Murine Ince bağırsak INTRAEPİTELYAL lenfosit intravital görüntüleme

İntraepitelyal lenfositler (IEL) intestinal epitelin içinde yer alır ve hem Bodrum membranı boyunca hem de lateral hücre içi uzayda bitişik epitelyal hücreler arasında bulunur¹. Her 5-10 epitelyal hücreler için yaklaşık bir IEL vardır; Bu iels, intestinal epitelyal bariyer²' nin büyük genişinde bağışıklık gözetimi sağlamak için nöbetçiler olarak hizmet vermektedir. Γδ T hücre reseptörü (TCR) ifade eden IELs, murine ince bağırsaktaki toplam IEL nüfusunun% 60 ' una kadar oluşur. Γδ T-Cell-eksikliği fareler içinde çalışmalar intestinal yaralanma, inflamasyon ve enfeksiyon yanıt olarak bu hücrelerin büyük ölçüde koruyucu rol göstermek^3,4,5. Tcrd nakavt fare⁶neslini rağmen γδ IEL biyolojisinin anlayışımız, γδ TCR tarafından tanınan ligin henüz⁷tanımlanmasına bağlı olarak sınırlı kalır. Sonuç olarak, bu hücre nüfusunu incelemek için araçların olmaması, fiziksel ve patolojik koşullarda γδ TCR aktivasyonu ve fonksiyonunun rolünü araştırmayı zorlaştırdı. Bu boşluğu doldurmak için γδ IEL göç davranışlarını ve komşu enteranositlerle olan etkileşimleri, γδ IEL fonksiyonu ve dış uyaranlara yanıt verme konusunda ek bilgi sağlamak için bir araç olarak görselleştiren canlı görüntüleme teknikleri geliştirdik.

Son on yıl içinde, intravital görüntüleme önemli ölçüde bağırsak biyolojisinin çoklu yönleriyle ilgili moleküler olayların anlayışımızı genişletti, epitelyal hücre dökülme dahil olmak üzere⁸, epitelyal bariyer fonksiyonunun düzenlenmesi^{9 ,10}, luminal içeriğin miyeloid hücre örnekleme¹¹,¹², ve ev sahibi-mikrobe etkileşimleri¹¹,^13,14,15,16 . İel biyolojisi bağlamında, intravital mikroskopi kullanımı, iel motilitesi 'nin yer alan dinamiklerine ve gözetim davranışlarına arabuluculuk edici faktörlere ışık tutmıştır^{13,14,15, 16 yaşında}. TcrdH2BeGFP (tcrdegfp) muhabiri fareler, hangi Etiketler γδ iels nükleer Gfp ifade tarafından¹⁷, ortaya γδ iels son derece epitelyum içinde hareketli ve sergiler mikrobiyal duyarlı benzersiz bir gözetim davranışı enfeksiyon^17,13,14. Son zamanlarda, başka bir γδ T hücre muhabiri fare geliştirilen (Tcrd-GDL) hangi sitoplazmada Gfp ifade tüm hücrenin görselleştirme izin¹⁸. Benzer metodoloji, özel kemokin reseptörlerinin gerekliliğini araştırmak için kullanılmıştır, örneğin G protein-bağlantılı reseptör (GPCR)-18 ve-55, IEL motilitesi^19,20dinamikleri üzerinde. Hücreye özgü bir muhabir yokluğunda, CD8α karşı Floresan konjuite antikorları görselleştirmek ve iz hareket için kullanıldı^19,20. Iki-foton lazer tarama mikroskobu yaygın intravital görüntüleme için kullanılan rağmen, Spinning disk konfeti lazer mikroskopinin kullanımı minimal arka plan gürültüsü ile yüksek hız ve yüksek çözünürlüklü çok kanallı görüntüleri yakalamak için benzersiz avantajlar sağlar. Bu teknoloji, bağırsak mukozasının kompleks mikroortamında bağışıklık/epitelyal etkileşimlerin uzamsal dinamiklerini hafifletmek için idealdir. Dahası, çeşitli transjenik ve/veya nakavt fare modellerinin kullanımı sayesinde, bu çalışmalar bağırsak immün ve/veya epitelyal hücre fonksiyonunun moleküler düzenlemesine ilişkin bilgi sağlayabilir.

