Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Summary

Bu makalede, makrofajlar çekmek için tümör hücrelerinden şartlık orta yeteneğini değerlendirmek için yararlı bir in vitro tahlil temsil eder.

Abstract

Tümör ilişkili makrofajlar (TAMs) kanserlerin farklı türleri için tümör kitlesinde hücrelerin büyük bir yüzdesi için hesap. Glioblastoma (GBM), hiçbir tedavi ile malign bir beyin tümörü, bir buçuk tümör kitle TAMs vardır. TAMs hücrelerde belirli genlerin aktivasyonuna bağlı olarak, tümör yanlısı veya anti-tümör olabilir. Tümörlerde genetik mutasyonlar, sitokin ifadesinin düzenlenmesi yoluyla, TAMs ‘in tümör mikroortamına alınmasını etkileyebilmektedir. Burada, biz tümör hücrelerinden şartlandıran orta makrophaj işe değerlendirmek için bir nicel hücre tabanlı tahlil tarif. Bu tahlil, yüksek yeniden üretilebilirlik ve düşük değişkenlik için izin glioblastoma tarafından şartlanabilir medyası tarafından makrophaj cazibe çalışması için MV-4-11 insan makrophage hücre hattı kullanır. Bu tahlil ile oluşturulan veriler, tümör ve tümör mikroçevre arasındaki etkileşimin daha iyi anlaşılması için katkıda bulunabilir. Benzer tahlil tümör hücreleri ve diğer bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimi değerlendirmek için kullanılabilir, T hücreleri ve doğal katil (NK) hücreleri de dahil olmak üzere.

Introduction

Macrofajlar yüksek fenotürik ve fonksiyonel heterojenite ile bağışıklık hücrelerdir¹. Onlar ana savunma sistemleri, doku tamiri, geliştirme ve tümör ilerlemesi¹önemli roller oynar. TAMs, Solid tümörlerin mikroortamında macrofajlar. Bazı Tams T hücre aracılı sitotoksisik aktivite inhibe ederek tümör büyümesini teşvik edebilir, tümör mikroçevre modülasyon (TME), anjiyojenezi teşvik, invazyon ve metasfik²,^{3,4, 5}. Tams en bol hücre TÜRLERI arasında TME ve Tams yüksek sayıda genellikle katı tümörlerin birçok türde kötü hasta hayatta kalma ile ilişkilidir⁶. Tümör hücrelerinin farklı genetik imzaları makrofajlar işe yeteneklerini etkiler. GBM ‘de hiçbir çare olmayan agresif bir beyin tümörü olan makrofajlar, tümör kitlesi⁷‘ nin yarısını gösterebilir. Epidermal büyüme faktörü reseptörünün (EGFR) ve kesilmesi mutant egfrvııı ‘in eş amplifikasyonu, tümör büyüme avantajlarını⁸‘ e getiren GBM ‘de sıklıkla görülür. EGFR ve Egfrvııı ‘e eş ifade eden hücreler, EGFR veya Egfrvııı ‘i ifade eden hücrelere kıyasla daha fazla makrofajları çeker⁷.

Kemokinler, TME^6,9‘ da bağışıklık bileşiminin düzenleniminde önemli roller oynayan küçük sitokinlerin bir ailesdir. İnsan hücreleri 50 ‘ den fazla sitokinler¹⁰ifade eder. Tümörlerde bağışıklık infiltrasyonu büyük ölçüde sitokinler ve sitokin reseptörleri arasındaki etkileşim tarafından gerçekleştirilir¹¹. Bağışıklık hücrelerinin her türü farklı kemokin reseptörleri ifade/kemokinler ve belirli chemokines salgılar hücreler tarafından işe alınabilir/kemokin reseptörleri¹². Kanser hücreleri, TAMs, düzenleyici T hücreleri ve myeloid türeyen bastırıcı hücreler (MDSCs)⁶gibi bağışıklık hücrelerini işe almak için belirli kemokinler ifadesini artırabilir. Tümörler tarafından salgılanan spesifik kemokinin blokajı, bağışıklık hücrelerinin tümör kitlesine infiltrasyonunun inhibe edilmesi konusunda umut verici bir yol olabilir.

Burada, tümör-makrophaj etkileşiminin in vitro olarak değerlendirilmesine izin veren bir protokol tanımlamakta, kemokinler ve makrophaj hücre hatları içeren tümör hücrelerinden şartların kullanıldığı medyayı kullanarak.

