Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Yetişkin İnsan Beyninden Kısa Süreli Serbest Kayan Dilim Kültürleri

9K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/59845

⸱

5 Kasım 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Immunology, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 2Department of Physiology, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 3Department of Pathology and Forensic Medicine, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 4Department of Anatomy, Institute of Biosciences, São Paulo State University, 5Clinical Hospital at the Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo

Bu makalede

Özet

Yetişkin insan beyninden serbest yüzen dilim kültürleri hazırlamak için bir protokol sunulmaktadır. Protokol membran ekler kullanarak yaygın olarak kullanılan dilim kültür yönteminin bir varyasyonudur. Bu basit, maliyet-etkin, ve yaşilişkili beyin hastalıkları arkasında nörodejenerasyon mekanizmaları çözmek için amaçlayan kısa vadeli tahliller çalıştırmak için önerilir.

Özet

Organotipik, ya da dilim kültürler, yaygın in vitro işleyen merkezi sinir sisteminin yönlerini modellemek için istihdam edilmiştir. Nörolojide dilim kültürlerin potansiyeline rağmen, bu tür kültürleri hazırlamak için yetişkin sinir dokusu kullanarak çalışmalar hala kıt, özellikle insan deneklerin bu. Yetişkin insan dokusunun dilim kültürleri hazırlamak için kullanımı özellikle insan nöropatolojilerinin anlaşılmasını geliştirmek için çekicidir, çünkü kemirgenden (genellikle yenidoğan) üretilen dilimlerden yoksun olgun insan beyninin tipik benzersiz özelliklerine sahiptirler. sinir dokusu. Bu protokol, kısa süreli, serbest yüzen dilim kültürleri hazırlamak için rezeksiyon beyin cerrahisi ne gönderilen yaşayan insan donörler toplanan beyin dokusu nasıl kullanılacağını açıklar. Bu kültürleri kullanarak biyokimyasal ve hücre biyolojisi denemelerinin sürdürülmesi ve yapılması için prosedürler de sunulmaktadır. Temsili sonuçlar, tipik insan kortikal laminasyonunun 4 gün in vitro (DIV4) sonrasında, ana sinir hücre tiplerinin beklenen varlığıyla dilimler halinde korunduğunu göstermektedir. Ayrıca, DIV4'teki dilimler, bu modelin hücre ölümü tahlillerinde bir platform olarak hizmet etme potansiyelini gösteren, toksik bir uyarıcı (H2O2)ile meydan okunduğunda sağlam hücre ölümü geçirerek devam eder. Bu yöntem, membran kesici uçlar kullanarak yaygın olarak kullanılan protokole daha basit ve uygun maliyetli bir alternatif, esas olarak yaşilişkili beyin hastalıklarının arkasındaki nörodejenerasyon mekanizmalarını çözmeyi amaçlayan kısa süreli tahliller için tavsiye edilir. Son olarak, protokol farmakodirençli temporal lob epilepsisi cerrahisi tedavisine gönderilen hastalardan toplanan kortikal dokunun kullanılmasına ayrılmış olsa da, diğer beyin bölgelerinden/koşullardan toplanan dokunun da benzer serbest yüzen dilim kültürleri üretmek için kaynak olarak kabul edilir.

Giriş

Araştırmada insan örneklerinin kullanımı kesinlikle insan beyin patolojileri çalışma için harika bir seçenektir, ve modern teknikler hasta kaynaklı doku kullanarak sağlam ve etik deney için yeni yollar açmıştır. Yetişkin insan beyninden hazırlanan organotipik/dilim kültürleri gibi yöntemler optogenetik1, elektrofizyoloji2,3,4,5, plastisite gibi paradigmalarda giderek daha fazla kullanılmaktadır. 6,7,8,9, nörotoksisite / nörokoruma10,11,12,13, hücre tedavisi14, ilaç tarama15,16,17, genetik ve gen düzenleme12,18,19,20, diğerleri arasında, daha iyi bir strateji olarak yetişkinlik döneminde nörolojik hastalıkların anlaşılması.

İnsan beyin patolojilerinin altında yatan mekanizmaların kavrayışı, çok sayıda denek gerektiren deneysel stratejilere bağlıdır. Buna karşılık, dilim kültürleri söz konusu olduğunda, insan örneklerine erişim hala zor olsa da, tek bir kortikal örnekten 50 dilim emme olasılığı, birden fazla gönüllüyü toplanan doku başına kopya sayısı ve yapılan tahliller21.

Beyin organotipik / dilim kültürleri için çeşitli protokoller tarif edilmiştir, klasik oculo taslakları arasında değişen22,23 silindir tüp24,25,26, yarı geçirgen membranlar arayüzü27,28,29,30, ve serbest yüzen dilimler31,32. Deneysel bir tasarımın özelliklerine bağlı olarak, her tekniğin kendi avantajları ve dezavantajları vardır. Yetişkin insan beyinlerinden kısa vadeli, serbest yüzen dilimler kültürleri bazı durumlarda Stoppini ve ark.27tarafından kullanılan yöntem üzerinde avantajlıdır , eğer in vitro uzun vadeli hücre sağkalım genellikle önemli bir endişe olduğu gerçeğini göz önünde bulundurursak bir kültür yöntemi, birçok deneyde kültürde sadece kısa süreler gereklidir12,31,32,33,34,35. Bu koşullar altında, serbest yüzen kültürlerin kullanımı daha basit ve daha uygun maliyetli olmanın avantajı nı sunar, hem de daha doğru 2-3 hafta boyunca kültürde tutulan dilimleri daha orijinal insan dokusu durumu andıran.

