Yöntem makalesi

Presynapse oluşum assay kullanarak Presynapse Organizatör boncuk ve "neuron Ball" kültür

DOI:

10.3791/59893

⸱

2 Ağustos 2019

 ,  , 
1Functional Structure Biology Laboratory, Department of Medical Life Science, Yokohama City University Graduate School of Medical Life Science

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Presynapse oluşumu doğru sırayla sinaptik proteinlerin birikimi de dahil olmak üzere dinamik bir süreçtir. Bu yöntemle, presynapse oluşumu "nöron topu" kültürünün aktik levhalar üzerinde bir presynapse Organizatör protein ile konjuti boncuklar tarafından tetiklenir, böylece Sinapik proteinlerin birikimi presynapse oluşumu sırasında analiz edilmesi kolaydır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nöronal gelişim sırasında, sinaps oluşumu nöral devreler kurmak için önemli bir adımdır. Sinapslar oluşturmak için, sinaptik proteinler hücre organları ve/veya yerel çeviri olgunlaşmamış sinapsların taşıma ile uygun sırada sağlanmalıdır. Ancak, tam olarak nasıl sinaptik proteinlerin doğru sırayla sinaps birikir anlaşılmadı. Burada, presynapse oluşumunu teşvik etmek için boncuk ile nöron top kültürünün kombinasyonunu kullanarak presimtik oluşumu analiz etmek için yeni bir yöntem sunuyoruz. Nöron hücre agregaları olan nöron topları hücre organları ve dendrites uzak aksal levhalar sağlar, böylece presynaplar zayıf floresan sinyalleri hücre organları ezici sinyalleri kaçınarak tespit edilebilir. Boncuk presynapse oluşumu tetiklemek için, biz leucine zengin tekrarlama transmembran nöronal 2 (LRRTM2), bir uyarıcı presinaptik organizatör ile konjuti boncuklar kullanın. Bu yöntemi kullanarak, biz göstermiştir ki veziküler glutamat taşıyıcı 1 (vGlut1), bir sinaptik vezirik protein, Munc18-1 daha hızlı presynapses birikmiş, aktif bir bölge protein. Munc18-1 birikmiş çeviri-güvenilir presynapse bile hücre gövdeleri kaldırdıktan sonra. Bu bulgu, hücre gövdelerini taşıma değil, akons yerel çeviri tarafından Munc18-1 birikimini gösterir. Sonuç olarak, bu yöntem presynaplar ve sinaptik proteinlerin kaynağı sinaptik proteinlerin birikimi analiz etmek için uygundur. Nöron topu kültürü basittir ve özel cihaz kullanmak gerekli değildir, bu yöntem diğer deneysel platformlar için geçerli olabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SYNAPSE oluşumu, nöral devrelerin geliştirilmesi sırasında kritik adımlardan biridir1,2,3. Ön ve post-sinapslardan oluşan özel bölmeler olan sinapsların oluşumu, akons ve dendritlerin uygun şekilde tanınması, aktif bölge ve postsinaptik yoğunluğun oluşması ve uygun şekilde hizalanması ile ilgili karmaşık ve çok adımlı bir süreçtir. iyon kanalları ve nörotransmitter reseptörleri1,2. Her süreçte, sinaptik proteinlerin birçok tür hücre organları ve/veya bölmeler yerel çeviri tarafından sinaptik proteinleri taşıyarak uygun zamanlamaya göre bu özel bölmeleri birikir. Bu sinaptik proteinler fonksiyonel sinaps oluşturmak için organize bir şekilde düzenlenmiş olarak kabul edilir. Bazı sinaptik proteinlerin disfonksiyon nörolojik hastalıklarda sinaps oluşumu sonuçları4,5. Ancak, sinaptik proteinlerin uygun zamanlamaya göre nasıl biriktiği belirsiz kalır.