Protocol

1. orta hazırlık Serum içermeyen kök hücre ortamının hazırlanması 50 x B27 takviyesi, epidermal büyüme faktörü (EGF, 20 μg/mL 10 mM asetik asit 0,1% BSA ile) ve fibroblast büyüme faktörü (FGF, 20 μg/mL 10 mM asetik asit 0,1% BSA ile) çözüyor. Ekle 500 μL EGF (son konsantrasyon 20 ng/mL), 500 μL FGF (son konsantrasyon 20 ng/mL), 10 mL 50x B27 için 500 mL Dulbecco ‘nun modifiye kartal orta/besin karışımı F-12 (DMEM/F12) ve 5 mL 100x penisilin/streptomisin (pen/strep). Karıştırmak için şişe 4-6 kez ters çevirin, 500 mL 0,1 μm filtrasyon bardak ile filtre sterilize. Şişe ve mağaza 4 °C olarak işaretleyin.Not: Orta, 4 °C ‘ de bir aya kadar kullanımı iyidir. MV-4-11 kültür ortamını hazırlayın: Iscove ‘un modifiye Dulbecco ‘nun Orta (ıMDM) ‘ inin 500 mL ‘ine 50 mL fetal sığır serumu (FBS) ekleyin. Karıştırmak için şişe 4-6 kez ters çevirin, 500 mL 0,1 μm filtrasyon bardak ile filtre sterilize. Şişe ve mağaza 4 °C olarak işaretleyin.Not: Orta, 4 °C ‘ de bir aya kadar kullanımı iyidir. Tümör hücre bakım ortamını hazırlayın: 50 mL, Dulbecco ‘nun modifiye kartal Orta (DMEM) 500 mL FBS ekleyin. Karıştırmak için şişe 4-6 kez ters çevirin, 500 mL 0,1 μm filtrasyon bardak ile filtre sterilize. Şişe ve mağaza 4 °C olarak işaretleyin.Not: Orta, 4 °C ‘ de bir aya kadar kullanımı iyidir. 2. hücre hazırlama 1. gün: Çözülme tümörü hücreleri Tümörün hücre bakım ortamını (1,3 adımda açıklandığı gibi) 37 °C ‘ lik su banyosunda 20 dakika ısıtın. Sıvı nitrojen tankından dondurulmuş U87, U87: EGFR, U87: Egfrvııı ve U87: EGFR + Egfrvııı hücrelerini alın. 37 °C su banyosundan 2 dakika boyunca hücreleri çözün.DIKKAT: hücreleri sıvı nitrojen tankından alırken dikkatli olun. Gerektiğinde termal koruma ve güvenlik gözlükleri ile eldiven giyin. % 70 etanol ile doku kültürü kaput yüzeyi sprey ve kağıt havlular ile yüzeyde% 70 etanol silin. Sprey kriyojenik şişeler içeren hücreler ve orta şişe 70% etanol ile, temizle 70% etanol kağıt havlu ile yüzeyde, ve doku kültürü kaputu içine getirmek. 15 mL steril Santrifüjlü tüp içine 5 mL tümör hücresi bakım ortamı pipet. Tümör hücrelerini içeren tüpü 4-6 kez karıştırarak tersine çevirin. Tüm hücreleri 15 mL santrifüj tüpüne pipet. Karışım santrifüj tüp 4-6 kez tersine çevirin. 200 x g ‘de hücreleri 4 °c ‘ de 5 dakika santrifüjler. Süpernatant aspirate. Hücreleri 10 mL fosfat tamponlu tuz (PBS) ile yıkayın. 200 x g ‘de hücreleri 4 °c ‘ de 5 dakika santrifüjler. Süpernatant aspirate. Hücreler 12 mL tümör hücre bakım ortamı (adım 1,3 ‘ de açıklandığı gibi) yeniden resuspend. Pipet yukarı ve aşağı 3-5 kez karıştırın. Hücreleri bir T75 hücre kültürü Flask içine aktarın. % 5 CO2Ile 37 °c ‘ lik kuluçte hücreleri büyütün. Tümör hücre bakım ortamını 4 °C ‘ ye geri koyun. 2. gün: Mikroskobun altındaki hücreleri kontrol edin. Gerekirse ortamı değiştirin. Hücreler kültürde bir tek tabakalı içinde büyüymelidir. 3. gün: Çözülme MV-4-11 hücreleri MV-4-11 kültür ortamını (1,2 adımda açıklandığı gibi), 37 °C su banyosunda 20 dakika ısıtın.Not: MV-4-11, belirli bir çalışmanın ihtiyacının bağlı olduğu birincil makrofajlar veya diğer makrophaj hücre çizgilere değiştirilebilir. Dondurulmuş MV-4-11 hücreleri sıvı nitrojen tankından alın. 37 °C su banyosundan 2 dakika boyunca hücreleri çözün.Dikkat: Sıvı nitrojen tankından hücreleri alırken dikkatli olun. Gerektiğinde termal koruma ve güvenlik gözlükleri ile eldiven giyin. % 70 etanol ile doku kültürü kaput yüzeyi sprey ve kağıt havlular ile yüzeyde% 70 etanol silin. Sprey kriyojenik şişeler içeren hücreler ve orta şişe 70% etanol ile, temizle 70% etanol kağıt havlu ile yüzeyde, ve doku kültürü kaputu içine getirmek. 5 mL MV-4-11 kültür ortamının pipet (1,2 adımda açıklandığı gibi) 15 mL steril santrifüj tüpüne yerleştirin. Tümör hücrelerini içeren tüpü 4-6 kez karıştırarak tersine çevirin. Tüm hücreleri 15 mL santrifüj tüpüne pipet. Karışım santrifüj tüp 4-6 kez tersine çevirin. 