Dilim kültürlerin nörolojik potansiyeline rağmen, bu tür kültürleri hazırlamak için yetişkin sinir dokusu nu kullanan çalışmalar, özellikle insan deneklerinden hala çok azdır. Bu makalede, serbest yüzen dilim kültürleri hazırlamak için rezeke beyin cerrahisi gönderilen yaşayan insan donörlerden toplanan beyin dokusu kullanmak için bir protokol açıklanmaktadır. Bu kültürleri kullanarak biyokimyasal ve hücre biyolojisi denemelerinin sürdürülmesi ve yapılması için prosedürler ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Bu protokol, yetişkinliğe bağlı nöropatolojilerin mekanizmaları üzerinde yapılan araştırmalarda canlılık ve nöronal fonksiyonuanaliz etmek için değerli olduğu kanıtlanmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Farmakodirençli temporal lob epilepsisi tedavisi için rezeksiyonlu nöroşirürji uygulanan hastalardan canlı erişkin beyin dokuları elde edilmiştir(Şekil 1A). Tüm prosedürler Ribeirão Preto Tıp Fakültesi Klinikler Hastanesi Etik Komitesi tarafından onaylandı (17578/2015) ve hastalar (veya yasal sorumlu kişi) kabul etti ve bilgilendirilmiş onay şartları imzaladı. Doku koleksiyonu Epilepsi Cerrahisi Merkezi'nde nöroşirürji ekibi tarafından yapıldı (CIREP - Klinikler Hastanesi Ribeirão Preto Tıp Fakültesi, São Paulo Üniversitesi, Brezilya).

1. Malzemelerin sterilizasyonu

NOT: Tüm malzeme ve çözeltiler kullanılmadan önce sterilize edilmelidir.

  1. Tüm cerrahi aletleri ve vibratom dilimleme malzemelerini (bıçak tutucu, numune diski, tampon tepsi) kuru sterilizasyon fırınında 180 °C'de 4 saat sterilize edin.
  2. Uv veya gama ışınlama ile ısıya duyarlı malzeme veya ekipmanları sterilize edin.
  3. 0,22 m'lik gözenek membranları ile otoklavasyon veya filtrasyon ile ortam ve çözümleri sterilize edin.

2. Çözümlerin hazırlanması

  1. 15-20 mL taşıma çözeltisi hazırlayın: %50 v/v Hanks'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) pH 7.4, doğum sonrası ve erişkin beyin nöronlarının bakımı için %50 v/v bazal ortam(Malzeme Tablosu),10 mM 4-(2-hidroksitil)-1- piperazineeeesülfonik asit (Hepes), 3 mg/mL glukoz ve 33 μg/mL gentamisin.
    NOT: Taşıma çözeltisi numune toplamadan en az 20 dakika önce buzdolabında ve oksijenlendirilmelidir (karbogen gazı ile köpüren).
  2. 300 mL dilimleme çözeltisi (HBSS 10 mM HEPES ve 3 mg/mL glikoz ile desteklenir) hazırlayın ve ilk kristal oluşumu noktasına kadar dondurucuda soğutun.
  3. Kültür ortamının 20 mL'sini hazırlayın: doğum sonrası ve erişkin beyin nöronlarının bakımı için bazal ortam(Malzeme Tablosu) %1 L-glutamin türevi (Malzeme Tablosu), nöral kültür için %2 ek (Tablo Malzemeler), %1 penisilin/streptomisin ve 0.25 g/mL amphotericin B.

3. Dilimleme cihazının kurulması

NOT: Bu protokol, cerrahi odada numune toplamanın lojistiği nedeniyle bir meslektaşının yardımıyla ideal olarak gerçekleştirilmektedir.

  1. Tuz ilave buz bir kova, karbogen karışımı köpüren altında dilimleme çözeltisi dinlenme sağlar (95% O2, 5% CO2) kullanmadan önce en az 20 dakika.
  2. Dilimleme sırasında doku örneğine ek mekanik destek oluşturmak için %3 agarose (yaklaşık 2 cm x 2 cm x 2 cm) bir blok hazırlayın ve vibratom numunediskine yapıştırın (Şekil 1E).
  3. Dilimleme için vibratomu ayarlayın: 200 μm'lik kesit kalınlığı, 100 Hz titreşim frekansı ve 0,5-1,0 mm/s arasında dilimleme hızı.
  4. Vibratom tampon tepsisini vibratom tabanına kilitleyin ve dilimleme çözeltisini ve numuneyi almadan önce ve dilimleme işlemi boyunca buzdolabında tutmak için buz ekleyin.

4. Örnek toplama

NOT: Bu protokolde insan neokortikal dokusu cerrahi odada toplanarak laboratuvara taşınmış.

DİkKAT: İnsan örnekleri ile uğraşırken, Kurum tarafından belirlenen uygun güvenlik protokollerine uyun.