Sinaptik proteinlerin organize bir şekilde nasıl birikdiğini araştırmak için sinaptik proteinleri kronolojik sırada birikmesini incelemek gerekir. Bazı raporlar,6,7' deki nöronlar kültüründe sinaps oluşumunu gözlemlemek için canlı görüntüleme gösterdi. Ancak, sadece mikroskopide sinaps oluşumu başlatmak nöronlar bulmak için zaman alıcı. Etkili sinaptik proteinlerin birikimini gözlemlemek için, sinaps oluşumu araştırmacılar oluşumu ikna etmek istediğinizde zaman başlamalıdır. İkinci zorluk hücre organları veya sinapslar yerel çeviri taşıma nedeniyle sinaptik proteinlerin birikimini ayırt etmektir. Bu amaçla, çeviri seviyesi hücre gövdelerini sinaptik proteinlerin taşınması izin vermez koşul altında ölçülmesi gereklidir.

Biz, presynapse oluşumu8teşvik boncuk ile nöron top kültürünün kombinasyonu kullanarak roman presynapse oluşumu tahlil geliştirdi. Nöron top kültürü, hücre gövdelerini çevreleyen aksonal levhalar oluşumu nedeniyle aksonal phenoype incelemek için geliştirilmiştir9,10. Biz leucine zengin tekrarlı transmembran nöronal 2 (LRRTM2) ile konjugated manyetik boncuk kullanılan uyarıcı presynapses (Şekil 1a)11,12,13ikna etmek için bir presinaptik Organizatör. LRRTM2 boncukları kullanarak, boncuk uygulandığında zaman presynapse oluşumu başlar. Bu presynapse oluşumu aynı zamanda bir nöron topu binlerce akons başlar anlamına gelir, böylece etkili sinaptik proteinler birikiminin kesin zaman ders incelemek için izin verir. Buna ek olarak, nöron top kültürü, hücre gövdelerini kaldırarak Soma 'dan taşıma sinaptik proteinlerini engellemek için kolaydır (Şekil 1B)8. Biz zaten hücre organları olmadan akons hayatta ve en az 4 saat hücre organları kaldırıldıktan sonra sağlıklı olduğunu doğruladı. Böylece, bu protokol sinaptik proteinlerin (hücre gövdesi veya Akon) türetildiği ve nasıl sinaptik proteinler organize bir şekilde birikir araştırmak için uygundur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yazıda açıklanan deneyler Yokohama City Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi 'nde belirtilen yönergelere göre yapılmıştır.

1. asılı bırakma kültürü olarak nöron topları hazırlanması (gün içinde vitro (dıv) 0-3)

Not: nöron Ball kültürünün hazırlanması için burada anlatılan prosedürler, daha önce Sasaki grubu tarafından bazı değişikliklere İstinaden bildirilen yönteme dayanmaktadır9,10. Biz de çeşitli prosedürleri benimsenen banker yönteminden ayrılmış kültür14.

