Birincil erişkin fibroblastları, yeni başlayanlar tarafından (örn. öğrenciler) kolay, hızlı ve güvenilir bir şekilde ayırmak için bir protokol sunuyoruz. Prosedür primer fibroblastlar elde etmek için enzimatik doku sindirim ve ultrasonik dalgalar ile mekanik ajitasyon birleştirir. Protokol, belirli deneysel gereksinimlere (örn. insan dokusu) kolayca adapte edilebilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Ultrasonik-Augmented primer yetişkin fibroblast yalıtım
Bu makalede
Özet
Özet
Primer erişkin fibroblastlar tüm vücut dokularında fibrozis, fibroblast etkileşimleri ve inflamasyonu incelemek için önemli bir araç haline gelmiştir. Primer fibroblastlar myofibroblast farklılaşma veya senesans indüksiyon nedeniyle sonsuza kadar bölünemez beri, yeni kültürler düzenli olarak kurulmalıdır. Ancak, güvenilir bir yalıtım Protokolü ve primer fibroblast yalıtım kendisi geliştirme süreçleri sırasında üstesinden gelmek için birkaç engel vardır: zorluk yöntemin derecesi (özellikle yeni başlayanlar için), bakteriyel kontaminasyon riski, Primer fibroblastlar deneyler için kullanılabilir ve sonraki hücre kalitesi ve viability kadar gerekli zaman. Bu çalışmada, hızlı, güvenilir ve öğrenme kolay bir protokol izole etmek ve kültür birincil yetişkin fibroblastlar fare kalp, akciğer, karaciğer ve böbrek enzimatik sindirim ve ultrasonik ajitasyon birleştiren sağlanır.
Giriş
Fibroblastlar, birden fazla stellat süreçleri ve geniş bir kaba endoplazmik retikulum ile düz, iğ şeklinde hücreler1,2. Ortalama bir fibroblast 30-100 μm ölçer ve 57 ± 3 gün1,3yaşam süresi vardır. İnsan fibroblastlarının ortalama hücre döngüsü süresi, kültür koşullarına göre 16-48 h arasında değişmektedir4. Kültürlü primer fibroblastların çoğaltılabilir kapasitesinin ve fonksiyonel kalitesinin, donör çağıyla olumsuz şekilde ilişkilendirileceğinden, Genç bağışçıların (hayvanların veya hastaların) mümkünse5,6 .
Fibroblastlar en memeli vücut dokularının baskın bir hücre türünü oluşturmaktadır. Her zaman bulundukları varlığa rağmen, fibroblastların moleküler tanımlaması hala bir zorluk7. Fibroblastlar, embriyonik gelişim sırasında farklı kaynaklardan gelen doku ve organlara göç etmek8. Bu nedenle, fibroblastlar içinde bulunan, her fibroblast nüfusunda bulunan ve fibroblastların özel olan benzersiz Marker proteinlerinin hala eksik olduğu bir bolluk Marker proteini vardır. Böylece, birçok tanınan işaretçileri ifade desenleri genellikle fibroblastlar tanımlamak için kullanılır. En tanınmış belirteçleri arasında vimentin, insan fibroblast yüzey proteini (hFSP), discoidin Domain reseptör 2 (DDR2) ve Alfa pürüzsüz Kas aksini (αSMA).
Fibroblastlar, büyük hücre içi matris (ECM) üreten hücreli tiptir. Böylece, fibroblastlar düzenli bir doku mimarisi korumak ve komşu hücreler için mekanik destek sağlamak1. ECM sentezi ile bozulma arasındaki denge iyi düzenlenmiş bir süreçtir. Sentez yönüne doğru vardiyalar, sonlandırılmadıkça fibrozis yol açan aşırı ECM birikmesi başlangıcına işaret ederler. Fibrozis, moleküler ve fenotektal değişikliklerden kaynaklanan aktif fibroblastlar kaynaklı myofibroblastlar tarafından aracılılar. Miyofibroblastların bir damgasını ECM ve sitokinlerin salgılanması ve düzenli olarak düzenlenmiş αSMA mikrofilemlerin ifadesi9.