  1. Oluşan taşıma aparatı(Şekil 1C)ayarlayın: taşıma ya gaz çıkışı bağlayan bir silikon boru bağlı gaz çıkışını kontrol eden bir basınç / akı vanasına bağlı karbogen karışımı ile taşınabilir bir gaz silindiri gemi; bir taşıma gemisi, genellikle gaz girişi için delikli kapaklı 50 mL konik santrifüj tüp, taşıma çözeltisi içeren; ve taşıma sırasında numune soğutma için buz.
  2. Numuneyi(Şekil 1B)hemen toplayın ve laboratuvara taşıyın. Numuneyi soğuk taşıma çözeltisi içine batırın (sürekli karbogen karışımı ile kabardır).

5. Dilimleme

  1. Numuneyi dilimleme solüsyonu içeren bir Petri kabına (100 mm x 20 mm) aktarın ve ince cerrahi aletlerle numunede kalan menenjlerin mümkün olduğunca dikkatli bir şekilde çıkarılmasını sağlar(Şekil 1D).
  2. Deneysel tasarımın belirli özelliklerine sahip dilimler üretmek için en iyi numune yönünü seçin ve 24 no'lu neşter bıçağıyla, numune diskine yapıştırılmış taban olacak şekilde düz bir yüzeyi kırpın.
  3. Tek kullanımlık plastik kaşık ve hassas boya fırçaları kullanarak, Petri kabından parça yıkın ve filtre kağıdı kullanarak fazla çözeltiyi kurulayın (kılcal damara göre kurulayın ve doku parçasına kağıtla dokunmaktan kaçının).
  4. Süper yapıştırıcı kullanarak, dokuyu diske sıkıca yapışıp agarose bloğuyla temas edene kadar vibratom numune diskine takın (Şekil 1E).
  5. Vibratom numune diskini (doku düzgün bağlanmış) tüm işlem boyunca köpürmesi gereken dilimleme çözeltisi ile dolu vibratom tampon tepsisine yerleştirin.
  6. Bıçak tutucuyu jilet sıkıca sabitlenmiş olarak yerine kilitleyin.
  7. Dilimleme çözeltisi hem numuneyi hem de bıçağı kapsamalı, ancak daha sonra dilimlemeye başlamalıdır (Şekil 1F).
  8. Numuneyi 200 μm dilimhalinde kesin.
    NOT: Bazı vibratomlar numuneleri otomatik olarak kesse de, süreç sırasında ki yakın gözlem ve dilimleme hızındaki küçük ayarlamalar daha iyi dilimler üretmeye yardımcı olabilir. İlk düzensiz dilimleri atın.
  9. Dilimleme çözeltisi ile tampon tepsiden bir Petri kabına dilimleri aktarın ve gevşek kenarları ve aşırı beyaz mater yaklaşık% 70 korteks/% 30 beyaz madde oranında kırpın.

6. Kültür

NOT: Bu adımı steril ortamda laminar akış dolabında gerçekleştirin.

  1. Her kuyubaşına 600 μL kültür ortamı ekleyin (24 kuyu plakalı) ve dilimleri kaplamadan önce en az 20 dakika 36 °C'de ve %5 CO2'ye kuluçkaya yatırın.
  2. Bir boya fırçası kullanarak her bir dilimde plaka(Şekil 1G).
  3. Plakada kullanılmayan kuyular varsa, 400 μL steril su ile doldurun.
  4. Plakayı 36 °C,%5 CO2'dekuluçkaya yatırın.
    NOT: İlk orta replasman dilimin büyüklüğüne bağlı olarak kaplamadan sonra 8-16 saat arasında yapılmalıdır.
  5. 50 ng/mL beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF) ile daha önce hazırlanmış kültür ortamının ek 10 mL'si.
    NOT: İlk 8-16 h sırasında, bu aşamada orta tüketim hızlandırılır beri, besin yoksunluğu ve asitleşme önlemek için orta 600 μL içinde kuluçkaya yatırılır. Bir sonraki adımdan itibaren, kuyu başına orta hacmi 400 μL'ye ayarlanır.
  6. Her kuyudan 333 μL'lik şartlı ortamı çıkarın ve 133 μL taze BDNF destekli ortam ekleyin.
  7. Her 24 saatte bir, şartlandırılmış ortamın üçte birini taze BDNF destekli ortamla değiştirerek orta replasman işlemini tekrarlayın.

7. Kültürlü dilimlerde sağlık, morfoloji ve fonksiyonun değerlendirilmesi

NOT: Temsili sonuçlarda illüstrasyon amacıyla hücre ölümünü indüklemek için, bazı dilimler oksidatif stres indükleyici H2O2ile 24 saat tedaviye sunulmuştur. 7.1.2 ve 7.1.3 adımları hücre ölümünü tetiklemek için H2O2'nin kullanımını tanımlar.