Rutgers New Jersey Tıp Fakültesi Karşılaştırmalı Tıp kaynakları tarafından onaylanan protokollere göre, tüm çalışmalar laboratuar hayvan bakımı (AALAC) değerlendirme ve Akreditasyon Birliği 'nde yapılmıştır.

1. fare hazırlama

Not: Aşağıdaki prosedür, hayvan hazırlığı ve cerrahisi de dahil olmak üzere, 30 – 40 dakika sürer. ameliyattan önce, mikroskobu açın ve 37 °C ' ye mikroskop üzerinde kapalı kuluçta ısınır.

1. Bernard malissen (ıNEKM, Paris, Fransa) elde edildi bir C57BL/6 arka planda 8 – 10 hafta eski TcrdEGFP fareler üzerinde deneyler gerçekleştirin. IAŞUC onaylı prosedüre göre, hayvanın ağırlığına dayalı ketamin (120 mg/kg) ve xylazine (10 mg/kg) ile IP enjeksiyonu ile fare anestezize. Solunum hızı (dakika başına 55 – 65 nefes)²¹, Toe tutam ve palpebral refleks ile anestezi seviyesini değerlendir.
2. Cerrahi uçak anestezi ulaşıldığında, rektal termometre tarafından izlenebilir vücut sıcaklığını korumak için bir Isıtma Pad teyp kullanarak fare arka bacakları güvenli. Anestezinin kapalı olduğunu gösteren işaretler varsa (örneğin, artan Solunum oranı, yanıp sönen ve/veya göz kasının palpebral refleksi tepkisi), fare tamamen yatıştırıcı olana kadar bir kerede 50 μL ketamin/xylazine yeniden yönetiliyor.
3. % 315 μL (10 mg/mL) ile 50 μL Hoechst 33342 seyreltilmesiyle nükleer boya hazırlayın% 0,9 tuzlu; Son konsantrasyon 37,5 mg/kg (200 μL yaklaşık hacim) fare ağırlığını temel alır. Fare anestezi yapıldıktan sonra, Retro-orbital venöz sinüs aracılığıyla tüberkülin şırınga kullanarak Hoechst yavaşça enjekte.
   Not: Wait 1 – 2 dakika sonra sonraki adıma geçmeden önce cilt dolaşım hacmi, Retro-orbital enjeksiyon aşağıdaki değişmesine izin vermek.
4. Kurutulmalarını önlemek için gözlerinin üzerine küçük bir miktarda yağlayıcı yerleştirin.

