Yetişkin insan beyninden serbest yüzen dilim kültürleri hazırlamak için bir protokol sunulmaktadır. Protokol membran ekler kullanarak yaygın olarak kullanılan dilim kültür yönteminin bir varyasyonudur. Bu basit, maliyet-etkin, ve yaşilişkili beyin hastalıkları arkasında nörodejenerasyon mekanizmaları çözmek için amaçlayan kısa vadeli tahliller çalıştırmak için önerilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Yetişkin İnsan Beyninden Kısa Süreli Serbest Kayan Dilim Kültürleri
Bu makalede
Özet
Özet
Organotipik, ya da dilim kültürler, yaygın in vitro işleyen merkezi sinir sisteminin yönlerini modellemek için istihdam edilmiştir. Nörolojide dilim kültürlerin potansiyeline rağmen, bu tür kültürleri hazırlamak için yetişkin sinir dokusu kullanarak çalışmalar hala kıt, özellikle insan deneklerin bu. Yetişkin insan dokusunun dilim kültürleri hazırlamak için kullanımı özellikle insan nöropatolojilerinin anlaşılmasını geliştirmek için çekicidir, çünkü kemirgenden (genellikle yenidoğan) üretilen dilimlerden yoksun olgun insan beyninin tipik benzersiz özelliklerine sahiptirler. sinir dokusu. Bu protokol, kısa süreli, serbest yüzen dilim kültürleri hazırlamak için rezeksiyon beyin cerrahisi ne gönderilen yaşayan insan donörler toplanan beyin dokusu nasıl kullanılacağını açıklar. Bu kültürleri kullanarak biyokimyasal ve hücre biyolojisi denemelerinin sürdürülmesi ve yapılması için prosedürler de sunulmaktadır. Temsili sonuçlar, tipik insan kortikal laminasyonunun 4 gün in vitro (DIV4) sonrasında, ana sinir hücre tiplerinin beklenen varlığıyla dilimler halinde korunduğunu göstermektedir. Ayrıca, DIV4'teki dilimler, bu modelin hücre ölümü tahlillerinde bir platform olarak hizmet etme potansiyelini gösteren, toksik bir uyarıcı (H2O2)ile meydan okunduğunda sağlam hücre ölümü geçirerek devam eder. Bu yöntem, membran kesici uçlar kullanarak yaygın olarak kullanılan protokole daha basit ve uygun maliyetli bir alternatif, esas olarak yaşilişkili beyin hastalıklarının arkasındaki nörodejenerasyon mekanizmalarını çözmeyi amaçlayan kısa süreli tahliller için tavsiye edilir. Son olarak, protokol farmakodirençli temporal lob epilepsisi cerrahisi tedavisine gönderilen hastalardan toplanan kortikal dokunun kullanılmasına ayrılmış olsa da, diğer beyin bölgelerinden/koşullardan toplanan dokunun da benzer serbest yüzen dilim kültürleri üretmek için kaynak olarak kabul edilir.
Giriş
Araştırmada insan örneklerinin kullanımı kesinlikle insan beyin patolojileri çalışma için harika bir seçenektir, ve modern teknikler hasta kaynaklı doku kullanarak sağlam ve etik deney için yeni yollar açmıştır. Yetişkin insan beyninden hazırlanan organotipik/dilim kültürleri gibi yöntemler optogenetik1, elektrofizyoloji2,3,4,5, plastisite gibi paradigmalarda giderek daha fazla kullanılmaktadır. 6,7,8,
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Farmakodirençli temporal lob epilepsisi tedavisi için rezeksiyonlu nöroşirürji uygulanan hastalardan canlı erişkin beyin dokuları elde edilmiştir(Şekil 1A). Tüm prosedürler Ribeirão Preto Tıp Fakültesi Klinikler Hastanesi Etik Komitesi tarafından onaylandı (17578/2015) ve hastalar (veya yasal sorumlu kişi) kabul etti ve bilgilendirilmiş onay şartları imzaladı. Doku koleksiyonu Epilepsi Cerrahisi Merkezi'nde nöroşirürji ekibi tarafından yapıldı (CIREP - Klinikler Hastanesi Ribeirão Preto Tıp Fakültesi, São Paulo Üniversitesi, Brezilya).