  1. Hücre canlılığı
    NOT: Sorunlu dilim kültürlerinde nörotoksik/nörokorumayı değerlendirmek için basit ve basit bir yöntem 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium (MTT) tsay36, metabolik aktif hücrelerin yüzdesini ölçen tedavi edilen numunelere göre normal koşullarda.
    1. Laminar akış dolabında, ortamın üçte birini taze orta ile değiştirin.
    2. %30 H2O2 stok çözeltisinden, hedeflenen nihai konsantrasyona (30 mM veya 300 mM) ulaşmak için kuyu başına2O2 hacmi ekleyin.
      NOT: H2O2, zorlu ktan önce taze besin lerin doğru şekilde tedarikini garanti altına almak için ortamın günlük değişiminden sonra eklenmiştir.
    3. Plakayı 36 °C'de 24 saat, %5 CO2'dekuluçkaya yatırın.
      NOT: H2O2 tedavisinden (veya diğer toksik uyarıcılardan) sonra, aşağıdaki adımlar MTT tayini ile hücre canlılığının belirlenmesini tanımlar.
    4. Plakadaki her kuyuya 0,5 mg/mL'lik son konsantrasyona 40 μL MTT çözeltisi ekleyin.
    5. Plakayı 36 °C'de, %5 CO2'de 3 saat kuluçkaya yatırın.
    6. Dilimleri fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın ve mikrotüp aktarın.
    7. Pipetleme yaparak kalan çözeltiyi dikkatlice çıkarın.
    8. Her dilimin kütlesini belirlemek için dilimleri içeren mikrotüpleri tartın (bu, elde edilen emici okumaları normalleştirmek için anahtardır).
      NOT: Gerekirse numuneler daha sonra işlenmesi için bu aşamada dondurulabilir (-20 °C).
    9. Motorlu bir zararlı madde kullanarak dilimleri 200 μL'lik isopropanol/HCl'de homojenize edin.
    10. 2 dk oda sıcaklığında santrifüj (RT) 2600 x g.
    11. Supernatant toplamak ve 540 nm emici ölçmek.
  2. KCl'ye bağlı nöronal depolarizasyon
    NOT: Mitojen aktive protein kilaz (MAPK) sinyalçağlayan protein ERK, batı bloting takip fosforilasyon, KCl indüklenen depolarizasyon nöronal yanıtın sayısallaştırılması için kullanılabilir37 .
    1. Akış kabininde, kültür ortamını daha önce 36 °C'ye denk gelen HBSS'nin 300 μL'si ile değiştirin.
    2. HBSS'yi daha önce 36 °C'ye denk gelen 300 μL taze HBSS ile değiştirin.
    3. Plakayı 36 °C'de, %5 CO2'yi 15 dakika kuluçkaya yatırın.
    4. HBSS'yi taze HBSS veya 80 mM KCl depolarizasyon çözeltisi (her ikisi de 36 °C' de) ve 36 °C' de %5 CO2 ile 15 dakika boyunca inkübünle değiştirin.
    5. Dilimleri plakadan mikrotüplere aktarın. Bu adımda, dilimler daha sonra işlenmesi için -20 °C'de saklanabilir.
    6. 150 μL radyoimmünopreyağış (RIPA) tampon (50 mM Tris-HCl; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; %1 noniyonik yüzey aktif madde; %0.1 sodyum dodecil sülfat; pH 7.5) şeklinde doku ekstrelerini hazırlayın. 16000 x g'da10 dk için 4 °C'de santrifüj özleri supernatant toplar ve Bradford yöntemini kullanarak toplam protein konsantrasyonu belirler.
    7. %12 sodyum dodecyl sülfat poliakrilamid jel elektroforezine (SDS-PAGE) toplam proteinin 30 g'ını yükleyin.
    8. Elektroforezden sonra jel içeriğini nitroselüloz membrana aktarın.
    9. TBS artı% 0.1 Tween% 5 yağsız kuru süt ile membran bloke sonra, fare anti-pERK ile kuluçka anti-pERK (1:1,000) için 16 saat için 4 °C. Yıkandıktan sonra, tavşan anti-ERKile RT'de 2 saat kuluçkaya yatırın ve (1:1,000).
    10. 1 saat için RT uygun HRP konjuge ikincil antikor ile kuluçka.
    11. Tercih edilen HRP substratı ile ortaya çıkarın.
  3. Morfolojik değerlendirme
    NOT: Hücre sağkalım ve fonksiyonel değerlendirmelere ek olarak doku morfolojisini analiz etmek önemlidir. Kültürlü dilimrezeksiyon morfolojik analiz için mümkün olduğunca çok yüksek kaliteli malzeme üretmek için önemli bir adım olduğunu unutmayın.
    1. Dilimlerin sabitlenmesi, kriyokoruma ve rezeksiyonu
