Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

RNA metiltransferaz aktivite analizi için Antibody Içermeyen tahlil

6.9K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/59856

⸱

9 Temmuz 2019

 , 
1Department of Molecular Biosciences, University of Texas at Austin

Bu makalede

Özet

Burada, sentetik veya in vitro transkripsiyonu RNA üzerinde metiltransferaz aktivitesinin doğrudan analizi için antikor içermeyen bir in vitro tahlil açıklanmıştır.

Özet

RNA 'da 100 ' den fazla kimyasal olarak farklı değişiklikler vardır, üçte ikisi metilasyonlardan oluşur. RNA modifikasyonları ve özellikle metilasyonlar ile ilgili ilgi, hastalık ve kanserle ilgili biyolojik süreçlerde bunları yazarak ve silen enzimlerin oynadığı önemli roller nedeniyle yeniden ortaya çıkmıştır. Burada, sentetik veya in vitro transkripsiyonu RNAs üzerinde RNA metilasyon yazar aktivitesinin doğru analizi için hassas bir in vitro tahlil sağlanır. Bu tahlil S-adenosyl-metiyonin bir tritiated formu kullanır, tritium ile metilated RNA doğrudan etiketleme sonucu. Trityum radyasyon düşük enerji yöntemi güvenli hale getirir, ve önceden mevcut trityum sinyal amplifikasyon yöntemleri, ölçmek için mümkün kılmak ve antikorlar kullanmadan metylated RNA görselleştirmek için, genellikle eserler eğilimli olan. Bu yöntem RNA metilasyonu için yazılırken, birkaç tweaks radyoaktif olarak etiketlenmiş olabilir diğer RNA modifikasyonları çalışma için geçerli hale, 14C Asetil koenzim A ile RNA asetilasyon gibi. genel olarak, bu TAHLIL hızlı RNA değerlendirmek için izin verir metilasyon koşulları, küçük molekül inhibitörleri ile inhibisyonu veya RNA veya enzim mutantlarının etkisi, hücrelerde elde edilen sonuçları doğrulamak ve genişletmek için güçlü bir araç sağlar.

Giriş

DNA, RNA ve proteinler gen ifadesi1 'i sıkıca düzenleyen değişikliklere tabidir. Bu değişiklikler arasında, üç biopolymers üzerinde metilasyonlar ortaya çıkar. DNA ve protein metilasyonları son üç yılda çok iyi incelenmiştir. Buna karşılık, RNA metilasyonlarının ilgi alanı sadece son zamanlarda, RNA metilasyonları yazma, silme veya bağlama proteinlerinin geliştirme ve hastalık2' de oynacağı önemli rollerin ışığında reignited olmuştur. Bol ribozomal ve transfer Rnas 'da daha iyi bilinen fonksiyonlara ek olarak, RNA metilasyon yolları özel haberci RNA stabilitesi3,4, yapıştırma5 ve Translation6,7, Mirna işleme8,9 ve transkripsiyonel duraklatma ve sürüm10,11.

Burada, moleküler biyoloji laboratuarında RNA metiltransferaz aktivitesinin in vitro olarak doğrulanması için basit ve sağlam bir yöntem bildirilmiştir ( Şekil 1' de özetlenmiştir). Birçok çalışmada RNA 'nın metiltransferaz aktivitesini dot-blot ile bir antikor ile bir antikorla karşılaştırın. Ancak, dot-blot RNA metiltransferaz ile kuluçka üzerine RNA bütünlüğünü doğrulamaz. Bu önemlidir, çünkü nükller ile rekombinant proteinlerin bile küçük kontaminasyonları kısmi RNA bozulması ve şok edici sonuçlara yol açabilir. Dahası, yüksek spesifik RNA Modifikasyon antikorları bile değiştirilmiş RNAs 'ı belirli diziler veya yapılarla tanıyabilir. Burada bildirilen in vitro RNA metiltransferaz tahlil S-adenöl metiyonin metil grup donör üzerinde tritiated olabilir gerçeği yararlanır (Şekil 1), metillenmiş RNA doğru antikorlar kullanmadan algılanması için izin . Talimatları in vitro transkripsiyon ve faiz ve metilasyon test bir transkript arıtılması için verilir, ilgi enzim tarafından transkript söyledi. Bu yöntem esnek ve sağlamdır ve belirli bir projenin ihtiyaçlarına göre ayarlanabilir. Örneğin, in vitro transkripsiyonu ve saflaştırılmış RNAs, kimyasal olarak sentezlenmiş RNAs, aynı zamanda hücresel RNAs kullanılabilir. Bu tahlil, tam olarak metilated RNA 'nın bir jel üzerinde çalıştığı yeri göstererek nitel bilgilerin yanı sıra scintite sayar formunda niceliksel bilgiler sağlar. Bu, özellikle metilasyon için hedeflenen RNA veya RNAs boyutunu doğrudan gözlemlemek için bir yöntem sağladığı için, bir RNA metiltransferaz fonksiyonuna benzersiz bir anlayış sağlayabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. In vitro transkripsiyon ve hedef RNA jel arıtma