200 x g ‘de hücreleri 4 °c ‘ de 5 dakika santrifüjler. Süpernatant aspirate. Hücreleri 10 mL PBS ‘de yıkayın ve 200 x g ‘de 4 °c ‘ de 5 dakika boyunca hücreleri santrifüjün. Süpernatant aspirate. 12 mL MV-4-11 kültür ortamı (adım 1,2 ‘ de açıklandığı gibi) hücreleri resuspend. Yavaşça yukarı ve aşağı 3-5 kez karıştırmak için pipet. Hücreleri bir T75 hücre kültürü Flask içine aktarın. % 5 CO2Ile 37 °c ‘ lik kuluçte hücreleri büyütün. Tümör hücrelerini bölme Serum içermeyen kök hücre ortamını (1,1 adımda açıklandığı gibi) 37 °C ‘ lik su banyosunda 20 dakika ısıtın. % 70 etanol ile doku kültürü kaput yüzeyi sprey ve kağıt havlular ile yüzeyde% 70 etanol silin. Buzdolabından hücre dekolmanı çözümünü alın. % 70 etanol ile orta ve hücre dekolmanı solüsyonu şişeleri sprey, kağıt havlu ile yüzeyde% 70 etanol silin ve doku kültürü kaputu içine getirmek.Not: Accutase hücre dekolmanı çözümünü önceden ısıtmayın. Tümör hücre kültürünü kuluçoradan doku kültürü kaputu içine aktarın. Orta aspirate, Flask içine hücre dekolmanı çözüm 2 mL ekleyin.Not: Accutase eklemeden önce PBS ile durulama burada isteğe bağlıdır. Kaput içinde Flask ayarlayın. Tümör hücrelerinin her dakika yuvarlamak olup olmadığını kontrol edin. Tümör hücrelerinin yuvarlandıktan sonra, hafifçe Flask tarafına dokunun hücreleri Flask ayırmak yardımcı olmak için. Pipet 8 mL serum-ücretsiz kök hücre orta Flask içine, pipet yukarı ve aşağı 3 kez karıştırın, ve bir 15 mL steril santrifüj tüp içine hücreleri aktarmak. 200 x g ‘de hücreleri 4 °c ‘ de 5 dakika santrifüjler. Süpernatant aspirate. Hücreleri 10 mL PBS ‘de yıkayın. Pipet yukarı ve aşağı 3-5 kez karıştırın. 200 x g ‘de hücreleri 4 °c ‘ de 5 dakika santrifüjler. Süpernatant aspirate.Not: Bu adım isteğe bağlıdır. Hücreleri 10 mL serum-ücretsiz kök hücre Orta (adım 1,1 ‘ de açıklandığı gibi) resuspend. Pipet yukarı ve aşağı 3-5 kez karıştırın. 10 μL hücre alın ve 10 μL tripan mavi çözeltisi ile karıştırın. Sayım kaydırağı içine karışımı 10 μL pipet, otomatik bir hücre sayacı kullanarak yaşam hücresi numarasını ölçmek. Hücre yoğunluğunu 2,5 x 105 hücre/ml ‘ye serum içermeyen kök hücreli Orta (adım 1,1 ‘ de açıklandığı gibi) ve 2 ml hücrelerinin her bir 6-well hücre kültürü plakasının her bir kuyusu içine ayarlayın. Her hücre türü için, tohum 3 kuyular (triplicate örnek). Aynı zamanda, 2 mL serum içermeyen kök hücre orta ile 6 kuyu hazırlayın (hücre yok).Not: Bu numuneler kullanılacaktır: 1) negatif kontroller olarak ve 2) hücre numaralarını temel alan orta hacmi ayarlamak için. 5% CO2Ile 37 °c ‘ lik kuluçte 6-kuyu plakaları koyun. Hücrelerin 24 saat boyunca büyümesine izin verin. 3. In vitro Makrophaj cazibe assay Şartlama medyanın hazırlanması Tümörün hücre bakım ortamını (1,3 adımda açıklandığı gibi) 37 °C ‘ lik su banyosunda 20 dakika ısıtın. % 70 etanol ile doku kültürü kaput yüzeyi sprey ve kağıt havlular ile yüzeyde% 70 etanol silin. Buzdolabından hücre dekolmanı çözümünü alın. % 70 etanol ile orta ve hücre dekolmanı çözeltisi şişeleri sprey, kağıt havlu ile yüzeyde% 70 etanol silin ve doku kültürü kaputu içine getirmek. Altı-kuyu plakasını kuluçvandan çıkar. Klima ortamını 15 mL steril santrifüjün tüplerine dikkatlice takın. Tüpleri buz üzerine koy. Medyayı “sadece medyada” iyi bir şekilde ayrı bir 15 mL steril santrifüj tüpüne pipet.Not: Bu adımdan önce, hücrelerin iliştirilmeli olup olmadığını görmek için mikroskop altında kontrol ettiğinizden emin olun. Değilse, bir daha iyi ek izin vermek veya sayma adımda yüzen hücreleri dahil etmek için adım 2.4.8 kaplı plakaları kullanabilirsiniz. 