      1. Kültür ortamına sahip kuyulardan dilimleri PBS içeren yeni bir 24 kuyu plakasına aktarın.
      2. PBS çıkarın ve% 4 paraformaldehit (PFA) 1 mL ekleyin. PfA eklemeden önce dilimlerin düz tutulması önemlidir. Gece boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
      3. PfA çözeltisini dikkatlice çıkarın ve 1 mL %30 sakaroz çözeltisi ekleyin. 4 °C'de 48 saat kuluçka.
      4. Dondurucu mikrotomu -40 °C'ye ayarlayın.
      5. Dilimlerin yerleştirilmeleri gereken mikrotom aşamasında bir sakaroz tabanı hazırlayın(Şekil 2A). Tamamen dondurun ve dikkatlice dilim yerleştirilecek düz bir yüzey üretmek için dondurulmuş sakaroz bazı kesti.
      6. Gerilmiş plastik film üzerine her dilim yerleştirin ve doku düz bir paintbrush kullanın.
      7. Uzatılmış dilimi tek bir hamlede donmuş sakaroz tabanına aktarın.
        NOT: Dondurulmuş sakaroz tabanının üzerine çıktıktan sonra dilimin hareket ettirmesi mümkün değildir. Bu aktarım adımLarını dikkatle gerçekleştirin.
      8. Uygun dondurma için dilim 5-10 dakika dinlendirin.
      9. Dilimi 30 μm'lik bölümlere kesin.
      10. 30 μm'lik bölümleri PBS içeren bir Petri kabına aktarın.
      11. Deneysel tasarım için daha yeterli histoloji protokolüne devam edin.
        NOT: 30 μm'lik kesitler serbest yüzen immünohistokimya için kolayca kullanılabilir, daha fazla histoloji için mikroskopi slaytlarına monte edilebilir veya -20 °C'de antifriz çözeltisinde saklanabilir.
    2. İmmünohistokimya
      NOT: İmmünohistokimya ve immünofloresan standart protokolleri laboratuarlar arasında farklılık gösterir. Burada kullanılan protokolün ayrıntılı bir sürümü için Horta vd.38'ebakın. Şekil 2'de sunulan immünostainings için kullanılan primer antikorlar nöronal çekirdekler (NeuN), sağlıklı olgun nöron belirteci, glial fibrillary asidik protein (GFAP), astorsit belirteci, iyonize kalsiyum bağlayıcı adaptör (Iba-1) ve mikroglia Işaretleyici.
      1. Dilimleri 40 dakika boyunca bloklama çözeltisi (örneğin, PBS'de %2 normal eşek serumu) kuluçkaya yatırın.
      2. 4 °C'de hafif ajitasyon altında primer antikor ile gece boyunca kuluçkaya yatırın.
      3. PBS ile yıkandıktan sonra, RT hafif ajitasyon altında biyotinylated ikincil antikor ile 120 dakika kuluçka.
      4. PBS ile yıkandıktan sonra, avidin-peroksidaz konjuge(Malzeme Tablosu)ile 120 dk boyunca RT'de kuluçkaya yatırın.
      5. DAB + %0.04 nikel amonyum ile ortaya çıkarın.
      6. Jelatin kaplı mikroskopi slaytlar üzerine lekeli bölümleri monte edin ve onları kuru hava sağlar. Etanol dehydrate, ksilen diyafram, montaj ortamı ile bitirmek(Malzeme Tablosu),bir coverslip ile kapak, ve görüntü.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Kültürdilimlerinin kalitesini ve sağlığını değerlendirmek için kritik bir yönü beklenen nöral hücre tipleri, nöronlar ve glial hücrelerin varlığı ve tipik morfolojisidir. İnsan kortikal laminasyontipik mimarisi DIV4 bir dilim gözlendi, nöronal immünetiketleme ile ortaya (Şekil 2D). Buna ek olarak, mikroglia ve astroglia beklenen varlığı(Şekil 2B,C)de gözlendi. Bu sonuçlar doku mimarisinin cerrahi işlem/numune işleme veya in vitr...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Serbest yüzen, kısa süreli dilim kültürleri üretmek için bu protokol yetişkin insan neokortikal dilimleri kültüriçin alternatif bir yöntemdir. Dilim kültürleri için böyle bir protokol optogenetik1,44,45, elektrofizyoloji2,3,4,5 çalışmaları için uygun olabilir , kısa süreli plastisite4...