Yöntem makalesi

RNA 'nın ayak Izleri tanımlaması: proteinli kompleksleri RNA Immunoprecipitation ile tandem sonra sıralamayı (RIPiT-seq)

DOI:

10.3791/59913

⸱

10 Temmuz 2019

 ,  , 
1Department of Molecular Genetics, Center for RNA Biology, The Ohio State University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, endojen RNA bağlayıcı siteleri veya RNA: protein (RNP) kompleksler "ayak izleri" mammalin hücrelerden zenginleştirmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yaklaşım RNP alt paketleri iki immünoprecipitations içerir ve bu nedenle tandem RNA immünopresipitasyon dubbed (ripit).

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tandem içinde RNA immünopyemek (RIPiT) RNA: protein (RNP) kompleksinde bir çift proteinin RNA ayak izlerini zenginleştirmeye yarayan bir yöntemdir. RipIt iki arıtma adımlarını kullanır. İlk olarak, etiketli bir RNP altbirim immünoprecipitation hafif RNase sindirim ve sonraki Non-denaturing benzeşme elüsyon tarafından izlenir. Başka bir RNP altbirim ikinci bir immünoprecipitation tanımlanmış bir kompleks zenginleştirme sağlar. Rnas ve proteinlerin denatüre bir elüsyonu takiben, RNA ayak izleri yüksek verim DNA sıralı kütüphaneler dönüştürülür. Daha popüler ultraviyole aksine (UV) çapraz immünoprecipitation takip (CLIP) yaklaşım RBP bağlama siteleri zenginleştirin, ripit UV-çapraz bağımsız. Bu nedenle RIPiT RNA interactomunda mevcut olan çok sayıda proteinlere uygulanabilir ve bunun ötesinde RNA Yönetmeliği için önemlidir, ancak RNA veya UV-Crosslink ' e doğrudan temas etmez. RipIt 'deki iki arıtma adımları, başka bir cofactor ile ortaklık içinde ilgi gören bir protein olan bağlayıcı siteleri tanımlamanın ek bir avantajı sağlar. Çift arıtma stratejisi de arka plan sınırlandırarak sinyali artırmak için hizmet vermektedir. Burada, RIPiT 'i gerçekleştirmek ve yalıtılmış RNA ayak izlerinden yüksek verimlilik sıralaması kitaplıkları oluşturmak için adım akıllı bir prosedür sağlıyoruz. Ayrıca, RIPiT 'in avantajları ve uygulamalarını özetlemektedir ve bazı sınırlamalarını tartışırız.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücreler içinde RNA, RNA: protein kompleksler (RNPs) oluşturmak için proteinler ile kompleks içinde bulunmaktadır. RNPs RNA bağlayıcı proteinleri (RBPs, doğrudan RNA bağlamak olanlar) etrafında monte edilir ama aynı zamanda olmayan RBPs (Bu bind RBPs ama RNA değil) oluşur ve genellikle doğada dinamik. Rbps ve onların Kofaktörler düzenleyici işlevleri yürütmek için rnps içinde topluca işlev. Örneğin, anlamsız aracılı mRNA çürüğü (NMD) yolu, UPF proteinleri (UPF1, UPF2, ve UPF3b) zamanından önce sonlandırılmış ribosome tanır. UPF proteinlerinin her biri RNA 'ya bağlanabilirler, ancak sadece aktif bir NMD kompleksinin formaya başladığı zaman birlikte birleştiriyorlar. Bu....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. kararlı HEK293 hücre hatları tetracycline indüklenebilir bayrak-etiket faiz (POI) proteini Ifade kurulması