  1. Kurulan moleküler klonlama teknikleri12 veya Kits kullanarak T7 ve/veya SP6 Rehberleri içeren plazmids ilgi dizisini klonlayın.
  2. İn vitro transkripsiyon için DNA şablonunun doğranallaştıran
    1. Daha önce13' ü açıklandığı gibi, + 20-30 BP upstream ve downstream ile T7 Organizatör bölgesini eklemek üzere tasarlanan astar ile Plasmid 'in PCR tarafından ilgi sırasını arttırın.
    2. Alternatif olarak, RE 'nin tedarikçisi tarafından sağlanan yönergelere göre, bir kısıtlama enzimi (RE) kesim sitesi kullanılarak Plasmid 5 μg ' ye kadar elde edilebilir.
      Not: eklemin seçili RE tarafından kesildiğini iki kez kontrol etmeyi unutmayın. Bu adımda kullanılan RE seçimi, transkript verimini önemli ölçüde etkileyebilir. Tercihen, ters DNA Strand14üzerinde T7 RNA polimeraz şablonu geçiş önlemek için Re üreten bir künt veya 5 '-overhanging uç ile gerilim 'ını doğrusallaştırma. Başlangıç verimleri yetersiz ise farklı RE deneyin.
  3. DNA agaroz jel ekstraksiyon ve temizlik için Kit kullanarak ortaya çıkan DNA arındırın. DNA 'Yı 30 μL su ile elute.
  4. Bir mikrohacim spektrofotometresi ile miksleme, pipet 1,5 μL ve ölçüm DNA konsantrasyonu ile iyi karıştırın.
  5. 4 V/cm 'de 1 saat boyunca taşınan 1x TBE tamponunda% 1 agaroz jel elektroforezi üzerinde saf DNA 'nın kalitesini ve boyutunu kontrol etmek için DNA 250 ng kullanın.
  6. İn vitro transkripsiyon kitinin dondurulmuş reaktifini çözün. T7 RNA Polymerase Mix 'i buzun üzerine ve diğer Reaktifleri oda sıcaklığında bir çatlak üzerine yerleştirin. Tam Çözüleme işleminden hemen sonra, 5 s için rNTP tüplerini, tüplerin alt kısmında ve buzda yer alan bir çözüm toplamak için hızlı döndürün. Yağış önlemek için oda sıcaklığında 10X reaksiyon tampon tutun.
  7. Bir 1,5 mL tüp içine pipet belirtilen sırada oda sıcaklığında 20 μL transkripsiyon reaksiyonu aşağıdaki bileşenleri: 6 μL su, 2 μL (0,1-1 μg) doğrusal DNA şablonu, 2 μL 75 mM ATP çözeltisi, 2 μL 75 mM GTP çözümü , 2 μL 75 mM CTP çözeltisi, 2 μL 75 mM UTP çözeltisi, 2 μL 10X reaksiyon tamponu ve 2 μL, T7 RNA polimeraz karışımı.
    Not: PCR tarafından oluşturulan DNA şablonu Için 100-200 ng DNA 'yı kullanın; bir plazmid kısıtlama enzim sindirimi tarafından oluşturulan DNA şablonu için, ~ 1 μg kullanın. aktif rekombinant onun6ETIKETLI T7 RNA polimeraz E. coli15' te arındırılabilir.
  8. Tüpü iyice karıştırın. 5 s için hızlı spin, tüpün alt kısmında reaksiyon çözeltisi toplamak için 2-4 h 37 °C ' de inkük edin.
    Not: her transkript farklı DNA şablonu, uzunluğu, onun sırası veya yapısı bağlı olarak davranacaktır. 6 saate kadar farklı kuluçk süreleri test ederek in vitro transkripsiyon koşullarını optimize edin; farklı miktarda DNA şablonu, T7 RNA Polymerase veya NTP; veya ek MgCl2 ' nın T7 RNA polimeraz karışımı 'nda mevcut olan şey için eklenmesi.
  9. Kuluçdak döneminin sonunda, 20 μL reaksiyon başına 1 μL DNase ı ekleyin ve 37 °C ' de 15 dakika boyunca inkübasyon yapın.
    Not: polyacrylamid jel hazır olana kadar transkripsiyon reaksiyonu geçici olarak buzda tutulabilir.
  10. Poliakrilamid jel ile arıtma ile devam edin.
    Not: RNA pH ve RNase kontaminasyonuna duyarlı olduğundan, RNA adanmış ekipman ve RNase-Free reaktifler kullanın.
  11. Faiz transkript boyutuna bağlı olarak jel için Poliakrilamid yüzdesini belirlemek: 100-2000 NT için 3,5% (XC: 460 NT; BB: 100 NT), 80-500 NT için% 5 (XC: 260 NT; BB: 65 NT), 60-400 NT için% 8 (XC: 160 NT; BB: 45 NT),% 12 için 40-200 NT (XC: 70 NT; BB: 20 NT),% 15 için 25-150 NT (XC: 60 NT; BB: 15 NT), ve% 20 için 6-100 NT (XC: 45 NT; BB: 12 NT).
  12. 50 ml konik tüpte aşağıdaki reaktifleri birleştirerek üre denatüre Poliakrilamid jel hazırlayın: 9,6 g moleküler sınıf üre, 2 ml 10X TBE, x ml% 40 akrilamid: bis-Acrylamid Mix (29:1) ve su kadar 20 ml Mark tüp üzerinde , burada x = 20 mL/(40%/jel yüzdesi%).
    DIKKAT: Poliakrilamid jelleri genellikle çevreye tanıtılan bir tehlike üretebilen toksik bir malzeme olan un-polimerize edilmiş akrilamid içerir. Polikakrilide jelleri kurumun kimyasal atık programına atın.
  13. % 30 güç olarak 15 s için mikrodalga. 10 dakika oda sıcaklığında veya üre tamamen çözünmüş kadar nutator üzerine yerleştirin.
  14. Jel karışımı döner iken, bir jel kaseti almak (18-iyi, 1 mm kalınlığında; 13,3 x 8,7 cm (g x L)), tarak çıkarın ve jel döküm için kaseti konumlandırın.