6-well plaka her iyi içine hücre dekolmanı çözeltisi 0,5 mL ekleyin. Tümör hücrelerinin her dakika yuvarlamak olup olmadığını kontrol edin. Tümör hücreleri yuvarlandıktan sonra, hücrelerin ayrılmasına yardımcı olmak için plakanın tarafına hafifçe dokunun. Pipet 2,5 mL tümör hücre bakım orta içine kuyu, pipet yukarı ve aşağı 3 kez karıştırın ve 15 mL steril santrifüj tüp içine hücreleri aktarmak için. 10 μL hücre alın ve 10 μL tripan mavi çözeltisi ile karıştırın. Sayım kaydırağı içine karışımı 10 μL pipet ve otomatik hücre sayacı kullanarak yaşam hücrelerinin sayısını ölçmek. Serum serbest kök hücre ortamını kullanarak (37 °C inkübasyon), hücre numarasına göre, şartlı medyanın hacmini ayarlayın. Örneğin, Eğer Iyi A en az sayıda hücre ile iyi olarak 3x birçok canlı hücre varsa, onun şartlık medya 1:3 seyreltmeli. Bu adım, hücre proliferasyon oranı nedeniyle fark kontrol etmek için kullanılır.Not: Serum ücretsiz kök hücre orta 37 °C inkübasyon bir gecede kullanmak için neden uzun süreli 37 °C pozlama ile medyada olası değişikliği kontrol etmektir. 0,45 μm filtrelerle, şartların bulunduğu medyayı filtreleyin. Klima ortamını buz üzerine koyun.Not: Bu adım, hücreleri ve hücre enkaz şartında ortam kaldırır. MV-4-11 hücrelerinin hazırlanması 37 °C su banyosundan 20 dakika boyunca ıMDM ortamını (FBS olmadan) ısıtın. % 70 etanol ile doku kültürü kaput yüzeyi sprey ve kağıt havlular ile yüzeyde% 70 etanol silin. % 70 etanol ile orta şişe sprey, kağıt havlu ile yüzeyde% 70 etanol silin ve doku kültürü kaputu içine getirmek. MV-4-11 hücrelerinin dokusunu doku kültürü kaputu içine alın. 15 mL steril santrifüj tüpüne 10 mL hücreli pipet takın. 10 μL hücre alın ve 10 μL tripan mavi çözeltisi ile karıştırın. Sayım kaydırağı içine karışımı 10 μL pipet ve otomatik hücre sayacı kullanarak yaşam hücrelerinin sayısını ölçmek. 4 °C ‘ de 5dk için 200 x g ‘de hücreleri santrifüjler. Süpernatant aspirate. Hücreleri 10 mL PBS ile yıkayın ve 200 x g ‘de 4 °c ‘ de 5 dakika boyunca hücreleri santrifüjün. Süpernatant aspirate. 1×106 hücrelerin/ml son hücre yoğunluğu için imdm Orta (FBS olmadan) hücreleri resuspend.Not: Burada kullanılan makrofajlar hücre sayısı ayarlanabilir. Transwell tahlilNot: Bu adım için, bir hücre geçiş tahlil kiti kullanın veya reaktifler satın almak ve ayrı olarak ekleyin. MV-4-11 hücreleri için 5 μm gözenek boyutuna sahip Transwell ekler ‘i seçin. Makrophaj göçü algılamak için, alt odada makrofajların sayısını doğrudan ölçmek veya kolorimetrik/Fluorimetrik yöntemleri kullanın. Burada, biz kolorimetrik yöntemi kullanarak tahlil göstermektedir. 24 kuyu plakasını, kesici uç ve Reaktifleri oda sıcaklığına getirin. Her bir eklemin üzerine hazırlanan MV-4-11 hücreleri 250 μL ekleyin. 400 μL ‘ye sadece (37 °C ‘ de gece kuluçla), 24 kuyu plakasının alt odalarına negatif kontrol olarak hizmet vermektedir. Her tümör hattı veya kontrolü için, triplicate örnekleri kullanın. Ekleme ve şartlık orta arasında kabarcıklar kaçının. Kabarcıklar alt kuyuları göç makrofajlar inhibe edecektir. 4 h için 5% CO2 Ile 37 °c ‘ lik kuluçte plakalarını inkük.Not: İnkübasyon süresi ayarlanabilir. Alt odalarına göç eden hücreler mikroskop altında görülebilir. Hafifçe aynı kuyu iç duvarındaki ekle dokunun ve kesici uç atın. MV-4-11 hücreleri süspansiyon içinde büyüyünce, hücre dekolmanı çözeltisi veya tripsin tedavisi burada gerekli değildir. Yavaşça yukarı ve aşağı kuyuların hücreleri 3 kez karıştırın pipet. 225 μL hücre süspansiyonunu floresan ölçümü için uygun siyah duvarlı 96-kuyu plakasına aktarın. 4X liziz tampon ile CyQuant boya 1:75 seyreltin. Vortex kısaca ve çözelti aşağı spin. 96-kuyu plakasının her bir kuyusu için 75 μL çözüm ekleyin. Oda sıcaklığında 15 dk. inkulat. Flüoresan plaka okuyucu ile 480/520 nm filtre seti kullanılarak floresan okuyun. Boş ve normalleştirme kontrol tümörü hücre hattına çıkararak verileri analiz edin.

