme

Özet

Bu çalışmada, farklılaştırılmış HepaRG hücrelerinde yağ asidi tuz sodyum oleat ile karaciğer veziküler steatozis inducing için ayrıntılı bir protokol tarif ve tutarlı Anti-Stokes dahil lipid birikiminin tespiti ve ölçülmesi için yöntemler istihdam Raman saçılma (CARS) mikroskobu, sitofluorimetrik analiz, yağ kırmızı O boyama, ve qPCR.

Özet

Hepatik steatozis, hepatositlerde trigliserid içeren lipid damlacıkları birikiminden oluşan bir metabolik fonksiyon bozukluğu temsil eder. Aşırı yağ birikimi, alkollü olmayan yağlı karaciğer hastalığına (NAFLD) yol açar, bu da potansiyel olarak geri dönüşümlüdür ve alkol içermeyen steatohepatite (NASH) ve sonunda siroz ve hepatosellüler karsinoma (HCC) içine gelişebilir. Hepatositlerde lipid birikimini NASH 'e ilerlemesiyle bağlayan moleküler mekanizmalar, geri dönüşümsüz karaciğer hasarı, fibrozis, siroz ve hatta HCC hala belirsiz kalır. Bu amaçla, NAFLD 'ye neden olan patolojik süreçleri hafifletmek için birkaç in vitro ve in vivo model geliştirilmiştir. Bu çalışmada, biz yağ asidi tuz sodyum oleat ile tedavi DMSO-diferensiyel hepatik heparg hücrelerinden oluşan karaciğer veziküler yağlanma indüksiyonu için bir hücresel model açıklanmaktadır. Nitekim, sodyum oleat tedavi HepaRG hücreleri sitoplazmada lipid damlacıkları birikir ve steatosis tipik özelliklerini gösterir. Bu in vitro insan modeli, in vivo fareler modellerinin yanı sıra primer insan hepatositlerine değerli bir alternatif oluşturmaktadır. Ayrıca, HepaRG hücrelerinde yağ birikiminin ölçülmesi ve değerlendirilmesi için çeşitli yöntemlerin bir karşılaştırmasını sunuyoruz, yağlı kırmızı O boyama, sitoflorimetrik Bodipy ölçümü, qPCR tarafından metabolik gen ifade analizi ve tutarlı Anti-Stokes Raman saçılma (CARS) mikroskopisi. CARS görüntüleme, Raman spektroskopisinin kimyasal özgüllüğünü, malzeme bilimi uygulamalarında iyi bilinen bir kimyasal analiz tekniğinin, yüksek hızlı, yüksek çözünürlüklü doğrusal olmayan optik mikroskopların avantajlarını, hassas lipid birikimi ve lipid damlacık dinamiklerinin ölçülmesi. Veziküler steatozun indüksiyonu için verimli bir in vitro modelin kurulması, lipid birikiminin ölçülmesi ve karakterize edilmesi için doğru bir yöntemin yanı sıra, NAFLD 'nin erken aşama tanısının gelişimine yol açabilir Moleküler Belirteçlerin tanımlanması ve yeni tedavi stratejilerinin oluşturulması.

Giriş

Hepatik steatozis, trigliserid içeren lipid damlacıkları içinde, karaciğer ağırlığının en az% 5 ' inde intrahepatik yağ birikimi olarak tanımlanır. Uzun süreli hepatik lipid depolama potansiyel olarak geri dönüşümlü bir süreçtir, ancak, karaciğer metabolik disfonksiyon, inflamasyon ve alkol olmayan yağlı karaciğer hastalığı ileri formları yol açabilir (NAFLD), birçok yerinde kronik karaciğer hastalığının baskın nedeni Dünya^1,2. NAFLD daha agresif olmayan alkollü steatohepatite (Nash), hangi sırayla siroz ve, hastaların küçük bir yüzdesi, hepatosellüler karsinoma (HCC)^1,

Protokol

1. Kültür Medya ve Reaktiflerin hazırlanması

1. Proliferating Orta: GlutaMAX, 10% fetal sığır serumu (FBS), 1% penisilin/streptomisin, 5 μg/mL insülin ve 0,5 μM hidrokortizon hemisuccinat ile William 'ın E orta ek.
2. Farklılaşma ortamı: glutamax, 10% FBS, 1% penisilin/streptomisin, 5 μg/ml insülin, 50 μM hidrokortizon hemisüksinat ve% 2 DMSO ile ek William 'ın E orta.
3. Dondurma Orta:% 10 DMSO ile Proliferasyona orta takviyesi.
4. Sodyum oleat: 100 mM konsantrasyonda% 99 metanol içinde çözülür, O/N 'i karıştırın ve-20 °C ' de saklayın.
5. Yağ kırmızı O: bir stok çözüm hazırlamak. Yağ kırmızı O 0,35 g tartım ve 100 mL isopropanol iç....