  15. Hızlı spin 50 mL tüp için 5 s tüp altında jel solüsyonu toplamak için. 125% 10 amonyum Persülfat çözeltisi (APS) ekleyin. ~ 1 dakika için nutator üzerine yerleştirin 5 s için tekrar hızlı spin.
  16. 25 μL tetramethylethylenediamine (TEMED) ekleyin ve 25 mL 'Lik pipet baloncukları kaçınarak 5 kez pipetleme ile dikkatle karıştırın.
  17. Jel döküm içine pipet ve dikkatle jel tarak kaçınarak kabarcıkları takın.
  18. Kasetin üst kısmına büyük bir bağlayıcı klip ekleyerek mührü sıkın.
  19. Jel için polimerize izin 1 h.
  20. Jel katılaşmış sonra, Binder klip çıkarın. Kaseti Elektroforez kutusuna takın. Üst ve alt rezervuar içine 1x TBE tampon ekleyin.
  21. Transkripsiyon reaksiyonu al. 100 μL 'ye kadar su ekleyin, sonra 100 μL 2x jel yükleme tamponu ekleyin. Önerilen miktarı su ile 10 μL ve 10 μL 2x jel yükleme tamponunu ayrı bir 1,5 mL tüpüne karıştırarak merdiveni hazırlayın.
  22. 70 °C ' de 15 dakika boyunca termomixer 'de merdiven ve in vitro transkripsiyon reaksiyonu inküye.
  23. Numuneler 70 °C ' de denatleme yaparken, tarağı dikkatlice çıkarın, bir P1000 pipet ile her bir kuyudan yukarı ve aşağı pipetleyerek kuyuları temizleyin ve 100 V 'de 10 dakika boyunca hemen önceden çalıştırın.
  24. Numuneler 70 °C ' de 15 dk denatürasyonu tamamladıktan sonra, tüpleri thermomixer 'den çıkarın ve hemen buzun üzerine yerleştirin.
  25. Her iyi jeli, P1000 pipet ile tekrar temizleyin. İlk kuyudan sola 20 μL, 10 ayrı kuyularda RNA numunesi 20 μl ve yok edilmiş kuyularda 20 μL 1x jel yükleme tamponu yükleyin.
  26. Jel% Poliakrilamid bağlı olarak, 60-240 dk için 100 V 'de jel çalıştırın.
    Not: jel yükleme tamponunun içindeki boyalar, jel, yavaş göç eden Bromophenol mavi (BB) mavi bant ve hızlı göç edilen Xylene Cyanol (XC) Camgöbeği bandı ile iki bandın içine ayrılır. Bu bantların% farklı Poliakrilamid jelinde yaklaşık göç iyi bilinmektedir (bkz. Adım 1,11) ve jel RNA göç tahmin etmek için kullanılabilir.
  27. Jel durdurulduktan sonra, dikkatle kasetten jel çıkarın.
  28. Jeli, 50 μL nüklik asit jel lekesi ile 50 mL 1x TBE tamponu içeren temiz bir kutuya yerleştirin ve RNA 'nın Lekelenmek için bir rocker üzerinde 5 dakika boyunca inküye yapın.
  29. Jel görüntüleme sisteminde, tercihen UV transaydınlatma yerine mavi ışığı kullanarak, jelin önce ve sonra bant eksizyonu resmini çekin.
  30. Her bir grup faiz, bir çekirdeksiz tek kullanımlık jel kesme ucu kullanarak tüketim. Her iyi sonra, bir 1,5 mL tüp jel dilim içeren ucu transfer ve kısaca jel dilim toplamak için spin. Tüm bantlar aynı 1,5 mL tüpünde toplanıncaya kadar tekrarlayın.
  31. Tüm jel dilimleri toplandıktan sonra, 1,5 mL tüpüne 100 μL nuclease içermeyen su veya TE tampon ekleyin. ~ 48 h için 4 °C ' de saklayın. Bu, RNA 'nın jel dilimlerinden çözüme çıkmasına olanak sağlar.
  32. Sonra 48 h, pipet su veya TE tampon taze 1,5 mL tüp. Kalan jel dilimleri atın. RNA 'yi Temizleme Kiti ile aşağıdaki şekilde arındırın.
    1. Döndürme sütununu oda sıcaklığında en az 30 dakika dengelentir.
    2. Adım 1,32 ' den yeni 1,5 mL tüpünde 100 μL RNA çözeltisi için, bir nutator üzerinde 2 dakika için iyi bir RLT tampon ve mix 350 μL ekleyin. Spin 1 s at 200 x g tüp altında çözüm toplamak için.
    3. Eklemek 675 μL-in 100% EtOH ve mix iyi 2 dakika nutator üzerinde. Spin 1 s 200 x g at ve hemen sonraki adıma geçin.
    4. 565 μL 'i spin sütununa aktarın ve 15.000 x g'de 1 dakika boyunca döndürün. Toplama tüpünü aspirasyon ile boşaltın.
    5. Önceki adımı örnek ikinci yarısında yineleyin.
    6. 15.000 x g'de 1 dakika için sütuna 500 ΜL RPE tampon ekleyin ve döndürün. Toplama tüpünü aspirasyon ile boşaltın.
    7. Ekle 750 μL 80% etanol sütun ve spin 1 dakika içinde 15.000 x g. Toplama tüpünü aspirasyon ile boşaltın.
    8. Kapağı açık olan yeni 2 mL 'Lik bir toplama tüpüne yerleştirin ve 5 dakika boyunca 15.000 x g 'de döndürün.
    9. Sütunu yeni bir 1,5 mL tüpüne aktarın.
    10. Sütun merkezine 17 μL su ekleyin ve 15.000 x g 'ye 1 dakika boyunca döndürün. Elute bir kez daha 17 μL su kullanıyor. Toplam kurtarılan hacim 32 μL olmalıdır.
  33. Vortexing tarafından iyi karıştırın, pipet 1,5 μL ve RNA konsantrasyonunu bir mikrohacim spektrofotometre kullanarak ölçmek.
  34. , 1.11-1.29 adımlarında olduğu gibi üre denatüre Poliakrilamid jel ile RNA arıtmanın kalitesini kontrol edin.