  1. Diseksiyon başlamadan önce followings teyit
    1. Gerekli tüm çözümleri hazırlayın ve önceden autoclave/filtrasyon ile sterilize edin.
    2. Bu kortikal nöron kültürünün her adımında kullanılmak üzere tüm aletler ve malzemeler hazır tutun.
    3. % 70 etanol ile laminar hava akış kabinini, diseksiyon tablosunu, stereomikoskop, makas ve forseps Sahne plakasını sprey ve silin.
  2. CO2 uygulama üzerine fare euthanize ve E16 embriyo elde etmek için karın incelemek.
  3. Forseps ince ipuçları yardımıyla dikkatle embriyolar gelen beyin çıkarın ve 60 mm hücre kültürü yemekleri 4 ml HEPES tamponlu tuz çözeltisi (HBSS) içeren içine aktarın.
    Not: diseksiyon orta HBSS içerir 10 mM HEPES (pH 7,4), 140 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1,09 mM na2HPO4, 1,1 mm KH2Po4, 5,6 mm D-glikoz, ve 5,64 μM fenol kırmızı.
  4. Kafa derisi çıkarın, koku ampul kesmek, stereomicroscope altında forseps ince ipuçları kullanarak her serebral Yarımküre ayrı kortiklar, ve taze HBSS içeren başka bir 60 mm yemeklere transfer. Her ayrı nöron top kültürü için en az 3-5 embriyo kullanın.
  5. Bir laminar akış hücresi kültür kaputu mikrodissecting yay makas ile küçük parçalar halinde korsları kesip.
  6. Kıyılmış korsinleri 15 mL 'Lik bir tüpe aktarın ve 37 °C ' de bir su banyosuna 4,5 dk için HBSS 'de% 0,125 tripsin 4 mL 'de kıyılmış kortibi tripsinleştirin.
    Not: Bu tripsinizasyon süresi artan zaman (> 4,5 dk) çok daha ölü nöronlara yol açar olarak verimli nöron kültürü için önemlidir.
  7. Hücre toplamalarını steril bir transfer pipeti ile 10 mL HBSS içeren yeni 15 mL 'Lik bir tüpe aktarın ve 37 °C ' de 5 dakika boyunca inküye yapın. bu adımı bir kez daha tekrarlayın.
  8. Yeni bir 15 mL tüp içeren 2 mL Nörobasal medya GlutaMax, B27 takviyesi (NGB orta), 0,01% DNase ı ve% 10 at serumu içeren hücre toplamları aktarın.
  9. Tripsinize kortibi triturate, yangın parlatılmış ince cam Pasteur pipet kullanarak onları tekrar yukarı ve aşağı (3-5 kez) pipetleme ile.
    Not: Yangın parlatılmış ince camlı Pasteur pipet çapı, banker Yöntem kağıt14' te açıklandığı gibi çok önemlidir. Pipet korterler geçmek için çok dar ise, 2-3 farklı boyutlarda sahip pipetler hazırlamak ve büyük pipet deneyin.
  10. Nöron topları hazırlamak için, yukarıdaki hücre süspansiyon almak ve 1 x 106 hücreler/ml NGB orta kullanarak hücre yoğunluğu ayarlayın.
  11. Kültür, 10 cm kültür yemeklerinin üst kapakları içinde 10.000 hücre/damla (1 damla 10 μL) içeren asılı damla olarak kortikal nöronlar.
  12. Kültür yemeklerinin alt kısmına 7 mL fosfat tampon tuz (PBS) ekleyin, sonra 37 °C ' de 3 gün boyunca bir kuluçte tutun,% 5 CO2 ile nöron topu oluşumuna izin vermek için nemlendirilmiş durumda.

2. PLL kaplı cam kapaklara ve kültür bakımına nöron topları yerleştirme (DıV 3-11)

Not: poli-L-lizin (PLL) ile cam kapakların kaplamadan önce, deterjan kullanarak coverfları yıkamak önemlidir. Cam kapakların bazen PLL ile nöronal kültür ve üniforma kaplama için o kadar temiz değildir. Non-Uniform PLL kaplama nöron topları düzensiz aksal uzatma neden olabilir.