Primer fibroblastlar, fibrozis, doku iltihabı ve fibroblast-kanser-hücre etkileşimlerine odaklanan son araştırmaların Spotlight olduğunu10,11. Ancak, sağlık ve hastalık fibroblast özellikleri etkili bir şekilde çalışmak için, düzenli olarak uygun primer erişkin fibroblastlar izole etmek gereklidir. Fibroblastlar12,13,14yalıtmak için çeşitli yöntemler mevcuttur. Fibroblast izolasyonunun üç ana yöntemi, doku parçaları12, enzimatik doku sindirimi15ve boş organların enzimatik perfüzyon9,13,16büyüme vardır. Büyüme avantajı enzimatik hücre bozulması olmadan nazik bir yalıtım sürecidir. Öte yandan, büyüme kültürler genellikle hücreler deneyler için kullanılabilir kadar uzun süreli kültür dönemleri gerektirir. Yaygın enzimatik sindirim hızlı ama diğer hücre türleri ile kontaminasyon riski taşımaktadır (örneğin, endotel hücreleri) veya bakteri ajitasyon sürecinde, hangi mekanik doku çözülür için gerekli olan. Ayrıca, bu yöntemler genellikle ayrıntılı ve öğrenmek için zaman ve beceri gerektirir.
Araştırmalarda primer fibroblastların önemi ile ilgili olarak, mevcut hücre yalıtım yaklaşımlarını hızlı, basitlik ve güvenilirlik açısından optimize etmek için hala bir ihtiyaç vardır. Burada, yüksek kaliteli hücreler sunan bir yeni ultrasonik bazlı enzimatik fibroblast yalıtım yöntemi sağlanır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Aşağıdaki protokol Technische Universität Dresden, Almanya (dosya numarası: T 2014/4) yanı sıra uluslararası kabul görmüş hayvan bakım kuralları (FELASA)17kurumsal hayvan bakım yönergeleri takip eder. Şekil 1 hücre yalıtım sürecini görselleştirir.
1. Kurulum, malzeme ve medyayı hazırlama
- Hazırlamak hücre kültürü orta, PBS çözüm, kolajenaz karışım stok çözüm (Re, 50 mg likofilized kolajenaz karışımı 12 ml steril ultra saf su), ve 0,25% tripsin çözeltisi.
- Orta, PBS ve tripsin solüsyonu 37 °C ' ye kadar ısıtın.
- Ultrasonik su banyosunu 37 °C ' ye ısıtın.
- Forseps dezenfekte, paslanmaz çelik spatula, neşter (organ başına 2x neşter) ve 70% etanol ile 2 cam bevisler ve hücre kültürü kaputu altında bu malzemeleri yerleştirin.
- % 70 etanol ve diğer steril su veya PBS çözeltisi ile bir kabı doldurun. Bu arıcılar her organ alayı sonrasında cihazı dezenfekte etmek ve yıkamak zorundadır.
- Islak buzda soğuk PBS içeren steril 15 mL Plastik tüpler yerleştirin. Boru sayısı, fibroblastları izole etmek istediğiniz organların sayısına bağlıdır.
2. fare diseksiyonu ve organ kaldırma
- İki çift eldiven bir diğeri üzerinde giymek, bu yüzden ilk çifti en kısa sürede hayvan dissected edilmiş olarak kaldırılabilir.
Not: Bu prosedür, hayvanın kürk ve cilt organları üzerinde yayılması bakteri önler. - Fare (örneğin, servikal dislocation) ötenize ve bir polistiren pad her ekstremite iğneler ile karkas pin.
- 70% etanol sprey kullanarak fare karkas dezenfekte. Saç kadar girdap olmaz böylece kürk etanol ıslatılmış olduğundan emin olun.
- Cerrahi forseps ve atraumatik makas kullanarak ürogenital sistemin hemen üstündeki kürk kes. İlk kesi noktasından boyun (3-4 cm) noktasından orta çizginin yanında cildi kesip ekstremitelerde kabartma kesimleri ekleyin.
DIKKAT: bakteriyel kontaminasyonu önlemek için bu adımda kas tabakasını delmeyin! - Karın boşluğu kapsayan kas için optimum erişim için Polistiren köpük Pad cilt pin.
