Bu makalede, protein subselliyerizasyon dinamiklerini araştırmak ve Bacillus subtilis ve Staphylococcus aureus'ta yüksek çözünürlüklü floresan mikroskobu kullanarak morfolojik değişiklikleri izlemek için adım adım kılavuz verilmektedir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Bakterilerde Hücre Altı Protein Lokalizasyonu ve Hücre Morfolojisi Değişikliklerini Araştırmak Için Canlı Hücre Floresan Mikroskobu
Bu makalede
Özet
Özet
Bakterilerde hücre bölünmesi ve hücre şeklini etkileyen faktörlerin araştırılması genellikle yüksek çözünürlüklü floresan mikroskobu ile birlikte yapılır, çünkü popülasyon düzeyinde yapılan gözlemler tek bir hücre düzeyinde meydana gelen leri tam olarak yansıtmayabilir. Canlı hücre timelapse mikroskopisi, araştırmacıların hücre bölünmesi veya hücre morfolojisindeki değişiklikleri izlemelerine olanak sağlar ve bu da proteinlerin hücre altı lokalizasyonu ve gen ekspresyonunun zamanlaması ile ilgili değerli içgörüler sağlar, ki bu da önemli biyolojik soruların cevaplanmasında potansiyel olarak yardımcı olur. Burada, bacillus subtilis ve Staphylococcus aureus'taki henotibik değişiklikleri yüksek çözünürlüklü dekonvolution mikroskobu kullanarak izlemek için protokolümüzü açıklıyoruz. Bu raporun amacı, bakterilerin yanı sıra diğer organizmalarda farklı biyolojik süreçleri incelemek için floresan mikroskobu deneyleri yapmak la ilgilenen diğer araştırmacılar tarafından benimsenebilecek basit ve net bir protokol sağlamaktır.
Giriş
Bakteri hücre biyolojisi alanı önemli ölçüde mikroskopi teknikleri son gelişmeler ile geliştirilmiştir1,2. Diğer aletlerin yanı sıra, timelapse floresan mikroskobik deneyler icra edebilen mikroskoplar değerli bir araç olmaya devam etmektedir. Araştırmacılar gibi floresan proteinler kullanarak gerçek zamanlı olarak çeşitli fizyolojik olayları izleyebilirsiniz, yeşil floresan protein (GFP) tabanlı transkripsiyonel ve çevirisel muhabir füzyon, floresan D-amino asitler (FDAA)3, ya da hücre duvarı, membran ve DNA etiketleme için diğer lekeler kullanın. Bu nedenle floresan mikroskopimikrobiya....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Genel büyüme koşulları
- Uygun büyüme ortamının 2 mL'sini antibiyotiklerle desteklendirin (gerektiğinde) tek bir suş kolonisi ile görüntülenin. Bu tohum kültürlerini bir gecede 22 °C'de sallayarak bir kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın.
NOT: Bu makalede kullanılan özel bakteriyel büyüme koşulları temsili sonuçlar bölümünde sağlanmaktadır. - Bir gecede kültürleri seyreltin 1:20 taze ortamda 125 mL şişe, antibiyotik ile ek (gerektiğinde).
- 37 °C'de orta logaritmik faza (OD600 = 0.5) kadar sallanan bir kuluçka makinesinde kültür(ler) yetiştirin.
NOT: İndükleyici veya inhibitör uygun büyüme aşamasında büyüyen kültür(ler) doğ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
GpsB fenotipleri
Daha önce sa-GpsB hücre lysis bir antisense RNA sonuçları kullanarak GpsB tükenmesi gibi önemli bir protein olduğunu göstermiştir9. Burada çeşitli hücre bölünmesi fenotiplerinin ortaya çıkışının ve protein lokalizasyonundaki değişikliklerin bu makalede açıklanan timelapse mikroskopi protokolü kullanılarak nasıl yakalanabileceği açıklanmaktadır. Bu amaçla, S. aureus suşları RB143 [SH1000 barındıran pEPSA5 (boş vektör)] ve GGS8 [SH1000 harboring pGG59 (<.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Mikroskopi mikrobiyal organizmalarla ilgili çalışmalarda dayanak noktası olarak kalmıştır. Mikron ölçekli hücre büyüklükleri göz önüne alındığında, tek hücre düzeyinde çalışmalar geleneksel olarak elektron mikroskobu (EM) dayanıyordu. EM son yıllarda oldukça güçlü bir teknik haline gelmiş olsa da, sınırlı kullanıcı erişimi16ek olarak kendi içsel sınırlamaları vardır. Floresan mikroskobu tekniklerinde gelişmeler ve FDAA3gibi farklı floresan probların geliştirilmesi, canlı hü.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Laboratuvar üyelerimize bu yazıdaki yorumları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Güney Florida Üniversitesi'nin (PE) başlangıç ödeneği ile finanse edilmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Agarose | Fisher BioReagents | BP160-100 | Moleküler Biyoloji Sınıfı - Düşük EEO |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | Mikroskopi |
| FM4-64 | Invitrogen | T3166 | Mikroskopi |
| Cam alt tabak | MatTek | P35G-1.5-14-C | Mikroskopi |
| IPTG | Fisher BioReagents | BP1755-10 | Dioksan içermez |
| Mikroskop | GE | DeltaVision Elite | Özelleştirilmiş Olympus IX-71 Ters Mikroskop Standı; Özel aydınlatma kulesi ve iletilen ışık aydınlatıcı modülü. Hedefler: PLAPON 60X (N.A. 1.42, WD 0.15 mm); OLY 100X YAĞ (N.A. 1.4, WD 0.12 mm); 100X Hedefi için DIC Prism Nomarski; CoolSnap HQ2 kamera; SSI Meclisi 7 renkli; Çevre kontrol odası - opak. |
| PC190723 | MilliporeSigma | 3445805MG | FtsZ inhibitörü |
| SoftWorx | GE | Üretici tarafından sağlanan görüntüleme yazılımı |
Kaynaklar
- Coltharp, C., Xiao, J. Superresolution microscopy for microbiology. Cellular Microbiology. 14 (12), 1808-1818 (2012).
- Holden, S. Probing the mechanistic principles of bacterial cell division with super-resolution microscopy. Current Opinion in ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