  1. 1-3 geceleme için seramik raflarda 1/20 seyreltilmiş nötr olmayan fosforsuz deterjan içinde coverfları ıslatın.
  2. Kapak fişelerini ultra saf suda 8 kez yıkayın ve 200 °c ' de fırın içinde 12 saat sterilize edin.
    Not: buradan gelen tüm adımlar bir laminar hava akımı hücre kültür kaputu yapılmalıdır.
  3. 100 mm 'lik yemeklerle pişmiş kapak makbuzları aktarın. Bir kapak ve alt çanak arasında Parafilm tarafından çanak mühürleme sonra, pişmiş Cover, uzun süreli depolama için muhafaza edilebilir.
  4. Isteğe bağlı Kapakları parafin noktalar uygulayın. Noktalar, nöron toplarının plastik yemeklerde doğrudan temas ederek immünostatik sırasında coverstardan ayırma nöron topları önlemek için yer yapmak. Yaklaşık 90 °C ' de sıcak su banyosunda uygun bir şişede parafin eritin. Bir Pasteur pipet parafin içine daldırma, sonra hızla bir coverslip kenarına yakın üç nokta yapmak için dokunun.
  5. Coat PLL (MW > 300.000), 60-mm yemeklerinde parafin-boncuklu cam coverları üzerine PLL çözeltisi (15 μg/ml Borat tampon) kullanılarak
  6. PBS ile 4 kez yıkandıktan sonra, PLL-kaplı kapakları, bölme hücrelerini öldürmek için medyada her bir iyi ve sitozin β-D-arabinofuranoside hidroklorür (AraC, 3 μM) içinde 350 μL NGB orta içeren 4-kuyu plakasına aktarın.
  7. Nöron toplarını aktarmadan önce Orta erişim 37 °C ' nin sıcaklığının sağlanması için en az 20 dakika boyunca CO2 inkükotandaki PLL kaplı kapaklarını içeren bu 4-kuyu plakasını tutun.
  8. Içinde DıV 3 zaman "nöron topları" çok iyi oluşturulur, 4-kuyu plaka içinde PLL kaplı Cover, onları aktarmak (5 nöron topları/iyi) CO2 kuluçside tutulan.
  9. Sonra 48 h, taze AraC-ücretsiz NGB orta ile nöron topu kültür ortamı değiştirin. Bu prosedürün hemen önce sıcaklığı 37 °C ' de hazır tutulan bir laminar hava akımı hücre kültürü kaputunda sıcak plaka kullanın.
    Not: kültürlerin CO2 kuluçta dışında olduğu zamanı azaltmak için sıcak bir plaka üzerinde mümkün olduğunca hızlı bir şekilde değişen orta gerçekleştirmek gereklidir.
  10. Bu nöron top kültürünü DıV 11 ' e kadar CO2 inkükode tutun.
    Not: at DIV 11-12, nöron topları 1-2 mm kadar nöronlar uzanan deneyler için kullanılır.

3. hücre organları (DıV 11-12) ile veya olmadan nöron top kültürü üzerinde LRRTM2 boncuk uygulanması

Not: nöron top kültürü LRRTM2 boncuk uygulamadan önce, hücre gövdeleri kaldırmak için tavsiye edilir. Bu nedenle, ilk başta LRRTM2 boncuk hazırlamak, sonra hücre gövdeleri kaldırmak ve daha sonra mümkün olduğunca erken kültür LRRTM2 boncuk uygulamak. Biotinylated LRRTM2, Nogi 'nin grubu (Yokohama City University) tarafından şartlanmış orta olarak sağlanmaktadır. Biotin alıcı dizisi ve E 'den biotin ligaz dahil olmak üzere bir ifade vektörü kullanıyorlar . coli BirA 15 , 16 LRRTM2 için biotin eklemek için ve ifade vektörü Expi293 ifade sisteminde bulunan Expi293F hücrelere transfekte. Vektör bilgileri ek Şekil 1' de mevcuttur. Biotinylated LRRTM2-konjuti streptavidin boncuklar immünostasyon büyük ölçüde LRRTM2-FC-konjuti protein prototip LRRTM2 sistemi8Için kullanılan bir boncuk karşılaştırıldığında azalan arka plan.