2. In vitro RNA metiltransferaz tahlil

  1. 100 μL RNA metiltransferaz tahlili ile buz üzerinde 1,5 mL 'Lik bir tüpte aşağıdaki gibi ayarlayın: 23 μL su, 10 μL 10X TBS (500 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1,5 M NaCl), 2 μL, 0,05 M EDTA, 5 μL, 100 mM DTT , 40 μL 50% gliserol, 4 μL 58 μM 3H-Sam, 5 μL 20X proteaz Inhibitörü kokteyli, 1 μL RNaseOUT (opsiyonel), 5 ΜL RNA ve 5 μL metiltransferaz.
    DIKKAT: radyoaktif tritiated malzeme tehlikeli ve sadece eldiven, bir laboratuar ceket ve diğer gerekli PPE giyirken ele alınması gerekir. Radyoaktif malzemeyle temas eden tüm pipet uçları ve tüpleri katı radyoaktif atık olarak kabul edilir. Laboratuvarın onaylı radyoaktif atık protokolüne göre tüm katı ve sıvı radyoaktif atıkların bertaraf edilmesi.
    Not: metiltransferaz ve RNA olmadan kontrol örneklerini dahil edın. Reaktif konsantrasyonları, MgCl2 veya ETIKETLENMEMIŞ Sam gibi divalent Kif tuzlarının optimizasyonu ve/veya eklenmesi gerektirebilir. Son RNA konsantrasyonunun optimum aralığı 50 nM 'den 1 μM ' ye kadar, metiltransferaz konsantrasyonu 25 nM-300 nM arasındadır.
  2. Hafifçe boru vortekslenir tarafından iyice karıştırın. Spin 5 s at 200 x g tüp altında çözüm toplamak için. 37 °C ' de Tüp (lar) ı 2 saat boyunca inkulat.
  3. Adım 1,32 olarak sütun arıtma kullanarak reaksiyon temizleyin.
    DIKKAT: özellikle sütun yıkasları sırasında herhangi bir radyoaktif malzemeyi düzgün bir şekilde bertaraf etmek için çok dikkatli olun (toplama tüplerinden atıklar yerine pipet çıkarın).
  4. Sıvı scintbrilasyon sayımı gerçekleştirin
    1. Örnek başına bir şişe, arka plan ölçümü için bir şişe ve tokatlamak testi için bir şişe ile scintilasyon sayımı raf ayarlayın. 5 mL scintilasyon sayma çözeltisi ile şişeleri doldurun.
    2. 1 şişeye her bir elüe radyoaktif RNA örneğinin 10 μL ekleyin ve kapağı sıkın ve hafifçe karıştırın.
    3. Tokatlamak test şişeleri hazırlayın. Protokol sırasında kullanılan tüm yüzeyler ve ekipmanlar üzerinde iyice pamuk bezlerden RUB. 5 ml scintilasyon çözeltisi ile dolu şişeleri için bezlerden ekleyin ve kapağı sıkın.
    4. Örnekleri scintilasyon sayacı aşağıdaki gibi çalıştırın. Tezgah Kaputu açın, raf makineye takın ve kaputu kapatın. Tek rafa say 'ı seçin. Kullanıcı programını Seç 'i seçin. 60 s. hit Count rafiçin trityum (3H) ölçer bir program seçin veya oluşturun. Scintilasyon sayısını üç kez tekrarlayın.
      Not: ekipman her örnekteki scintbrilasyon sayısını ve çıktıyı hem ekrana hem de çıktıya ölçecektir. İstenirse burada protokol duraklatılır. 2,3 adımda kalan RNA örnekleri daha sonra kullanılmak üzere-80 °C ' de dondurulmuş olmalıdır.
  5. Autoradiogram ile devam edin
    1. 1.11-1.20 basamakları gibi üre denatüre Poliakrilamid jel hazırlayın ve önceden çalıştırın.