2. fare cerrahisi: laparootomi Intestinal mukoza maruz

1. Alt karın orta çizgisi boyunca cilt ve peritonum üzerinden 2 cm dikey kesi yapın, bağırsak bölgesini harici olarak görüntülendirin.
2. Açılı forseps kullanarak, dikkatli bir şekilde periton boşlukta çekum çekin ve görüntülenmiş küçük bağırsak alanını belirleyin. Bu süreçte mezenterik kan damarlarını gözyaşı değil dikkatli olun. Olası hasarı veya kanama en aza indirmek için, kapma veya forseps ile bağırsak pinching kaçının.
3. Minimal dışkı içeriği içeren görüntüleme için ince bağırsak (2 – 3 cm) uygun bir bölgeyi bulun. Dikkatle çekum ve kalan ince bağırsak periton boşluğa dönmek, dış ilgi segmenti bırakarak.
   Not: Bu adım sırasında çekum delip veya mezenterik damar bozmadan kaçının.
4. Kan damarlarının arasında altta yatan mesenterin her iki tarafında forseps Iki çift yerleştirin ve hafifçe membran bir delik oluşturmak için birlikte forseps ipuçları RUB (Şekil 1)²². Bu iğne bağırsak altında periton boşluğu kapatırken mezenter geçmesine izin verecektir.
5. Bağırsak döngüsünü harici tutarken kesi kapatın. Açılı forseps ve 5 cm sütür bağlı eğri, konik nokta iğne kullanarak, peritonumun bir tarafına nüfuz, önceki adımda yapılan delik üzerinden gidin ve periton astar diğer tarafına kadar. Üst üste bir dikiş koyun, ve başka kesi alt yakın.
   Not: Bu adımda damar hasarına zarar vermemek.
6. Altta yatan peritonumun önceki dikişleri arasında, kesi ortasında bir dikiş yerleştirerek, bağırsak döngüsünün altındaki cildi kapatmak için bu işlemi tekrarlayın.
   Not: Yalnızca görüntülenmiş olan alanı dışlaştırmak önemlidir; Bu, görüntüleme sırasında yabancı hareketi azaltacaktır. Mezenterik arterlerin bağlamadan kaçıntığınızdan emin olun.
7. Anti-mezenterik sınır boyunca bir perforasyon hattı yapmak için bir elektroautery kullanın. Cauterization hemen sonra, ek ısı kaynaklı doku hasarı önlemek için bağırsak yüzeyine birkaç damla su uygulayın. Bir Kimwipe ile Blot kalıntı su kaldırmak için.
8. Vannas makas kullanarak koterize doku distal kenarında küçük bir yatay yarık kes ve dış doku segmentinin proksimal ucuna doğru koterize hat uzunluğu boyunca kesmek için devam (yaklaşık 1,5 cm uzunluğunda) Mukozal ortaya çıkarmak için Yüzey.
   Not: Gerekirse, açık mukozal yüzeyde kalan aşırı dışkı içeriğini yavaşça kaldırmak için forseps kullanın.
9. Nemlendirilmiş hale gelen doku önlemek için nemli bir Kimwipe ile fare karın kapağı. Kapalı bir gemide mikroskop için fareyi taşıma.

3. Spinning disk Confocal Microkopi tarafından görüntü edinme

1. Pipet 150 μL 1 μM AlexaFluor 633 HBSS üzerinde cam kapak üzerine bir 35 mm tabak altında. Açılan mukozal yüzey doğrudan coverslip temas böylece fareyi konumlandırın.
2. Mikroskobun kafasını eğin ve fareyi ön ısıtılmış bir kuluçta görüntüleme aşamasında yer alan coverkayması çanak üzerine yerleştirin. Alternatif olarak, vücut sıcaklığını korumak için bir Isıtma battaniye ile fareyi kapak.
3. Görüntüleme yazılımını başlatın. Her lazer için uyarma yoğunluğu ve pozlama süresi, sırasıyla photobleaching önlemek ve zaman noktaları arasındaki aralığı en aza indirmek için, 10 – 15 mW veya 120 – 150 MS geçmemelidir. Kare ortalamasını "2" olarak ayarlayın ve arka plan gürültüsünü azaltmak için EM kazanç fonksiyonunu açın. Piksel boyutunun doğru ölçülmesini sağlamak için 63x objektif kalibrasyonunu seçin.
   Not: Yukarıda ayrıntılı ayarlar ilk başvuru sağlamak içindir, ancak bireysel mikroskop konfigürasyonlarına bağlı olarak farklılık gösterecektir.
4. 405 nm lazer ve 20X hava amacı kullanarak, Villi bir alan bulmak için çekirdekleri görselleştirmek fark hareketi eksikliği veya göz ile drift. Respirasyon, peristalsis veya kalp atışı nedeniyle artifaktüel hareketinin alanlarını kaçının.
5. XY taraması kullanarak, ilgi alanının XY koordinatını kaydedin ve gliserol daldırma 63X hedefe geçin.
6. 405 nm kanalında 1 dakikaya kadar canlı bir görüntü alarak seçilen alandaki Villi 'nin istikrarlı olduğunu onaylayın.
7. 405 nm kanalında canlı bir görüntü alırken, odağı, villöz ucunun hemen altındaki ortogonal düzlem bulmak için ayarlayın. Bir 1,5 μm adım kullanarak, yaklaşık 15 – 20 μm çekirdekleri çözmek zor kadar villus aşağı villöz ucu epitelin hemen altında başlayan Z-yığınları kazanın.
   Not: Yukarıda açıklanan pozlama sürelerini kullanarak üç kanal (405, 488, 640 Nm) ile görüntüleme yaparken, üç kanal yaklaşık 20 s aralıklarla sırayla elde etmek mümkündür.
8. Analiz modunda yazılımı açın, 3-5 dk satın başlamadan sonra, görüntü istikrarı ve γδ IEL motilitesi onaylamak için. Villi her alan için 30 – 60 dk görüntüleri almaya devam edin. Her fare için 2 – 3 alan kaydedin. Görüntüleme sırasında, fareyi her 5 dakikada bir izleyin.
   Not: Anestezi kapalı giymeye başlarsa, bir defada 50 μL ketamin/xylazine yönetmek için fare boynuna hafifçe scruff için forseps kullanın. Anestezi seviyelerini izlemeye devam edin ve gerektiğinde yeniden yönetin.
9. Tek bir fare 4 saat daha uzun görüntü için tavsiye edilmez. Görüntü edinme tamamlandığında, bilateral pnömotoraks tarafından izlenen servikal çıkığı tarafından fareler feda.