  1. Biyotinlenmiş LRRTM2 boncuk hazırlanması
    1. Biyotinlenmiş LRRTM2 ifade Expi293F hücrelerin şartından aşırı biotin kaldırmak için, 0,8 ml PBS (Toplam 2,5 ml) PD-10 jel filtrasyon sütunu ile karışık klimalı orta 1,7 ml uygulayın. PD-10 sütunu 25 ml Ultra saf su ve 25 ml PBS ile önceden dengelenmiş.
    2. 3,5 mL PBS ile elute ve LRRTM2 stok olarak akış toplamak.
      Not: Bu LRRTM2 stokları plakaya 'a dağıtılabilir ve uzun süreli olarak-80 °c ' de saklanır. Biyotinlenmiş LRRTM2 ifade seviyeleri bazen lot çok farklılık gösterir. Böylece, boncuklar için Konjugat LRRTM2 stok uygun hacim ilk kez LRRTM2 stok yeni bir sürü kullanıldığında, nöron topları üzerinde yeterli presynapses oluşturmak için belirlenmelidir.
    3. Streptavidin kaplı manyetik partiküllerin (çap: 4-5 μm) mikrosantrifüjler tüpüne askıya alınmasından 20 μL alın. Neodimyum kalıcı mıknatıslar ile bağlı el yapımı bir cihaz için boncuk immobilize ve 1,5 ml mikrosantrifüjü tüpler PBS-mcbc 100 μL ile üç kez yıkayın.
      Not: PBS-MCBC 5 mM MgCl2, 3 mm CAcl2, 0,1% bsa ve% 0,1 Complete EDTA-ücretsiz dahil PBS içerir.
    4. Boncuklar tamamen PBS-MCBC kaldırdıktan sonra, LRRTM2 stok önceden belirlenmiş hacmi ekleyin (genellikle 500-1000 μL, Not 3.1.2 bakın) yıkanmış boncuklar için. 1-2 h için 4 °C ' de Rotator kullanarak karışımı kulkarın.
    5. 100 μL PBS-MCBC ve daha sonra 100 μL NGB orta ile boncukları iki kez yıkayın.
    6. Nöron Ball kültürünü uygulama için 50 μL NGB orta LRRTM2 boncuk resuspend.
    7. Biotinylated-LRRTM2 proteinleri ekleyerek dışında başka bir mikrosantrifüjte tüp kontrol boncukları (negatif kontrol) hazırlamak için aynı yordamları kullanın.
  2. DıV 11-12 nöron topları hücre gövdeleri kaldırma ve LRRTM2 boncuk uygulama
    1. 4-kuyu plakasının kuyularını "hücre gövdesi (+)" ve "hücre gövdesi (-)" olarak etiketleyin.
    2. Daha önce stereomikoskop altında% 70 etanol ile püskürtülür (Şekil 1B) bir jilet ile 45 ° açı sarı bir ucu sonunu kesti.
    3. Sarı uç ucunu bir nöron topunun hücre gövdesi alanına koyun ve hücre gövdelerini emiş ile çıkarın (Şekil 1B).
    4. Denemenin belirtilen her koşulu tanımlamak için, kuyuları tekrar "LRRTM2 boncuklar" ve "kontrol boncukları" olarak etiketleyin.
    5. LRRTM2 ve kontrol boncukları nöron top kültürü üzerinde uygulayın ve plakların alt için 1 dakika Ferrit mıknatıslar kullanarak presynapse oluşumu başlatmak için alt aşağı aşağı aşağı. Bu prosedür aynı anda tüm boncuklar touchdown sağlar. Özellikle, kısa süre inkübasyon için etkili olacaktır (örneğin, 30 dk ve 1 saat) LRRTM2 boncuk ile eşzamanlı.
    6. Zaman kursu denemeleri yapmak için, her biri 0 dk, 30 dakika, 1 saat, 2 saat, 4 saat ve 18 saat olarak ayrı olarak etiketleyin ve belirtilen zaman aralıklarında LRRTM2 boncuk uygulayın.
    7. LRRTM2 boncuk eklendikten sonra, belirtilen süre için boncuklar ile nöron topu kültürü inkük (0 dk ila 18 h) presynaps oluşturmak için.

4. immünostam ve mikroskobik

Not: 4 saat sonra hücre organları yokluğunda ölmek için Aksiyon kademeli eğilimindedir gibi, hücre organları ile ve olmadan deneysel koşullarda LRRTM2 boncuklar ile inkübasyon ile dört h için hücreleri düzeltin. LRRTM2 boncuk ile zaman kursu durumunda, belirtilen süre içinde hücreleri düzeltin.