    2. 20 μl radyoaktif RNA malzemesi, 20 μL 2x jel yükleme tampon içeren yeni bir 1,5 mL tüp içine pipet. İyi karıştırın. Adım 1,21 olarak merdiven hazırlayın. Numuneleri 70 °C ' de 15 dakika süreyle inküyin.
    3. Örnek yüklemeden hemen önce jel kuyularını bir kez daha yıkayın. Hazır merdiven 20 μL, numune 20 μl ve kalan şeritlere 20 μL 1x jel yükleme tamponu yükleyin. Poliakrilamid yüzdesi bağlı olarak 60-180 dk için 100 V 'de jel çalıştırın.
    4. Jel çalıştırıldıktan sonra, jeli kasetten çıkarın ve 5 μL NEMS nüklik asit jel lekesi ile 50 ml 1x TBE tamponu içeren bir kutuya yerleştirin.
    5. RNA leke için rocker 5 dk için inküye.
    6. Dikkatlice kutunun dışında jel almak ve kuyu yukarı ve soldaki merdiven ile jel görüntüleme sisteminin UV transaydınlatıcı üzerine yerleştirin.
    7. Kamerayı jel üzerine odaklanın, UV ışığını açın ve ardından 50 MS 'den 1 sn 'ye kadar sinyal yoğunluğuna bağlı olarak jel görüntüsünü alın.
    8. UV pozlama kapatın ve tiff dosyası olarak görüntü kaydedin.
    9. Jeli kutuya geri yerleştirin. TBE kaldırın. Bir rocker oda sıcaklığında 30 dakika sabitleme çözeltisi (50% metanol,% 10 asetik asit,% 40 ultra-saf su) 50 mL ile jel düzeltin.
    10. Jel otomatik olarak 25 ml otoradyografi tekniklerinde artırma çözeltisi içeren taze bir siyah kutuya tekrar taşıyın. Siyah bir kutu yokluğunda, ışık solüsyonu korumak için alüminyum folyo ile kutuyu kapak.
    11. Rocker üzerinde oda sıcaklığında 30 dk için inkübe.
    12. Yavaşça jel kaldırın ve yüz-aşağı kuyular ve sağ taraftaki merdiven ile plastik wrap bir sac üzerine yerleştirin. Jelin arkasına iki yaprak Kromatografi kağıdı yerleştirin. Tüm yığını hafifçe çevirin.
    13. Jel kurutma makinesini 80 °C ' ye önceden ısıtın. Jel kurutucuda plastik kapağı geri taşıyın. Plastik kapağın altında sarma, jel ve Kromatografi kağıt yığını yerleştirin ve bir mühür oluşturmak için plastik kapağı geri aşağı taşıyın.
    14. Jel kurutucuda 80 °C ' de 1 saat kuru.
    15. Jel kurutucu kapatın ve yavaşça yığını çıkarın. Sarma ve ikinci Kromatografi kağıdını çıkarın. Bir autoradiogram kasetinde kurutulmuş jel ile kalan Kromatografi kağıdını bantla.
    16. Karanlık odaya 1 sayfa otoradyografi tekniklerinde film ekleyin.
    17. Kaset at-80 ° c ve film geliştirmek 1 saat-4 hafta sonra sinyal yoğunluğuna bağlı olarak, hangi daha önce ölçülen scintilasyon sayar dayalı değerlendirilebilir: 1-4 hafta için 250-1000 CPM, 24 h için 1 hafta için 1000-10000 CPM ve 1 h için 24 h > 10000 CP M.
    18. Film geliştirildikten sonra, filmi kasetin üstüne yerleştirin ve bir laboratuvar işaretleyicisinin 4 kenarı jel, her iyi ve XC ve BB boyalarının pozisyonu ile dikkatle işaretleyin.
    19. 300 veya 600 piksel çözünürlükte film tarayın ve görüntüyü tiff dosyası olarak kaydedin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