1. Malzemelerin sterilizasyonu
NO....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Kültürdilimlerinin kalitesini ve sağlığını değerlendirmek için kritik bir yönü beklenen nöral hücre tipleri, nöronlar ve glial hücrelerin varlığı ve tipik morfolojisidir. İnsan kortikal laminasyontipik mimarisi DIV4 bir dilim gözlendi, nöronal immünetiketleme ile ortaya (Şekil 2D). Buna ek olarak, mikroglia ve astroglia beklenen varlığı(Şekil 2B,C)de gözlendi. Bu sonuçlar doku mimarisinin cerrahi işlem/numune işleme veya in vitr.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Serbest yüzen, kısa süreli dilim kültürleri üretmek için bu protokol yetişkin insan neokortikal dilimleri kültüriçin alternatif bir yöntemdir. Dilim kültürleri için böyle bir protokol optogenetik1,44,45, elektrofizyoloji2,3,4,5 çalışmaları için uygun olabilir , kısa süreli plastisite4.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Bu çalışma FAPESP (Grant 25681-3/2017 to AS), CAPES (Doktora Sonrası Burs PNPD/INCT-HSM'den A.F.'ye ve N.D.M.'ye Doktora Öncesi Burs) ve FAEPA tarafından desteklenmiştir. G.M.A., FAPESP'den (MS 2018/06614-4) yüksek lisans bursuna sahiptir. N.G.C.'nin CNPq Araştırma Bursu'na sahibivar. Bu çalışma için rezeke edilen dokuları bağışlayan hastalara ve ailelerine teşekkür ederiz. Biz ribeirão Preto Tıp Fakültesi Klinik Hastanesi, São Paulo Üniversitesi, sürecin çeşitli aşamalarında yardımcı sakinleri, hemşireler, teknisyenler ve CIREP ekibinin desteğini kabul etmek istiyorum.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 2-Propanol | Merck | 1096341000 | |
| Akrilamid/Bis-Akrilamid, %30 çözelti | Sigma Aldrich | A3449 | |
| Agaroz | Sigma Aldrich | A9539 | |
| Amonyum persülfat | Sigma | A3678-25G | |
| Amfoterisin B | Gibco | 15290-018 | |
| Antikor anti-ERK 2 (tavşan) | Santa Cruz Biyoteknoloji | sc-154 | Seyreltme 1: 1.000 BSA'da% 2.5 |
| Antikor, anti-pERK (fare) | Santa Cruz Biyoteknoloji | sc-7383 | Seyreltme 1: 1.000 BSA'da 2.5% |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| BDNF | Sigma Aldrich | SRP3014 | |
| Sığır Serumu Albümini | Sigma Aldrich | A7906 | |
| Bradford 1x Boya Reaktifi | BioRad | 500-0205 | |
| EDTA | Sigma | T3924 | RIPA tamponunda kullanılır |
| Glikoz | Merck | 108337 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| Hank'in Dengeli Tuzları | Sigma Aldrich | H1387-10X1L | |
| Hepes | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Hidroklorik asit | Merck | 1003171000 | |
| Hidrojen Peroksit (H2O2) | Vetec | 194 | |
| Fare IgG, HRP bağlantılı bütün Ab (fare karşıtı) | GE | NA931-1ML | |
| NaCl | Merck | 1064041000 | RIPA tamponunda kullanılır |
| Neurobazal A | Gibco | 10888-022 | |
| Yağsız kuru süt (Molico) | Nestlé | Membran bloke etmek için kullanılır | |
| PBS Tampon pH 7,2 | Laborclin | 590338 | |
