Burada, immünororesans boyama ve DNA nokta-leke yöntemleri kullanarak, hücre ve beyin dokularında 5-hidroksimetilitozin tespit etmek için bir protokol salıyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Farelerin Nöral Kök Hücreleri ve Beyinlerinde 5-Hidroksimetilsitozozin Insaptama
Bu makalede
Özet
Özet
Memeli genomunda birden fazla DNA modifikasyonu tespit edilmiştir. Bunun 5-metilsitozin ve 5-hidroksimetilsitozin aracılı epigenetik mekanizmaları yoğun olarak çalışılmıştır. 5-hidroksimetilsitozin beynin embriyonik ve doğum sonrası gelişimi sırasında dinamik özellikler gösterir, gen ekspresyonunda düzenleyici bir işlev oynar ve birden fazla nörolojik bozukluklar yer almaktadır. Burada, kültürlü hücrelerde ve farenin beyin dokularında 5-hidroksimetilitozini saptamak için immünoresans boyama ve DNA nokta-leke dahil olmak üzere ayrıntılı yöntemleri açıklıyoruz.
Giriş
DNA modifikasyonu, histon modifikasyonu ve RNA modifikasyonu da dahil olmak üzere epigenetik modifikasyonlar, çeşitli biyolojik süreçler vehastalıklardatemel işlevleri oynamak için gösterilmiştir 1,2,3, 4.2.2 , 5.000 , 6.000 , 7. Uzun bir süre için, DNA metilasyon (yani, 5-metisitozin (5-mC)) son derece istikrarlı bir epigenetik belirteç olarak görülüyor ve daha fazla genom değiştirilemez. Son zamanlarda, 5-mC TET1, TET2 ve TET3
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm hayvan prosedürleri Zhejiang Üniversitesi Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Yetişkin Nöral Kök Hücre ve Nöronların Kültürü
- Daha önce açıklandığı gibi bir yetişkin (8-10 haftalık) C57/BL6 erkek fare ön beyin yetişkin nöral kök hücreleri izole31,32.
- DMEM/F-12 ortamlarında 20 ng/mL FGF-2, 20 ng/mL EGF, %2 B27 takviyesi, %1 antibiyotik antimikotik ve %5 CO2 inkübatörde 37 °C'de 2 mM L-Glutamin içeren yetişkin nöral kök hücreler. Daha önce açıklandığı gibi 1 μM retinoik asit ve 5 μM forskolin ile yetişkin nöral kök hücrelerin farklılaşma....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Erişkin farelerin hipokampusundaki 5-hmC dağılımını ortaya çıkarmak için nöronal hücrelere (NeuN) ve 5-hmC'ye karşı antikorlarla immünorfloresans uyguladık. Hipokampus, 5-hmC nöronal hücre belirteci NeuN ile iyi lokalize (Şekil 1A-H), nöronlarda 5-hmC bir zenginleştirme düşündüren.
Nöronal gelişim sırasında 5-hmC'nin dinamiklerini belirlemek için ilk olarak çoğalan ve farklılaşmış erişkin nöral kök hücrelerden (NSC) izole edilmiş DNA örnekleri ile.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Epigenetik modifikasyonlar beyin gelişimi, olgunlaşma ve fonksiyon sırasında önemli roller oynar. DNA modifikasyonu için kararlı bir belirteç olarak, dinamik 5-hmC davranışsal adaptasyon, nöronal aktivite yanıt verir ve pozitif gen ekspresyonu ile ilişkilidir; böylece, beyin ve nörolojik bozukluk4normal fonksiyonu nda yer almaktadır. Hücre ve dokularda işlevini keşfetmek için, 5-hmC varlığını tespit etmek ve tedavi öncesi ve sonrası düzeyini karşılaştırmak için gereklidir. Burada, laboratuvarda or.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Rakip finansal çıkarlar yok.
Teşekkürler
XL kısmen Çin Ulusal Temel Ar-Ge Programı (2017YFE0196600) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Grant No. 31771395, 31571518) tarafından desteklenmiştir. S.S. Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (2017YFC1001703) ve Zhejiang Eyaleti Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (2017C03009) tarafından desteklenmiştir. W.X. Zhejiang Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (LY18H020002) ve Zhejiang Eyaleti Bilim Teknolojisi Bölümü (2017C37057) tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 4'-6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) | Sigma-Aldrich | D8417 | |
| Adobe Photoshop yazılımı | Adobe Inc. | / | |
| Alexa Fluor 488 keçi anti-tavşan IgG | Thermo Fisher | A11008 | |
| Alexa Fluor 568 keçi anti-fare IgG | Thermo Fisher | A11001 | |
| anti-5-hidroksimetilsitozin | Aktif Motif | 39769 | |
| anti-NeuN | Millipore | MAB377 | |
| B27 takviyesi | Gibco | 12587-010 | |
| B27 takviyesi | Gibco | 12580-010 | |
| B27 takviyesi | Gibco | 17504-044 | |
| Kriyostat mikrotomu | Leica | CM1950 | |
| DMEM/F-12 orta | OmegaScientific | DM25 | |
| Epidermal büyüme faktörü | PeproTech | 100-15 | |
| Fibroblast büyüme faktörü-temel | PeproTech | 100-18B | |
| Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886 | |
| GlutaMax | Termo | 35050061 | |
| L-Glutamin | Gibco | 25030-149 | |
| Nörobazal ortam | Gibco | 21103-049 | |
| Normal keçi serumu | Vektör Laboratuvarları | Z0325 | |
| Naylon membran (Hybond ve ticaret; -N +) | Amersham Biosciences | ||
| EKİM | Leica | 14020108926 | |
| Kalem Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Fenol: kloroform: izoamil alkol (25: 24: 1 ) | Sigma-Aldrich | 516726 | |
| Poli-D-Lizin | Sigma | P0899-10 | |
| Proteinaz K | VVR | 39450-01-6 | |
| Retinoik asit | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| Triton X-100 | Solarbio | T8210 |
Kaynaklar
- Tan, L., Shi, Y. G. Tet family proteins and 5-hydroxymethylcytosine in development and disease. Development. 139 (11), 1895-1902 (2012).
- Yao, B., et al. Epigenetic mechanisms in neurogenesis. Nature Reviews Neuroscience. 17 (9), 537-549 (2016).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