In vitro transkripsiyon reaksiyonu
Şekil 2 A , bir in vitro transkripsiyon reaksiyonunun, nispeten kısa (331 NT) ve yüksek yapısal RNA olan 7Sk snRNA 'NıN T7 RNA polimeraz ile tipik bir çalışmasını temsil eder. Bu RAW görüntü üzerinde gösterildiği gibi, birden fazla istenmeyen bantları, hem kısa ve 7SK daha uzun, muhtemelen rasgele transkripsiyon başlatma veya sonlandırma olayları kaynaklanan vardır. Bu nedenle, in vitro transkripsiyon reaksiyonu sonrasın...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada, RNA metiltransferaz aktivitesinin spesifik transkriptlere yönelik in vitro doğrulama için basit ve sağlam bir yöntem bildirilmiştir. Tahlil S-adenosyl metiyonin metil grup donör üzerinde tritiated olabilir gerçeğinden yararlanır (Şekil 1), metillenmiş RNA doğru antikorlar kullanmadan algılanması için izin. Ancak, bu tahlil hangi kalıntı veya kimyasal grup enzim tarafından metillenmiş olduğunu göstermez dikkat etmek önemlidir. Belirli bir kalıntı metilasyonlu olduğunu belirlemek veya ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Yazarlar ChemDraw ile onun yardımı için Dr turja Kanti Debnath teşekkür etmek istiyorum. Xhemalçe laboratuvarındaki araştırmalar, Savunma Bakanlığı tarafından desteklenmektedir-Kongre yönettiği tıbbi araştırma programı-meme kanseri atılım Ödülü (W81XWH-16-1-0352), NıH Grant R01 GM127802 ve mobil Enstitüsü 'nden başlangıç fonları ve Moleküler Biyoloji ve College of Doğa Bilimleri Texas Üniversitesi 'nde Austin, ABD.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
10 bp DNA MerdiveniInvitrogen10821-01510 bp DNA Merdiven kiti.
% 10 Amonyum Persülfat (APS)  N/AN/AÜre denatüre edici poliakrilamid jel için (10 mL için, 1 g'yi 8 mL miliQ suda çözün; hacmi miliQ su ile 10 mL'ye ayarlayın; çözeltiyi 0.45 & mikro ile donatılmış 10 mL'lik bir şırınga kullanarak filtreleyin; m filtresi).
10X TBE TamponN/AN/AÜre denatüre edici poliakrilamid jel için (1L için, karıştırma çubuklu bir silindire 108 g Tris Baz, 55 g Borik Asit ekleyin; 800 mL damıtılmış su ekleyin ve çözünmesine izin verin; 40 mL 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0) ekleyin; miliQ su ile hacmi 1L'ye ayarlayın; çözeltiyi 0.22 & mikro kullanarak filtreleyin; m filtresi).
10X YEMEK KAFYANIYOK1L için, karıştırma çubuklu bir silindire 60.5 g Tris Base, 87.6 g NaCl ekleyin; 800 mL damıtılmış su ekleyin ve çözünmesine izin verin; konsantre HCl ile pH'ı 7.5'e ayarlayın; miliQ su ile ses seviyesini 1L'ye ayarlayın; çözeltiyi 0.22 & mikro kullanarak filtreleyin; m filtresi. 
Akrilamid: Bis-Akrilamid 29:1 (%40 Çözelti/Elektroforez), Fisher BioReagentsFisherBP1408-1Üre denatüre edici poliakrilamid jel için.
ADENOSIL-L-METIYONIN, S- [METIL-3H]; (SAM[3H])Perkin ElmerNET155V250UCRNA'nın in vitro metilasyonu için; Konsantrasyon = 1.0 mCi/mL; Spesifik aktivite = 17.1 Ci/mmol; Molarite=