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma FAPESP (Grant 25681-3/2017 to AS), CAPES (Doktora Sonrası Burs PNPD/INCT-HSM'den A.F.'ye ve N.D.M.'ye Doktora Öncesi Burs) ve FAEPA tarafından desteklenmiştir. G.M.A., FAPESP'den (MS 2018/06614-4) yüksek lisans bursuna sahiptir. N.G.C.'nin CNPq Araştırma Bursu'na sahibivar. Bu çalışma için rezeke edilen dokuları bağışlayan hastalara ve ailelerine teşekkür ederiz. Biz ribeirão Preto Tıp Fakültesi Klinik Hastanesi, São Paulo Üniversitesi, sürecin çeşitli aşamalarında yardımcı sakinleri, hemşireler, teknisyenler ve CIREP ekibinin desteğini kabul etmek istiyorum.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2-PropanolMerck1096341000
Akrilamid/Bis-Akrilamid, %30 çözeltiSigma AldrichA3449 
AgarozSigma AldrichA9539
Amonyum persülfatSigmaA3678-25G
Amfoterisin BGibco15290-018
Antikor anti-ERK 2 (tavşan)Santa Cruz Biyoteknolojisc-154Seyreltme 1: 1.000 BSA'da% 2.5
Antikor, anti-pERK (fare)Santa Cruz Biyoteknolojisc-7383Seyreltme 1: 1.000 BSA'da 2.5%
B27Gibco17504-044
BDNFSigma AldrichSRP3014
Sığır Serumu AlbüminiSigma AldrichA7906
Bradford 1x Boya ReaktifiBioRad500-0205
EDTASigmaT3924RIPA tamponunda kullanılır
GlikozMerck108337
GlutamaxGibco35050-061
Hank'in Dengeli TuzlarıSigma AldrichH1387-10X1L
HepesSigma AldrichH4034
Hidroklorik asitMerck1003171000
Hidrojen Peroksit (H2O2)Vetec194
Fare IgG, HRP bağlantılı bütün Ab (fare karşıtı)GENA931-1ML
NaClMerck1064041000RIPA tamponunda kullanılır
Neurobazal AGibco10888-022
Yağsız kuru süt (Molico)NestléMembran bloke etmek için kullanılır
PBS Tampon pH 7,2Laborclin590338
Penicilin/StreptomisinSigma AldrichP4333
Potasyum KlorürMerck1049361000
Prime Western Blotting Tespit ReaktifiGERPN2232
Tavşan IgG, HRP'ye bağlı bütün Ab (tavşan önleyici)GENA934-1ML
RIPA tamponunda kullanılanSDSSigmaL5750
TEMEDGE17-1312-01
Tiazolil Mavi Tetrazolyum Bromür (MTT)Sigma AldrichM5655
TrisSigmaT-1378RIPA tamponunda kullanılan
Triton x-100SigmaX100RIPA tamponunda kullanılan
Ultra saf SuMilliporuMiliQ su arıtma sisteminden elde edilen steril su
Ekipman ve Malzeme
24 kuyulu plakalarCorningCL S3526Kapaklı Düz Tabanlı
Amersham Potran Premium (nitroselüloz membran) GE29047575
Karbojen KarışımıBeyaz Martins% 95 O2,% 5 CO2
CO2 inkübatörüNew Brunswick ScientificCO-24Dilimlerin inkübasyonu% 5 CO2, 36 & C
Mikroplaka OkuyucuMoleküler Cihazlar
MikrotüplerGreiner0016081,5 mL mikrotüp
Motorlu havaneliKimble Chase
Plastik kaşıkTatlı kaşığı büyüklüğü
JiletliBicKrom Platin, vibratom ile dilimlemede kullanılır
Neşter BıçağıBecton Dickinson (BD)Sayı 24Doku dilimlemek için kullanılır; aynı boyutta veya daha küçük önerilir
Süper Yapıştırıcı (Loctite Super Bonder)HenkelKompozisyon: Etilcianoacrilato; 2-Propenoik asit; 6,6'-di-terc-butil-2,2'-metilenodi-p-kresol; homopolimer
Vibratom ve nbsp;Leica14047235612 - VT1000S
İmmünohistokimya için Malzeme/Ekipman Adı
Antikor anti-NeuN (fare)Millipore MAB377Fosfat Tampon Antikoru
anti-GFAP (fare)MerckMAB360Seyreltme 1: 1.000 Fosfat Tampon
Antikoru anti-Iba1 (tavşan)AbcamEPR16588 - ab178846Fosfat Tamponunda Seyreltme 1: 2.000 Fosfat Tamponu
Biyotinillenmiş anti-fare IgG Antikoru (H + L)VektörBA-9200
DABSigma AldrichD-9015
EntellanMerck107960
EthanolMerck1.00983.1000
JelatinSynth00G1002.02.AESlaytları kaplamak için kullanılır
MicrotomeLeicaSM2010RDonma Aşaması (BFS-10MP, Physiotemp) ile donatılmıştır, -40º'ye ayarlanmıştır; C
Normal Eşek SerumuJackson İmmüno Araştırması017-000-121
ParaformaldehitSigma Aldrich158127
Tavşan IgG, HRP'ye bağlı bütün Ab (tavşan önleyici)GENA934-1ML
Slaytlar (Star Frost)Knittel GlaserJelatin kaplı slaytlar
SucroseVetec60REAVET017050
Vectastain ABC HRP Kiti (Peroksidaz, Standart)VektörPK-4000, Kit Standart
KsilenSynth01X1001.01.BJ