- % 70 etanol kullanarak karın kasısını iki kez dezenfekte edin. Bir sonraki adıma geçmeden önce etanol kuru edelim.
- İlk eldiven çifti çıkarın. Yeni, steril bir forseps ve makas seti kullanın.
- Karın boşluğunu ve toraks, kas katmanını cerrahi makas ile yakarak seçim organlarını nazikçe kaldırmak için açın. Bu nedenle, cerrahi forseps ile yavaşça organ tutun (organ delmek değil, minimal basınç kullanın) ve makas ile organ giriş noktası yakın tedarik kan damarlarını kesti.
- Organları soğuk PBS içeren steril tüplere koyun. Tüpleri sıkıca kapatın. Adım 3,1 ile devam edene kadar tüpler ıslak buz üzerine yerleştirin.
3. doku mincing, sindirim ve hücre ekstraksiyon
- Tüpleri steril hücre kültürü kaputu altında aktarın.
DIKKAT: yeni bir çift eldiven giyin ve onları kaput altına aktarmadan önce% 70 etanol ile tüpleri dezenfekte edin! - Steril forseps kullanarak 15 mL tüpten organ alın. Organ steril 6 cm Petri çanak bir yarısında üzerine yerleştirin ve aşırı kan kaldırmak için PBS ile organ kısa bir süre yıkayın. Organ Petri tabak ikinci yarısında transfer, aşırı PBS kaldırmak.
- İki steril neşter kullanarak doku Mince. Kalan doku parçacıkları 1-2 mm 'den büyük olmamalıdır.
- Steril spatula kullanarak yeni bir steril 15 mL tüp içine kıyılmış doku aktarmak ve% 0,25 tripsin solüsyonu 2 mL ekleyin. Tüp, 37 °C ' de 5 dakika boyunca bir hücre kültürü kuluçvörü haline yerleştirin.
- Tüpü yavaşça (1400/dk.) 10 s için Vortex.
- 4 mL FCS içeren hücre kültürü ortamı (Dulbecco 'nun modifiye kartal Orta (DMEM), örneğin) ekleyerek hücre kültürü kaputu altında tripsin reaksiyonu durdurun.
- Sırasıyla böbrek veya karaciğer için kalp veya akciğer dokusu ve 100 μL içeren her tüp için 250 μL kolajenaz karışım çözeltisi ekleyin.
- Bir ultrasonik su banyosu (37 °C) içine tüpler yerleştirin ve 10 dakika ultrasonik sonicator etkinleştirin.
Not: Bu protokolde kullanılan ultrasonik su banyosu 35 kHz ve 320 W maksimal gücü bir çalışma sıklığı vardır. - Tüpleri hafifçe (1400/dk) 10 s için Vortex.
- Tüpleri tekrar ultrasonik su banyosuna 10 dakika boyunca yerleştirin.
- 10 s için yavaşça Vortex (1400/dk).
- % 70 etanol ile tüpleri dezenfekte edin ve steril hücre kültürü kaputu altında aktarın.
- Solüsyonu bir 40 μm Mesh ile yeni bir steril 15 mL tüpüne filtreleyin.
- Tüp Santrifüjü 500 x g 5 dk.
- Süpernatant kaldırmak ve taze orta 1 ml Pelet pelletini.
- Hücreleri uygun bir hücre kültürü gemisine (örn. 6-kuyu plakası) aktarın ve gemiyi, 37 °C ve% 5 CO2' de bir gecede hücre kültürü kuluçyanına yerleştirin.
- Ertesi gün, orta çıkarın, PBS ile 3 kez yıkayın, sonra taze orta ekleyin (eklenen hacim seçim hücre kültürü gemisi bağlıdır, 2 mL iyi başına 6-kuyu plaka vb.).
- Her gün ortamı değiştirin.
Not: fibroblastlar% 90 optik konfluence ulaştıktan sonra bölünebilir (genellikle 5-7 gün sonra).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu protokolün yetişkin fibroblastları katı duvar dokusundan yalıtmak için yeteneği gösterildi. İmmünofluoresesans boyama veya proliferasyon deneyleri (Şekil 2D-F, Şekil 5A) gibi sonraki deneyler için kullanılabilecek fibroblastlar elde edildi.