  1. Büyüme ortamında 10 x 104 hücre/ml yoğunluklu bir stabil entegre FLP rekombinasyon hedef (frt) sitesi Ile tohum HEK293 hücreler (Dulbecco modifiye kartal orta [dmem] + 10% fetal Sığır serum [FBS] + 1% penisilin-streptomisin [Penn/strep]) 6- iyi plakalar. Hücrelerin, 37 °C ve% 5 CO2 ' de nemlendirilmiş bir kuluçta gece büyüymesine izin verin (sonraki tüm adımlar için standart büyüme koşulları).
  2. Ertesi gün, hücreler ~ 70% confluent olmalıdır. Transfeksiyon reaktif protokolüne göre, pcDNA5-TETO-FLAG-POI: pOG44 9:1 oranınd....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Başarılı bir RIPiT, hem ilgi hem de diğer bilinen etkileşen proteinlerin immünoptitasyonu ve etkileşimsiz proteinlerin olmaması ile sonuçlanır. Şekil 3A'da görüldüğü gibi, hem MAGOH hem de EIF4AIII ripit elution 'da tespıt edildi, ancak HNRNPA1 (şerit 6) değildi. Paralel olarak, RNP kompleksleri ile birlikte arıtılmış RNA ayak izleri otoradyografi tekniklerinde (Şekil 3B) veya biyoanalizör (Şekil 3<.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz burada bazı önemli hususlar başarıyla RIPiT gerçekleştirmek için tartışmak. Her şeyden önce, her adımda mümkün olan en yüksek verimliliği elde etmek için bireysel IPS optimize edilmelidir. Burada açıklanan hücre giriş sayısı için Flag agaroz boncuk miktarı test ettiğimiz çeşitli proteinler için sağlam olduğu kanıtlanmıştır. Ortak proteinlerin sadece küçük bir kısmı olarak bayrak proteini ile Co-immunoprecip, etkili ikinci IP için gerekli antikor miktarı genellikle düşüktür (daha az 10 μg). Küçük ölçekli ripit (1 10 c.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma NıH Grant GM120209 (GS) tarafından destekleniyordu. Yazarlar, Hizmetleri için OSUCCC Genomics Shared Resources Core 'a teşekkür ederler (CCC destek Grant NCı P30 CA16058).