Sonuçlar

Bu protokol, DMSO-farklılaşmış HepaRG hücrelerinde veziküler steatozis 'i sodyum oleat tedavisinde (Şekil 1A) teşvik etmek ve karakterize etmek için etkili bir yöntem açıklanmaktadır.

HepaRG hücrelerinin farklılaşması.
Farklılaşmaya etkili bir şekilde sebep olmak için proliferasyon hücreleri düşük yoğunlukta (2,5 x 10⁴ hücreler/cm²) çoğalması ortamında tohumlama yapılmalıdır. Düşük yoğunluğa sahip olduğund.......

Tartışma

Bu protokol, heparg hücrelerinin nasıl ayırt edileceği ve sodyum oleat tedavisi ile veziküler yağlanma nasıl uyaracağını açıklar (Şekil 1A). Nitekim, diğer insan hepatosellüler Karsinomu (HCC) hücre hatları ile karşılaştırıldığında, heparg hücre hattı yetişkin insan hepatositlerin özellikleri sergiler, ex vivo yetiştirilmiş primer insan hepatositlere değerli bir alternatif temsil^{13,14 ,1.......}

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Hyclone HyClone Fetal Klon II	GE Sağlık SH30066
William' GlutaMAX ile s E ortamı	Thermofisher	32551087
Penisilin/streptomisin	SIGMA	P4333
İnsülin	SIGMA	I9278
Hidrokortizon hemisüksinat	SIGMA	H2270
DMSO, dimetil sülfoksit	SIGMA	D2438 ve nbsp;
Sodyum Oleat	SIGMA	O7501 ve nbsp;
Metanol	SIGMA	179337
İzopropanol	SIGMA	278475
BODIPY 505/515	Thermofisher	D3921
PBS	Thermofisher	14190-250
Formaldehit çözeltisi	SIGMA	252549
RNAse içermeyen DNAseI	Promega	M198A
Cam tabanlı tabaklar	Willco Wells	GWST-5040
Yağ Kırmızısı çözelti	SIGMA	O625
CellTiter 96 AQueous One Solution	Promega	G3582
q-PCR oligo adı	Sequence
ACACB	CAAGCCGATCACCAAGAGTAAA
ACACB REV	CCCTGAGTTATCAGAGGCTGG&
BETA;-ACTIN FOR	GCACTCTTCCAGCCTTCCT
β-actin REV	AGGTCTTTGCGGATGTCCAC
ALBUMIN FOR	TGCTTGAATGTGCTGATGACAGG
ALBUMIN REV	AAGGCAAGTCAGCAGGCATCTCATC
ALDOB FOR	GCATCTGTCAGCAGAATGGA
ALDOB REV	TAGACAGCAGCCAGGACCTT
APOB FOR	CCTCCGTTTTGGTGGTAGAG
APOB REV	CTCAGCTCATGCAGGGTTA
		APOC3
REV	GGTGCTCCAGTAGTCTCTTTCAG
CPT1A IÇIN	CTCAAGCTCCAGCTGTTGCAG
CYP2E1 IÇIN CYP2E1	TTGAAGCCTCTCGTTGACCC
CYP2E1 REV
	CCTGAACCTTCCAAAGATGGC
IL6
	CGCCGCTAGAGGTGAAATTC
	18S

CPT1A IÇIN CTCAAGCCGTATGTTGAGGCAAAA CTTCATCCAATGGACTGCATAAAT CYP3A4 REV TCCCAAGTATAACACTCTACACAGAA GAPDH FOR TGACAACTTTGGTATCGTGGGGAAGG GAPDH REV AGGGATGATGTTTTTGCGGAATGTT GPAM REV IÇIN CGTGTGGGTTTGCGGAATGTT GPAM REV IL6 REV ACCTCAAACTCCAAAAGACCAGTG ACAGACAACCAACG PDK4 IÇIN ATGCACATCTCGCTCTTGAATAA ACAGACAGGAAACCCAACAC PDK4 REV TGGAGGTGAGAAGGAACATACACG PLIN2 TTGCAGTTGCCAATACCTATGC PLIN2 REV IÇIN AATGAGTTGGAGGGGCTGGGGGGGACATC PLIN4 REV GGTCACCTAAACGAACGAAGTAGC SCD IÇIN TCTAGCTCCTATACCACCACCA SCD REV TCGTCTCCAACTTATCTCCTCC SLC2A1 IÇIN CCAGTCACAACGTCAACCACA PLIN4 18S REV TTGGCAAATGCTTTCGCTC IÇIN REV CCGACTCTCTTCCTTCCTG