(1.0 Ci/L)/(83.2 Ci/mmol) = 0.0584 mmol/L = 58.4 &mikro;M.    Dondurulmuş 3H-SAM tüpünü aldıktan sonra, 4 ° C'de çözdürün; C, 20 ve mikro yapın; L alikotları ve -30 ° C'de dondurun. Kısmen kullanılmış bir alikotu asla yeniden dondurmayın ve yeniden kullanmayın.
Amersham Hiperkaset Otoradyografi KasetleriGE HealthcareRPN11649Otoradyogram jel maruziyeti için.
Amersham Hyperfilm MPGE Healthcare28906846Otoradyogram jel maruziyeti için.
Beckman Sintilasyon SayacıBeckmanLS6500Sıvı sintilasyon sayımı için.
Biorad Mini Yatay Elektroforez SistemiBiorad1704466Mini Yatay Elektroforez Sistemi.
cOmplete Mini EDTA İçermeyen Proteaz İnhibitörü Kokteyl TabletleriRoche Uygulamalı Bilim469315900120X'lik bir çözelti için 1 tableti 0.525 mL nükleaz içermeyen suda çözün.
Criterion CellBiorad345-9902RNase poliakrilamid jel için ücretsiz boş kaset.
Kriter boş KasetlerBiorad1656001Dikey midi formatlı elektroforez hücresi.
DeNovix DS-11 Mikrohacim SpektrofotometresiDeNovixDS-11-SMikrohacim Spektrofotometresi.
Ecoscint OrijinalUlusal TeşhisLS-271Sıvı sintilasyon sayımı için.
Fisherbrand 7mL HDPE Sintilasyon ŞişeleriFisher03-337-1Sıvı sintilasyon sayımı için.
Floro-Hance-Hızlı Etkili Otoradyografi ArttırıcıRPI CORP112600Otoradyogram jel ön tedavisi için.
Jel kurutucuBiorad1651745Jeli kurutmak için.
Jel Yükleme Tamponu IIAmbionAM8547Poliakrilamid üre jelinde RNA'yı yüklemek için (bileşim: %95 Formamid, 18 mM EDTA ve %0.025 SDS, Ksilen Siyanol ve Bromofenol Mavisi).
GeneCatcher tek kullanımlık jel eksizyon uçlarıJel ŞirketiNC9431993Agaroz ve poliakrilamid jellerden bantları çıkarmak için.
Megascript KitAmbionAM1333T7 RNA polimeraz ile in vitro transkripsiyon için.
Perfectwestern Ekstra Büyük KonteynerGenhunter CorporationNC9226382 (şeffaf)/ NC9965364 (siyah)Jel boyama kutusu.
pRZAddgene#27663Homojen uçlara sahip in vitro transkriptler üretmek için plazmid
Qiagen RNeasy MinElute TemizlemeQiagen74204RNA temizliği için protokolde sağlanan değiştirilmiş protokolü kullanın.
QIAquick Jel Ekstraksiyon Kiti (50)Qiagen28704Jel ekstraksiyonu ve in vitro transkripsiyon için kullanılan dsDNA fragmanının temizlenmesi için kit.
Saran Premium Plastik AmbalajSaran WrapAmazonKurutma jeli için.
SYBR GoldInvitrogenS11494Ultra hassas nükleik asit jel boyası.
SYBR SafeInvitrogenS33102Nükleik asit jel boyası.
TESigma93283-100ML10 mM Tris-HCl, 1 mM disodyum EDTA, pH 8.0
TEMEDFisher110-18-9Üre denatüre edici poliakrilamid jel için.
SMARTBLOCK 24X 1,5 mL TÜPLÜ termomiksereppendorf5382000023/53610000381,5 mL tüplerin sıcaklık kontrollü inkübasyonu için.
TOPO TA Klonlama Kitiyaşam teknolojileriTaq polimerazın hızlı klonlanması için kitler– in vitro RNA transkripsiyonu için T7 ve/veya SP6 promotörleri içeren vektörlere güçlendirilmiş PCR ürünleri.
TURBO DNaz (2 U⁄ &mikro; L)AmbionAM2238İn vitro transkripsiyon reaksiyonlarından DNA çıkarılması için.
UreaSigma51456-500GÜre denatüre edici poliakrilamid jel için.
Whatman 3MM kağıtGE Healthcare3030-154Jel kurutmak için kromatografi kağıdı.
DNA ve RNA konsantrasyonunu ölçmek için