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Anti-FLAG Afinite JeliSigmaA2220
ATP, [γ-32P]- 3.000 Ci/mmol 10 mCi/mL EasyTide, 250 & mikro; CiPerkinElmerBLU502A250UC
BD Luer-Lok Uçlu Tek Kullanımlık Şırıngalar (200)Fisher14-823-435
Betain 5MSigmaB0300
biotin-dATPTriLinkN-5002
biotin-dCTPPerkin ElmerNEL540001EA
Branson Sonifier, Model SSE-1Branson
CircLigase IVWR76081-606ssDNA ligaz I
DMEM, Yüksek GlikozThermoFisher11995-065
DNA yük tamponuNEB NEB
Dynabeads Protein ALifeTech10002D
Flp-In-T-REx 293 Hücre HattıThermoFisherR78007
GeneRuler Düşük Aralıklı DNA MerdiveniThermoScientificFERSM1203
Higromisin BThermoFisher10687010
Mini-PROTEAN TBE Jel 10 kuyuluBio-Rad4565013
Mini-PROTEAN TBE-Üre JelBio-Rad4566033
miRCAT-33 adaptörü 5′-TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGddC-3′herhangi biriyalnızca Illumina dizileme platformu ile uyumludur
Mirus transIT-X2 transfeksiyon reaktifiMirusMIR 6004
Mth RNA ligazNEBE2610S
PE1.0 5′-AATGATACGGCACCGAGATCTACACT
CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3′		herhangi biriyalnızca Illumina sıralama platformu
PE2.0 5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTC
GGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATC*T-3&prime		herhangi biriyalnızca Illumina dizileme platformu ile uyumludur
Fenol/Kloroform/İzoamil Alkol (25:24:1, pH 6.7, 100 mLl)FisherBP1752I-100
Mor Jel Yükleme Boyası (6x)NEBNEB #7025
Q5 DNA PolimerazNEBM0491S/L
RNase I, E. coli, 1.000 UEppicenterN6901K
SPIN-X sütunuCorningCLS8160-24EA
Streptavidin boncuklarıThermoFisher60210
Üst Simge III (SSIII)ThermoScientific18080044ters transkriptaz enzimi
SybrGoldThermoFisherS11494altın nükleik asit jel boyası
T4 Polinükleotid Kinaz-2500UNEBM0201L
T4RNL2 Tr. K227QNEBM0351S
TetrasiklinSigma87128
Termostabil 5 ve akut; Uygulama DNA/RNA LigazNEBM0319S
TruSeq_SE1 5′-pGGCACTANNNNNAGATCGGAAGA
GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC
TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		herhangi biriyalnızca Illumina sıralama platformu ile uyumludur
TruSeq_SE10 5′-pGGTGTTCNNNNNNNAGATCGGAAG
AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT
CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		herhangi biriyalnızca Illumina sıralama platformu TruSeq_SE11
uyumludur 5′-pGGTAAGTNNNNNNAGATCGGAA
GAGCGTCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC
TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		herhangi biriyalnızca Illumina sıralama platformu TruSeq_SE12
5′-pGGAGATGNNNNNNAGATCGGAAGA
GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC
TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&prime ile uyumludur;		herhangi biriyalnızca Illumina sıralama platformu ile uyumludur
TruSeq_SE2 5′-pGGGTAGCNNNNNNAGATCGGAAGAG
CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT
CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		herhangi biriyalnızca Illumina sıralama platformu
TruSeq_SE35′-pGGTCGATNNNNNNNAGATCGGAAG
AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT
CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&prime ile uyumludur;		herhangi biriyalnızca Illumina sıralama platformu TruSeq_SE4
uyumludur 5′-pGGCCTCTCGNNNNNNAGATCGGAAGA
GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC
TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		herhangi biriyalnızca Illumina sıralama platformu TruSeq_SE5
uyumludur 5′-pGGTGACANNNNNNAGATCGGAAGA
GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC
TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		herhangi biriyalnızca Illumina sıralama platformu TruSeq_SE6
uyumludur 5′-pGGTAGACNNNNNAGATCGGAAGAG
CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGCTGAACCGCTCTTC
CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		herhangi biriyalnızca Illumina sıralama platformu TruSeq_SE7
uyumludur 5′-pGGGCCCTNNNNNNAGATCGGAAG
AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCT
TCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		herhangi biriyalnızca Illumina sıralama platformu ile uyumludur
TruSeq_SE8 5′-pGGATCGGNNNNNAGATCGGAAGAG
CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTT
CCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		herhangi biriyalnızca Illumina sıralama platformu TruSeq_SE9
uyumludur 5′-pGGACTGANNNNNAGATCGGAAGAG
CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC
CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		herhangi biriyalnızca Illumina sıralama platformu
Typhoon 5 Bimolecular ImagerGE Healthcare Life Science29187191
Bu protokollerden Bu protokollerden ile uyumludur;Bu protokollerden Bu protokollerden Bu protokollerden Bu protokollerden Bu protokollerden Bu protokollerden Bu protokollerden Bu protokollerden Bu protokollerden Bu protokollerden Bu protokollerden Bu protokollerden Bu protokollerden ile uyumludur

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Karousis, E. D., Nasif, S., Mühlemann, O. Nonsense-mediated mRNA decay: novel mechanistic insights and biological impact. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 7 (5), 661-682 (2016).
  2. Ivanov, P. V., Gehring, N. H., Kunz, J. B., Hentze, M. W., Kulozik, A. E.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

RNA ImmunoprecipitationRIPiT Seq MethodUV Crosslinking IndependentRNA Footprint AnalysisProtein Complex EnrichmentExon Junction ComplexHEK293 CellsFLAG Agarose BeadsMagnetic Bead ConjugationPhenol Chloroform Extraction

İlgili makaleler