| Penicilin/Streptomisin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| Potasyum Klorür | Merck | 1049361000 | |
| Prime Western Blotting Tespit Reaktifi | GE | RPN2232 | |
| Tavşan IgG, HRP'ye bağlı bütün Ab (tavşan önleyici) | GE | NA934-1ML | |
| RIPA tamponunda kullanılan | SDS | Sigma | L5750 |
| TEMED | GE | 17-1312-01 | |
| Tiazolil Mavi Tetrazolyum Bromür (MTT) | Sigma Aldrich | M5655 | |
| Tris | Sigma | T-1378 | RIPA tamponunda kullanılan |
| Triton x-100 | Sigma | X100 | RIPA tamponunda kullanılan |
| Ultra saf Su | Milliporu | MiliQ su arıtma sisteminden elde edilen steril su | |
| Ekipman ve Malzeme | |||
| 24 kuyulu plakalar | Corning | CL S3526 | Kapaklı Düz Tabanlı |
| Amersham Potran Premium (nitroselüloz membran) | GE | 29047575 | |
| Karbojen Karışımı | Beyaz Martins | % 95 O2,% 5 CO2 | |
| CO2 inkübatörü | New Brunswick Scientific | CO-24 | Dilimlerin inkübasyonu% 5 CO2, 36 & C |
| Mikroplaka Okuyucu | Moleküler Cihazlar | ||
| Mikrotüpler | Greiner | 001608 | 1,5 mL mikrotüp |
| Motorlu havaneli | Kimble Chase | ||
| Plastik kaşık | Tatlı kaşığı büyüklüğü | ||
| Jiletli | Bic | Krom Platin, vibratom ile dilimlemede kullanılır | |
| Neşter Bıçağı | Becton Dickinson (BD) | Sayı 24 | Doku dilimlemek için kullanılır; aynı boyutta veya daha küçük önerilir |
| Süper Yapıştırıcı (Loctite Super Bonder) | Henkel | Kompozisyon: Etilcianoacrilato; 2-Propenoik asit; 6,6'-di-terc-butil-2,2'-metilenodi-p-kresol; homopolimer | |
| Vibratom ve nbsp; | Leica | 14047235612 - VT1000S | |
| İmmünohistokimya için Malzeme/Ekipman Adı | |||
| Antikor anti-NeuN (fare) | Millipore | MAB377 | Fosfat Tampon Antikoru |
| anti-GFAP (fare) | Merck | MAB360 | Seyreltme 1: 1.000 Fosfat Tampon |
| Antikoru anti-Iba1 (tavşan) | Abcam | EPR16588 - ab178846 | Fosfat Tamponunda Seyreltme 1: 2.000 Fosfat Tamponu |
| Biyotinillenmiş anti-fare IgG Antikoru (H + L) | Vektör | BA-9200 | |
| DAB | Sigma Aldrich | D-9015 | |
| Entellan | Merck | 107960 | |
| Ethanol | Merck | 1.00983.1000 | |
| Jelatin | Synth | 00G1002.02.AE | Slaytları kaplamak için kullanılır |
| Microtome | Leica | SM2010R | Donma Aşaması (BFS-10MP, Physiotemp) ile donatılmıştır, -40º'ye ayarlanmıştır; C |
| Normal Eşek Serumu | Jackson İmmüno Araştırması | 017-000-121 | |
| Paraformaldehit | Sigma Aldrich | 158127 | |
| Tavşan IgG, HRP'ye bağlı bütün Ab (tavşan önleyici) | GE | NA934-1ML | |
| Slaytlar (Star Frost) | Knittel Glaser | Jelatin kaplı slaytlar | |
| Sucrose | Vetec | 60REAVET017050 | |
| Vectastain ABC HRP Kiti (Peroksidaz, Standart) | Vektör | PK-4000, Kit Standart | |
| Ksilen | Synth | 01X1001.01.BJ |
Kaynaklar
- Andersson, M., et al. Optogenetic control of human neurons in organotypic brain cultures. Scientific Reports. 6, April issue 1-5 (2016).
- Granholm, A. C., et al. Morphological and electrophy....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