  1. LRRTM2 boncuk ile presynapse oluşumu sonra nöron top kültüründe sabitleme ve boyama nöronlar
    1. NGB orta kaldırın ve% 4 PBS ile nöron topları düzeltmek (250 μL/Well) Oda sıcaklığında 20 dakika, ve sonra ile yıkayın 500 μL PBS 4-kez her 5 dakika.
    2. Sabit hücreleri TBS (Tris-tamponlu tuz: 50 mM Tris-HCl (pH 7,3) ve 150 mM NaCl) ile 5 dakikadan fazla yıkayın.
    3. 5 dakika boyunca% 0,3 Triton X-100 içeren TBS ile nöron top kültürünün hücrelerini/akkülerini geçirgen.
    4. Engelleyici tampon ile engelleme için hücreleri 1 saat tutun (0,1% Triton X-100 ve 5% NGS (normal keçi serumu) TBS).
    5. Hücrelerin primer antikorlar ile kulbirer; Anti-Rabbit-vGlut1 (veziküler glutamat taşıyıcı 1 (1:4000)) ve anti-Mouse-Munc18-1 (1:300) bir gecede 4 °C ' de antikor seyreltilmiş.
    6. 4 kez immünofluorescence (IF) tampon (0,1% Triton X-100 ve 2% BSA TBS) ile coverfları yıkayın ve fluorophore (Alexa boya) ile 30 dakika için inkübe-konjuyum 2 antikorlar; Anti-Mouse-IgG-Alexa 555 (1:500), Anti-tavşan-IgG-Alexa 488 (1:1000).
    7. PBS 'de 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1 μg/mL) ile 5 dakika boyunca nöronların hücre gövdelerini çekirdekleri leke.
    8. PBS ile coverfaları üç kez yıkayın ve ardından 167 mg/mL poli (vinil) alkol ve 6 mg/mL N-pro'lik gallate içeren montaj medyasını kullanarak cam slaytlara monte edin.
    9. Cam slaytları mikroskopiye kadar-20 °C ' de bir buzdolabında saklayın. Cam slaytların floresan sinyalleri, slaytlar-20 °C ' de saklanırken en az 1 yıl boyunca algılanabilir.
  2. Floresan mikroskobun altında görüntü alma
    1. 60X yağ daldırma merceği kullanılarak soğutmalı bir CCD kamera ile ters floresan mikroskop altında diferansiyel parazit kontrastı ve If görüntülerini yakalayın. Görüntü edinme yazılımı için, bir yazılım yüklü mikroskop sistemi kullanın. Image J görüntü analiz yazılımı olarak kullanın.
    2. Aşağıdaki formülü kullanarak Axon içinde presynapses If yoğunluğu ölçmek; Eğer boncuklar üzerinde Ilgi bölgesi yoğunlukları (YG) – kapalı boncuk bölge yoğunluğu/axonal yoğunluğu boyunca 20 μm boncuklar – arka plan yoğunluğu. Bu oran yoğunluğu protein birikimi indeksi sağlar (Şekil 4A). Image J yazılımını kullanarak orijinal 16 bit görüntülerde ölçümleri gerçekleştirin.
    3. LRRTM2 boncuk ile indüklenen presynapse belirli protein birikimi seviyesini ölçmek için, her zaman uzak 2-görünüm alanı veya daha fazla mikroskop (60X) ile hücre gövdesi dışında alanı seçin.
      Not: yoğun akons hücre gövdesi yakın ve nöron topu çevre tek Akon sağlayabilir gibi görüntüleme için nöron topu alan seçimi çok önemlidir.
    4. Doğru ölçüm için 5-farklı aksonal alan (hücre gövdelerini benzer mesafe)/coverslipseçin.
    5. Aynı görüntüleme koşullarını farklı bir günde ve deneyler arasında tutun