4.4D analiz görüntüleri

1. Doğrudan 4D Rendering yazılımına görüntüleme dosyalarını içe aktarın.
2. IELS ve Lumen için ayrı yüzeyler oluşturun, ardından Tablo 1 ' de ilk başvuru olarak özetlenen parametreleri kullanarak yüzeyleri zamanla izleyin. IELS için, belirtilen tohum noktası çapını kullanarak dokunmadan nesneleri Böl özelliğini etkinleştirin.
3. IEL motilitesi belirlemek için autoregressive izleme algoritmasını kullanın. İzleme algoritması göreceli olarak doğru olsa da, her bir IEL için parçaları görsel olarak incelemek zorunludur. Bir parça yanlışsa, parçaları Düzenle sekmesinin altında bağlantıyı kes ve Bağlan işlevlerini kullanarak düzeltin.
4. Her Ito lümene uzaklığı belirlemek için, lümen yüzeyini seçin ve araç menüsü altında mesafe dönüşümü işlevini gerçekleştirin. Sorulduğunda, dış yüzey'ı seçin. Hesaplanan bir kez, uzaklık dönüşümü 4 kanal olarak görüntülenir.
5. 4. kanalın yoğunluğu min 'yi, lateral hücre içi alan (LIS) içinde bulunan γδ IELS 'i seçmek için filtreleyin. Bu değer, sütunlu epitelyal hücrenin yüksekliğine bağlı olarak 15 μm ' ye yakın olmalıdır. Bu aralıktaki toplam γδ IELS 'in yüzdesi, LIS 'deki γδ IELs frekansı olarak bildirilir.
6. Daha fazla analiz için, dahil istatistiksel veri ihracat: IEL parça hızı, parça deplasman, parça düzlük ve parça uzunluğu. Alternatif olarak, Vantage modülünü kullanarak verileri analiz edin. Denemeye bağlı olarak, LIS veya IEL/epitelyal etkileşimler içinde bekleme süresi de dahil olmak üzere elde edilen verilerden ek ölçümler alın.

TcrdEGFP muhabiri fareler intravital görüntüleme kullanarak, daha önce bu γδ IELs bir dinamik gözetim davranışı, hangi onlar Bodrum membranı boyunca göç ve lateral hücre içi boşluk (LIS) içine sabit olarak epitelyum devriye sergiler göstermiştir (Şekil 2, Film 1).