Erişkin fibroblastlar genellikle monolayers12,18büyümek birden fazla hücresel süreçleri ile düz iğ şe...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Mortalize fibroblast hücre hatları ile karşılaştırıldığında, primer fibroblastlar çeşitli avantajlar sunar. Yüksek kalitede ve miktarda verimli bir şekilde maliyet yalıtılabilir. Ayrıca, primer kültürler, elde edilen sonuçların güvenilirliğini artıran ve sadece hücre kültürü eserlerinin incelenmesi olasılığını azaltan birden fazla kişiden hücre Etüdü olanağı sunar. Yeni primer kültürlerin sürekli üretimi, tekrarlanan geçişte21' den sonra sıklıkla meydana gelen genetik değişimleri önler. Ayrıca, hü...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Beyan etmek için ilgi çakışması yoktur.
Teşekkürler
Biz uzman teknik destek için Bayan Romy Kempe ve Bayan Annett Opitz teşekkür ederiz. Biz de destek için Bay Bjoern Binnewerg teşekkür ederiz. Bu iş bir) tarafından destekleniyordu a) Förderkreis Dresdner Herz-Kreislauf-Tage e.V., b) "Habilitationsförderprogramm für Frauen", Tıp Fakültesi Carl Gustav Carus Dresden ve c) başka Kröner-Forschungskolleg (EKFK) Tıp Fakültesi Carl Gustav Carus Dresden. Biz fon ve destek için minnettarız.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| % 0.25 Tripsin-EDTA | Sigma-Aldrich, St. Louis, ABD | T4049-100ML | |
| Antibiyotikler | Gibco-Life Technologies, Carlsbad, ABD | Gibco LS15140148 | Penisilin / Streptomisin (10.000 U / mL) |
| Hücre kültürü başlığı | Thermo Fisher Scientific, Waltham, ABD | 51023608 | HeraSafe KSP15 |
| Hücre kültürü inkübatörü | Thermo Fisher Scientific, Waltham, ABD | 50049176 | BBD 6220 |
| Hücre kültürü plakaları | Thermo Fisher Scientific, Waltham, ABD | 6-, 12-, 24-kuyulu | gemiye bağlıdır |
| Hücre kültürü emme | VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Almanya | 20727400 | BVC profesyonel emme |
| Hücre süzgeci (ağ) | Corning, Tewksbury, ABD | 431750 | 40 & m Naylon |
| Santrifüj | Thermo Fisher Scientific, Waltham, ABD | 75007213 | Megafuge 8R |
| Kablosuz pipetleme kontrolörü | Hirschmann, Eberstadt, Almanya | 9907200 | Pipetus |
| Tek kullanımlık pipet uçları | Sigma-Aldrich, St. Louis, ABD | hacme bağlıdır | Pipetler için SafeSeal uçlar (10 & mikro; L, 20 ve mikro; L, 100 ve mikro; L, 200 ve mikro; L, 1000 ve mikro; L) |
| Tek kullanımlık plastik pipetler | Sigma-Aldrich, St. Louis, ABD | hacme bağlıdır | 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL |
| Tek kullanımlık steril neşter | Myco Medical, Cary, ABD | n.a.Techno | cut |
| Dulbeccos Modifiye Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, ABD | 41965-062 | Yüksek glikozlu |
| Eppendorf tüpleri | Eppendorf, Hamburg, Almanya | hacim | 50 ve mikroya bağlıdır; L, 500 ve mikro; L, 1.500 ve mikro; L, 2.000 ve mikro; L |
| Fetal buzağı serumu (FCS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, ABD | F2442-50ML | |
| Kollajenaz karışımı | Sigma-Aldrich, St. Louis, ABD | 5401020001 | Liberase TL Araştırma Sınıfı |
| Petri kabı 6 cm | Sigma-Aldrich, St. Louis, ABD | P5481-500EA | |
| Fosfat Tamponlu Salin (PBS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, ABD | D8537-500ML | 500 mL |
| Yaşlanma tespit kiti | Abcam, Cambridge, Birleşik Krallık | ab65351 | |
| Çalkalayıcı/ Vorteks | IKA, Staufen im Breisgau, Almanya | n.a.MS2 | Minishaker (sonraki model: Ident-Nr.: 0020016017) |
| Steril plastik tüpler | Thermo Fisher Scientific, Waltham, ABD | Falcon 352095 | BD Falcon tüpleri (15 mL, 50 mL) |
| Ultrasonik su banyosu | BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlin, Almanya | 312 | Sonorex RK100H |
| Cerrahi makas (atravmatik) | Aesculap AG, Tuttlingen, Almanya | NR 82 | |
| Cerrahi makas | Aesculap AG, Tuttlingen, Almanya | eq 1060.09 | |
| Cerrahi forseps | Aesculap AG, Tuttlingen, Almanya | BD577 |
Kaynaklar
- Baum, J., Duffy, H. S. Fibroblasts and myofibroblasts: what are we talking about. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 376-379 (2011).