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, LRRTM2 indüklenmiş nöron top kültüründe aksonal yaprak presynaptlarda presynaptik proteinlerin birikiminin temsili sonuçlarını gösteriyoruz. Presynaptik proteinler olarak, uyarıcı sinaptik vezikül proteini vGlut1 ve aktif bölge proteini Munc18-1 ' i analiz ettik. Biz de vGlut1 ve Munc18-1 birikiminin zaman ders presynapses, ve sonuç Munc18-1 hücre organları ve bir protein sentezi inhibitörü kaldırma akons kullanarak presynapses gösteren elde edildi. Son zamanlarda, biz kırılgan X zihinsel retardasyon protein (FMR...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LRRTM2-boncuk ile nöron topu kültürünü kullanarak uyarılan presynapse oluşumunu incelemek için yeni bir yöntem geliştirdik. Şu anda, presynapse oluşumu tahlil çoğu Poly-D-Lysine içerir (PDL)-kaplamalı boncuk ve Disosiye kültür/microfluidic odası20,21,22. Bu yöntemin avantajlarından biri LRRTM2-Beads. LRRTM2, özellikle11,12,13, PDL-boncu...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, bilimsel araştırmalar için JSPS Grant-ın-Aid (KAKENHI) (C) (No. 22500336, 25430068, 16K07061) (Y. Sasaki) tarafından kısmen desteklenmektedir. Biz Dr terukazu Nogi ve Bayan makiko neyazaki (Yokohama City Üniversitesi) nazik biyotinlenmiş LRRTM2 protein sağlamak için teşekkür ederiz. Teknik yardım için Honami Uechi ve Rie Ishii 'ye de teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Antikor seyrelticiDAKOS2022
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Fare IgG (H + L)Jackson ImmunoResearch715-585-151
Alexa Fluor 488 AffiniPure Eşek Anti-Tavşan IgG (H + L)Jackson ImmunoResearch711-545-152
fare anti-Munc18-1BD Biosciences610336
B-27 Takviyesi (50X), serum ücretsizThermo Fisher Scientific17504044
Sığır Serumu Alubumin (BSA)Nacalai Tesque01863-48
Hücre Kültürü ile Muamele Edilmiş Çoklu Yemekler (4 kuyulu tabak)Nunc176740
Komple EDTA içermeyenRoche11873580001
soğutmalı CCD kameraAndor TeknolojisiiXON3
LamelMatsunamiC015001Boyut: 15 mm, Kalınlık: 0.13-0.17 mm
Sitozin ve beta;-D-arabinofuranosid (AraC)Sigma-AldrichC1768
4 ', 6-Diamidino-2-fenilindol Dihidroklorür (DAPI)Nacalai Tesque11034-56
Deoksiribonükleaz 1 (DNase I)Wako saf kimyasallar047-26771
Expi293 İfade SistemiThermo Fisher ScientificA14635
At serumuSigma-AldrichH1270
görüntü elde etme yazılımıNikonNIS-element AR
Görüntü analiz yazılımıNIHImage J
https://imagej.nih.gov/ij/ Ters çevrilmiş fluorecent mikroskopNikonEclipse Ti-E
GlutaMAXThermo Fisher Scientific
Nörobazal medyaThermo Fisher Scientific# 21103-049
Normal Keçi Serumu (NGS)Thermo Fisher Scientific# 143-06561
N-propil gallatNacalai Tesque29303-92
Paraformaldehit (PFA)Nacalai Tesque26126-25

Paraplast Plus		Sigma-AldrichP3558
Poli-L-lizin Hidrobromür (MW > 300.000)Nacalai Tesque28359-54
poli (vinil alkol)SigmaP8136
Hazır Paketlenmiş Tek Kullanımlık PD-10 SütunlarGE sağlık17085101
tavşan anti-veziküler glutamat taşıyıcı 1Sinaptik Sistemler135-302
SCAT 20X-N (nötr fosforsuz deterjan)Nacalai Tesque41506-04
Streptavidin kaplı manyetik parçacıklarSpherotech IncSVM-40-10çap: 4-5 ve mikro; m
TritonX-100Nacalai Tesque35501-15
TripsinNacalai Tesque18172-94
35050061