Representative Results

Sonuçlar genellikle çubuk grafiklerle gösterilecektir (örnek Şekil 1′ de gösterilir). Yüksek 480/520 değerlere sahip numuneler, şartların makrofajları işe almak için yüksek kapasiteye sahip olduğunu gösterir. Deneysel ihtiyaca bağlı olarak, ek kontroller dahil edilebilir. Örneğin, bir nötralize antikorlar makrofaj chemotaxis kaldırılması için şartlı medya tedavi ve aynı tahlil gerçekleştirmek için kullanabilirsiniz. Ayrıca, poz…

Discussion

Bu protokolde, birkaç anahtar adım vardır: 1) Transwell ekleme seçimi. MV-4-11 hücre hattı için 5 μm Transwell ekler iyi çalışır. Ancak, sık kullanılan monoksit hücre çizgisi THP-1 gibi diğer hücre çizgileri için farklı bir gözenek boyutu daha iyi çalışabilir. 2) farklı hücre hatları farklı hızlarda büyüyünce, hücre numaralarına göre şartlı medyanın hacmini ayarlamak önemlidir. Bu amaçla, aynı deneysel koşullar altında kuluzlanmış hücre içermeyen medya, şartlı medyayı se…

Materials

0.1 μm filtration cup	Thermo fisher	566-0010
0.45 μm filter unit	Millipore	SLHA033SS
10 mL serological pipettes	Olympus plastics	12-104
15mL sterile centrifuge tubes	Olympus plastics	28-103
1 mL pipette tip	ART molecular bioproducts	2779-RI
2 mL aspirating pipet	Falcon	357558
24-well plate	Millipore	ECM507	Part of ECM507, or can be purchased separately
4x lysis buffer	Millipore	ECM507	Part of ECM507, or can be purchased separately
5 μm Transwell insert	Millipore	ECM507	Part of ECM507, or can be purchased separately
75cm2 flask	Corning	430641U
Accutase	Innovative cell technologies	AT-104
B27	Gibco	12587-010
CyQuant Dye	Millipore	ECM507	Part of ECM507, or can be purchased separately
DMEM	Gibco	11965-092
DMEM:F12	Gibco	10565-018
EGF	Peprotech	AF-100-15
FBS	Gibco	26140
FGF	Peprotech	100-18B
IMDM	Gibco	12440-053
PBS	Gibco	14190-144
Pen Strep	Gibco	15140-122
Trypan blue	Biorad	1450021