Bu yaklaşım, belirli hücre sinyalizasyon yollarının ve/veya reseptörlerin inhibisyonu γδ IOL göç davranışını nasıl etkilediğini değerlendirmek için de kullanılabilir. Örneğin, interlösin (IL)-15, γδ IEL homeostazı23,24için gerekli olan bir pleiotropik sitokin. Il-2rβ reseptörünün Il-15 sinyallerini sabit durumda γδ Ido motilitesi kinetiği ile ilgili olup olmadığını belirlemek için, tcrdegfp muhabiri fareleri, Anti-IL-2rβ antikor (TM-β1) veya izotip IgG2b kontrolü ile 2 saat görüntülenmiş. Renkli parçalar, 30 dakika (Şekil 3A) boyunca tek bir γδ iels 'in göç yollarını gösterir. TM-β1 (Şekil 3A,B) ile tedavi edilen farelerde LIS 'de γδ iels sıklığı artırılsa da, bu γδ iels 'in% 30 ' dan fazlası bir rölanti davranışı sergiledi (Şekil 3A,C). Boşta γδ IELs, pist düzlüğü ve parça deplasman uzunluğuna üst sınırlar koyarak tanımlanmıştır. Bu rölanti fenotipi, kontrol halindeki Il-2rβ blokajı sonrasında γδ iels 'in anlık hız ve sınırlandırma oranındaki önemli bir azalma ile doğrulandı (şekil 3D,E). Ayrıca, boşta γδ iels daha uzun süreli kalma süreleri vardır ve daha sık hareketli γδ IELS (Şekil 3F) ile karşılaştırıldığında LIS içinde lokalize edildi.

Şekil 1: mesentery 'de bir delik oluşturmak için forseps kullanma. Dikişler için bir delik oluşturmak için membranın her iki tarafında forseps yerleştirin. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Şekil 2: jejunum 'da γδ IELs 'In temsilci 3D görüntüsü. Tek bir zaman noktası, istikrarlı bir şekilde TcrdEGFP muhabiri faresi jejunal mukozasının alındığı zaman atlamalı video seçildi. γδ IELS yeşil, beyaz çekirdekler ve kırmızı lümen gösterilir. Ölçek çubuğu = 30 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Şekil 3: Il-2rβ ' n i n inhibisyonu γδ yan hücre içi uzayda rölanti. Bu rakam "epitelyal Il-15, bağırsak mukozası içinde γδ INTRAEPİTELYAL lenfosit motilitesi kritik bir regülatörü" den uyarlanmıştır. tarafından hu, M. D . et al. 2018, J ımmunol, 201 (2), s. 747-756. Amerikan İmmünologlar Derneği tarafından 15 telif hakkı 2018, Inc (A) zaman atlamalı görüntüler, jejunal villöz epitelyum içinde, IgG2b veya TM-β1 0,45 mg ile 2 h tedavi izleyen Gfp γδ IELS göç gösteren. 30 dakika boyunca bireysel γδ IELs (yeşil) motilitesi renkli parçalar ile gösterilir. Çekirdekler beyaz olarak gösterilir ve lümen kırmızı renkte gösterilir. Ölçek çubukları = 20 μm. (B) LIS 'de γδ iels frekansı (tedavi başına n = 3 fare, n = 6-7 video). (C) IGG2B veya TM-β1 tedavi edilen farelerde boşta olan γδ IELS yüzdesi. (D) anlık hız (n = 13.299 ve 9.600 zaman noktaları). (E) parça kısıtlandırma oranları (n = 350 ve 278 parça) gösterilir. (F) boşta ve motil γδ IELS lümenden uzaklık. Ortalama + SEM gösterilir (+). * p < 0,05, * * p < 0,01, #p < 0,0001. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Tablo 1: oluşturma Için temsilci ayarları γδ Ito ve luminal "yüzeyler" ın Imaris. Bu ayarlar, 488 nm kanalının (IEL) ve 640 nm kanalın (Lumen) yüzeylerinin oluşturulması ve izlenmesi sırasında bir başlangıç noktası olarak kullanılabilir. Deneysel koşullara bağlı olarak, bu ayarların değiştirilmesi gerekebilir.

Film 1: GFP Intravital görüntüleme γδ Ito fare jejunum göç davranışı. IgG2b mg 0,45 ile tedavi edilen bir TcrdEGFP faresi, jejunum 'da γδ Ido motilitesi ile zaman aşımı intravital mikroskopisi. γδ IELS yeşil, mavi çekirdekler ve kırmızı lümen gösterilir. Ölçek çubuğu, 20 μm. Çerçeveler yaklaşık 30 dakika boyunca her 30 saniyede bir toplanmıştır. film Hu, M. D. ve al. 201815' ten uyarlanmıştır. Bu videoyu görüntülemek Için lütfen tıklayınız. (İndirmek için sağ tıklayın.)

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.