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Waites, C. L., Craig, A. M., Garner, C. C. Mechanisms of Vertebrate Synaptogenesis. Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 251-274 (2005).
  2. Ziv, N. E., Garner, C. C. Cellular and molecular mechanisms of presynaptic assembly. Nature Reviews Neuroscience. 5 (5), 385-399 (2004).
  3. Chia, P. H., Li, P., Shen, K. Cellular and molecular mechanisms underlying presynapse formation. Journal of Cell Biology. 203 (1), 11-22 (2013).
  4. Südhof, T. C. Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease. Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).
  5. Saitsu, H., et al. CASK aberrations in male patients with Ohtahara syndrome and cerebellar hypoplasia. Epilepsia. 53 (8), 1441-1449 (2012).
  6. Friedman, H. V., Bresler, T., Garner, C. C., Ziv, N. E. Assembly of New Individual Excitatory Synapses. Neuron. 27 (1), 57-69 (2000).
  7. Bresler, T., et al. Postsynaptic density assembly is fundamentally different from presynaptic active zone assembly. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24 (6), 1507-1520 (2004).
  8. Parvin, S., Takeda, R., Sugiura, Y., Neyazaki, M., Nogi, T., Sasaki, Y. Fragile X mental retardation protein regulates accumulation of the active zone protein Munc18-1 in presynapses via local translation in axons during synaptogenesis. Neuroscience Research. , (2018).
  9. Sasaki, Y., et al. Phosphorylation of Zipcode Binding Protein 1 Is Required for Brain-Derived Neurotrophic Factor Signaling of Local β-Actin Synthesis and Growth Cone Turning. Journal of Neuroscience. 30 (28), 9349-9358 (2010).
  10. Sasaki, Y., Gross, C., Xing, L., Goshima, Y., Bassell, G. J. Identification of axon-enriched microRNAs localized to growth cones of cortical neurons. Developmental neurobiology. 74 (3), 397-406 (2014).
  11. Linhoff, M. W., et al. An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers. Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).
  12. de Wit, J., et al. LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).
  13. Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., Südhof, T. C. LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).
  14. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).
  15. Hirai, H., et al. Structural basis for ligand capture and release by the endocytic receptor ApoER2. EMBO reports. , (2017).
  16. Yasui, N., et al. Functional Importance of Covalent Homodimer of Reelin Protein Linked via Its Central Region. Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 35247-35256 (2011).
  17. Bassell, G. J., Warren, S. T. Fragile X Syndrome: Loss of Local mRNA Regulation Alters Synaptic Development and Function. Neuron. 60 (2), 201-214 (2008).
  18. Darnell, J. C., Klann, E. The translation of translational control by FMRP: therapeutic targets for FXS. Nat Neurosci. 16 (11), 1530-1536 (2013).
  19. Richter, J. D., Bassell, G. J., Klann, E. Dysregulation and restoration of translational homeostasis in fragile X syndrome. Nature Reviews Neuroscience. 16 (10), 595-605 (2015).
  20. Lucido, A. L., et al. Rapid Assembly of Functional Presynaptic Boutons Triggered by Adhesive Contacts. Journal of Neuroscience. 29 (40), 12449-12466 (2009).
  21. Taylor, A. M., Wu, J., Tai, H. C., Schuman, E. M. Axonal Translation of β-Catenin Regulates Synaptic Vesicle Dynamics. Journal of Neuroscience. 33 (13), 5584-5589 (2013).
  22. Batista, A. F. R., Martínez, J. C., Hengst, U. Intra-axonal Synthesis of SNAP25 Is Required for the Formation of Presynaptic Terminals. Cell reports. 20 (13), 3085-3098 (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

LRRTM2 BoncuklarvGlut1 BirikimiMunc18 1 BirikimiAksonal Protein Ta maLokal Translasyonmm nofloresan G r nt lemeSinaptik Vezik l ProteiniAktif B lge Proteini

İlgili makaleler