Kaynaklar

  1. Xhemalce, B. From histones to RNA: role of methylation in cancer. Briefings in Functional Genomics. 12 (3), 244-253 (2013).
  2. Shelton, S. B., Reinsborough, C., Xhemalce, B. Who Watches the Watchmen: Roles of RNA Modifications in the RNA Interference Pathway. PLoS Genetics. 12 (7), 1006139(2016).
  3. Mauer, J., et al. Reversible methylation of m(6)Am in the 5' cap controls mRNA stability. Nature. 541 (7637), 371-375 (2017).
  4. Wang, X., et al. N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability. Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).
  5. Pendleton, K. E., et al. The U6 snRNA m(6)A Methyltransferase METTL16 Regulates SAM Synthetase Intron Retention. Cell. 169 (5), 824-835 (2017).
  6. Meyer, K. D., et al. 5' UTR m(6)A Promotes Cap-Independent Translation. Cell. 163 (4), 999-1010 (2015).
  7. Wang, X., et al. N(6)-methyladenosine Modulates Messenger RNA Translation Efficiency. Cell. 161 (6), 1388-1399 (2015).
  8. Alarcon, C. R., Lee, H., Goodarzi, H., Halberg, N., Tavazoie, S. F. N6-methyladenosine marks primary microRNAs for processing. Nature. 519 (7544), 482-485 (2015).
  9. Xhemalce, B., Robson, S. C., Kouzarides, T. Human RNA methyltransferase BCDIN3D regulates microRNA processing. Cell. 151 (2), 278-288 (2012).
  10. Jeronimo, C., et al. Systematic analysis of the protein interaction network for the human transcription machinery reveals the identity of the 7SK capping enzyme. Molecular Cell. 27 (2), 262-274 (2007).
  11. Liu, W., et al. Brd4 and JMJD6-associated anti-pause enhancers in regulation of transcriptional pause release. Cell. 155 (7), 1581-1595 (2013).
  12. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. Journal of Visual Experimentation. , Cambridge, MA. (2019).
  13. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visual Experimentation. (63), e3998(2012).
  14. Rong, M., Durbin, R. K., McAllister, W. T. Template strand switching by T7 RNA polymerase. Journal of Biological Chemistry. 273 (17), 10253-10260 (1998).
  15. Rio, D. C. Expression and purification of active recombinant T7 RNA polymerase from E. coli. Cold Spring Harb Protocols. 2013 (11), (2013).
  16. Shelton, S. B., et al. Crosstalk between the RNA Methylation and Histone-Binding Activities of MePCE Regulates P-TEFb Activation on Chromatin. Cell Reports. 22 (6), 1374-1383 (2018).
  17. Walker, S. C., Avis, J. M., Conn, G. L. General plasmids for producing RNA in vitro transcripts with homogeneous ends. Nucleic Acids Research. 31 (15), 82(2003).
  18. Blazer, L. L., et al. A Suite of Biochemical Assays for Screening RNA Methyltransferase BCDIN3D. SLAS Discovery. 22 (1), 32-39 (2017).
  19. Arango, D., et al. Acetylation of Cytidine in mRNA Promotes Translation Efficiency. Cell. 175 (7), 1872-1886 (2018).
  20. Ito, S., et al. Human NAT10 is an ATP-dependent RNA acetyltransferase responsible for N4-acetylcytidine formation in 18 S ribosomal RNA (rRNA). Journal of Biological Chemistry. 289 (52), 35724-35730 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

RNA Metilasyonun Vitro AnalizSintilasyon Say mJel Safla t rmaOtoradyografi FilmiPoliakrilamid JelRNA ModifikasyonlarK k Molek l nhibit rleri
RNA metiltransferaz aktivite analizi için Antibody Içermeyen tahlil
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.