- Tallquist, M. D., Molkentin, J. D. Redefining the identity of cardiac fibroblasts. Nature Reviews. Cardiology. 14 (8), 484-491 (2017).
- Weissman-Shomer, P., Fry, M. Chick embryo fibroblasts senscence in vitro: pattern of cell division and life span as a function of cell density. Mechanisms of Ageing and Development. 4 (2), 159-166 (1975).
- Angello, J. C. Replicative potential and the duration of the cell cycle in human fibroblasts: coordinate stimulation by epidermal growth factor. Mechanisms of Ageing and Development. 62 (1), 1-12 (1992).
- Serra, V., von Zglinicki, T. Human fibroblasts in vitro senesce with a donor-specific telomere length. FEBS Letters. 516 (1), 71-74 (2002).
- Mateu, R., et al. Functional differences between neonatal and adult fibroblasts and keratinocytes: Donor age affects epithelial-mesenchymal crosstalk in vitro. International Journal of Molecular Medicine. 38 (4), 1063-1074 (2016).
- Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the Cardiac Fibroblast. Circulation Journal: Official Journal of the Japanese Circulation Society. 80 (11), 2269-2276 (2016).
- Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260(2016).
- Kuenzel, S. R., et al. Hypoxia-induced epigenetic silencing of polo-like kinase 2 promotes fibrosis in atrial fibrillation. bioRxiv. , 445098(2018).
- Van Linthout, S., Miteva, K., Tschöpe, C. Crosstalk between fibroblasts and inflammatory cells. Cardiovascular Research. 102 (2), 258-269 (2014).
- Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
- Poulet, C., Künzel, S., Büttner, E., Lindner, D., Westermann, D., Ravens, U. Altered physiological functions and ion currents in atrial fibroblasts from patients with chronic atrial fibrillation. Physiological Reports. 4 (2), (2016).
- Gündüz, D., Hamm, C. W., Aslam, M. Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart. Journal of Visualized Experiments. (123), e55601(2017).
- Weldrick, J. J., Abdul-Ghani, M., Megeney, L. A., Burgon, P. G. A rapid and efficient method for the isolation of postnatal murine cardiac myocyte and fibroblast cells. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 96 (5), 535-539 (2018).
- Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 40 (8-9), 268-277 (2004).
- El-Armouche, A., et al. Phosphatase inhibitor-1-deficient mice are protected from catecholamine-induced arrhythmias and myocardial hypertrophy. Cardiovascular Research. 80 (3), 396-406 (2008).
- Guillen, J. FELASA Guidelines and Recommendations. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 51 (3), 311-321 (2012).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments. (44), 2033(2010).
- Masur, S. K., Dewal, H. S., Dinh, T. T., Erenburg, I., Petridou, S. Myofibroblasts differentiate from fibroblasts when plated at low density. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (9), 4219-4223 (1996).
- Rohr, S. Cardiac fibroblasts in cell culture systems: myofibroblasts all along. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 389-399 (2011).
- Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. PubMed - NCBI. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22553484 (2019).
- Coppé, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
- Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy. Nature Medicine. 21 (12), 1424-1435 (2015).
- Singh, M., Sharma, A. K. Outgrowth of fibroblast cells from goat skin explants in three different culture media and the establishment of cell lines. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 47 (2), 83-88 (2011).
- Linge, C., Green, M. R., Brooks, R. F. A method for removal of fibroblasts from human tissue culture systems. Experimental Cell Research. 185 (2), 519-528 (1989).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