Kaynaklar

  1. Andersson, M., et al. Optogenetic control of human neurons in organotypic brain cultures. Scientific Reports. 6, April issue 1-5 (2016).
  2. Granholm, A. C., et al. Morphological and electrophysiological studies of human hippocampal transplants in the anterior eye chamber of athymic nude rats. Experimental Neurology. 104 (2), 162-171 (1989).
  3. Köhling, R., et al. Spontaneous sharp waves in human neocortical slices excised from epileptic patients. Brain. 121 (6), 1073-1087 (1998).
  4. Simon, A., et al. Gap junction networks can generate both ripple-like and fast ripple-like oscillations. European Journal of Neuroscience. 39 (1), 46-60 (2014).
  5. Israel, J. M., Oliet, S. H., Ciofi, P. Electrophysiology of hypothalamic magnocellular neurons in vitro: A rhythmic drive in organotypic cultures and acute slices. Frontiers in Neuroscience. 10, MAR issue 1-13 (2016).
  6. Bolz, J., Novak, N., Staiger, V. Formation of specific afferent connections in organotypic slice cultures from rat visual cortex cocultured with lateral geniculate nucleus. The Journal of Neuroscience. 12 (8), 3054-3070 (2018).
  7. Crain, S. M. Development of Specific Synaptic Network Functions in Organotypic Central Nervous System (CNS) Cultures: Implications for Transplantation of CNS Neural Cellsin Vivo. Methods. 16 (3), 228-238 (1998).
  8. He, S., Bausch, S. B. Synaptic plasticity in glutamatergic and GABAergic neurotransmission following chronic memantine treatment in an in vitro model of limbic epileptogenesis. Neuropharmacology. 77, 379-386 (2014).
  9. Antonietta Ajmone-Cat, M., Mancini, M., De Simone, R., Cilli, P., Minghetti, L. Microglial polarization and plasticity: Evidence from organotypic hippocampal slice cultures. Glia. 61 (10), 1698-1711 (2013).
  10. Noraberg, J., et al. Organotypic Hippocampal Slice Cultures for Studies of Brain Damage, Neuroprotection and Neurorepair. Current Drug Target - CNS & Neurological Disorders. 4 (4), 435-452 (2005).
  11. Hoppe, J. B., et al. Amyloid-β neurotoxicity in organotypic culture is attenuated by melatonin: Involvement of GSK-3β, tau and neuroinflammation. Journal of Pineal Research. 48 (3), 230-238 (2010).
  12. Sebollela, A., et al. Amyloid-β oligomers induce differential gene expression in adult human brain slices. Journal of Biological Chemistry. 287 (10), 7436-7445 (2012).
  13. Chong, C. M., et al. Discovery of a novel neuroprotectant, BHDPC, that protects against MPP+/MPTP-induced neuronal death in multiple experimental models. Free Radical Biology and Medicine. 89, 1057-1066 (2015).
  14. Daviaud, N., Garbayo, E., Schiller, P. C., Perez-Pinzon, M., Montero-Menei, C. N. Organotypic cultures as tools for optimizing central nervous system cell therapies. Experimental Neurology. 248, 429-440 (2013).
  15. Dragunow, M. The adult human brain in preclinical drug development. Nature Reviews Drug Discovery. 7 (8), 659-666 (2008).
  16. Minami, N., et al. Organotypic brain explant culture as a drug evaluation system for malignant brain tumors. Cancer Medicine. 6 (11), 2635-2645 (2017).
  17. Magalhães, D. M., et al. Ex vivo model of epilepsy in organotypic slices-a new tool for drug screening. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 1-18 (2018).
  18. Wang, X., et al. Genomic and biochemical approaches in the discovery of mechanisms for selective neuronal vulnerability to oxidative stress. BMC Neuroscience. 10, 1-20 (2009).
  19. Di Pietro, V., et al. Transcriptomics of traumatic brain injury: gene expression and molecular pathways of different grades of insult in a rat organotypic hippocampal culture model. Journal of neurotrauma. 27 (2), 349-359 (2010).
  20. Kalebic, N., et al. CRISPR/Cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo. EMBO Reports. 17 (3), 338-348 (2016).
  21. Jones, R. S. G., da Silva, A. B., Whittaker, R. G., Woodhall, G. L., Cunningham, M. O. Human brain slices for epilepsy research: Pitfalls, solutions and future challenges. Journal of Neuroscience Methods. 260, 221-232 (2015).
  22. Hoffer, B., Seiger, A., Ljungberg, T., Olson, L. Electrophysiological and cytological studies of brain homografts in the anterior chamber of the eye: maturation of cerebellar cortex in oculo. Brain Research. 79 (2), 165-184 (1974).
  23. Hoffer, B. J., Olson, L., Palmer, M. R. Toxic effects of lead in the developing nervous system: in oculo experimental models. Environmental Health Perspectives. 74, 169-175 (1987).
  24. Hogue, M. J. Human fetal brain cells in tissue cultures: Their identification and motility. Journal of Experimental Zoology. 106 (1), 85-107 (1947).
  25. Costero, I., Pomerat, C. M. Cultivation of neurons from the adult human cerebral and cerebellar cortex. American Journal of Anatomy. 89 (3), 405-467 (1951).
  26. Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
  27. Stoppini, L., Buchs, A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37, 173-182 (1991).
  28. Sanai, N., et al. Unique astrocyte ribbon in adult human brain contains neural stem cells but lacks chain migration. Nature. 427 (6976), 740-744 (2004).
  29. Eugène, E., et al. An organotypic brain slice preparation from adult patients with temporal lobe epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 235, 234-244 (2014).
  30. Ting, J. T., et al. A robust ex vivo experimental platform for molecular-genetic dissection of adult human neocortical cell types and circuits. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
  31. Verwer, R. W. H., Dubelaar, E. J. G., Hermens, W. T. J. M. C., Swaab, D. F. Tissue cultures from adult human postmortem subcortical brain areas. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 6 (3), 429-432 (2002).
  32. Mendes, N. D., et al. Free-floating adult human brain-derived slice cultures as a model to study the neuronal impact of Alzheimer's disease-associated Aβ oligomers. Journal of Neuroscience Methods. 307, 203-209 (2018).
  33. Bruce, A. J., Malfroy, B., Baudry, M. beta-Amyloid toxicity in organotypic hippocampal cultures: protection by EUK-8, a synthetic catalytic free radical scavenger. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (6), 2312-2316 (1996).
  34. Finley, M., et al. Functional validation of adult hippocampal organotypic cultures as an in vitro model of brain injury. Brain Research. 1001 (1-2), 125-132 (2004).
  35. Schoeler, M., et al. Dexmedetomidine is neuroprotective in an in vitro model for traumatic brain injury. BMC Neurology. 12, 20(2012).
  36. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  37. Maharana, C., Sharma, K. P., Sharma, S. K. Feedback mechanism in depolarization-induced sustained activation of extracellular signal-regulated kinase in the hippocampus. Scientific Reports. 3, 1103(2013).
  38. Horta, J. D. A. C., López, D. E., Alvarez-Morujo, A. J., Bittencourt, J. C. Direct and indirect connections between cochlear root neurons and facial motor neurons: Pathways underlying the acoustic pinna reflex in the albino rat. Journal of Comparative Neurology. 507 (5), 1763-1779 (2008).
  39. Carmona-Fontaine, C., et al. Metabolic origins of spatial organization in the tumor microenvironment. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (11), 2934-2939 (2017).
  40. McMurtrey, R. J. Analytic Models of Oxygen and Nutrient Diffusion, Metabolism Dynamics, and Architecture Optimization in Three-Dimensional Tissue Constructs with Applications and Insights in Cerebral Organoids. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (3), 221-249 (2016).
  41. Lossi, L., Alasia, S., Salio, C., Merighi, A. Cell death and proliferation in acute slices and organotypic cultures of mammalian CNS. Progress in Neurobiology. 88 (4), 221-245 (2009).
  42. Adams, J. P., Sweatt, J. D. Molecular psychology: roles for the ERK MAP kinase cascade in memory. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 42, 135-163 (2002).
  43. Sharma, S. K., Carew, T. J. The roles of MAPK cascades in synaptic plasticity and memory in Aplysia: Facilitatory effects and inhibitory constraints. Learning and Memory. 11 (4), 373-378 (2004).
  44. Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8 (9), 745-755 (2011).
  45. Takahashi, Y. K., et al. Neural Estimates of Imagined Outcomes in the Orbitofrontal Cortex Drive Behavior and Learning. Neuron. 80 (2), 507-518 (2013).
  46. Peça, J., et al. Shank3 mutant mice display autistic-like behaviours and striatal dysfunction. Nature. 472 (7344), 437-442 (2011).
  47. Feliciano, P., Andrade, R., Bykhovskaia, M. Synapsin II and Rab3a Cooperate in the Regulation of Epileptic and Synaptic Activity in the CA1 Region of the Hippocampus. Journal of Neuroscience. 33 (46), 18319-18330 (2013).
  48. Graziane, N. M., Polter, A. M., Briand, L. A., Pierce, R. C., Kauer, J. A. Kappa opioid receptors regulate stress-induced cocaine seeking and synaptic plasticity. Neuron. 77 (5), 942-954 (2013).
  49. Walker, A. G., et al. Metabotropic glutamate receptor 3 activation is required for long-term depression in medial prefrontal cortex and fear extinction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (4), 1196-1201 (2015).
  50. Jung, S., et al. Brain tumor invasion model system using organotypic brain-slice culture as an alternative to in vivo model. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 128 (9), 469-476 (2002).
  51. Chaichana, K. L., et al. Preservation of glial cytoarchitecture from ex vivo human tumor and non-tumor cerebral cortical explants: A human model to study neurological diseases. Journal of Neuroscience Methods. 164 (2), 261-270 (2007).
  52. Avoli, M., Jefferys, J. G. R. Models of drug-induced epileptiform synchronization in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 260, 26-32 (2016).
  53. Gähwiler, B. H. Organotypic cultures of neural tissue. Trends in Neurosciences. 11 (11), 484-489 (1988).
  54. Walsh, K., Megyesi, J., Hammond, R. Human central nervous system tissue culture: A historical review and examination of recent advances. Neurobiology of Disease. 18 (1), 2-18 (2005).
  55. Gähwiler, B. H. Slice cultures of cerebellar, hippocampal and hypothalamic tissue. Experientia. 40 (3), 235-243 (1984).
  56. Bsibsi, M., et al. Toll-like receptor 3 on adult human astrocytes triggers production of neuroprotective mediators. Glia. 53 (7), 688-695 (2006).
  57. González-Martínez, J. A., Bingaman, W. E., Toms, S. A., Najm, I. M. Neurogenesis in the postnatal human epileptic brain. Journal of Neurosurgery. 107 (3), 628-635 (2008).
  58. Verwer, R. W. H., et al. Cells in human postmortem brain tissue slices remain alive for several weeks in culture. The FASEB Journal. 16 (1), 54-60 (2002).
  59. Verwer, R. W. H., et al. Post-mortem brain tissue cultures from elderly control subjects and patients with a neurodegenerative disease. Experimental Gerontology. 38 (1-2), 167-172 (2003).
  60. Masamoto, K., Tanishita, K. Oxygen Transport in Brain Tissue. Journal of Biomechanical Engineering. 131 (7), 074002(2009).
  61. Hadjistassou, C., Bejan, A., Ventikos, Y. Cerebral oxygenation and optimal vascular brain organization. Journal of the Royal Society Interface. 12 (107), (2015).
  62. Qiu, C., Kivipelto, M., von Strauss, E. Epidemiology of Alzheimer's disease: occurrence, determinants, and strategies toward intervention. Dialogues in Clinical Neuroscience. 11 (2), 111-128 (2009).
  63. Stahl, K., Mylonakou, M. N., Skare, O., Amiry-Moghaddam, M., Torp, R. Cytoprotective effects of growth factors: BDNF more potent than GDNF in an organotypic culture model of Parkinson's disease. Brain Research. 1378, 105-118 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Kortikal LaminasyonBiyokimyasal AnalizlerHücre Biyolojisi AnalizleriİmmünohistokimyaVibratom Kesit AlmaHidrojen Peroksit UygulamasıMTT İndirgeme AnaliziERK Fosforilasyonu
Yetişkin İnsan Beyninden Kısa Süreli Serbest Kayan Dilim Kültürleri
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.