Yöntem makalesi

Hücresel Hareketin Mekanik Kontrolünün Ve İlgili Sinyal Olaylarının Değerlendirilmesi için Tek Hücreli Durotaksis Tsay

DOI:

10.3791/59995

⸱

27 Ağustos 2019

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, University of Vermont Larner College of Medicine, 2University of Vermont Cancer Center, 3Department of Molecular Physiology and Biophysics, University of Vermont Larner College of Medicine

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mekanik kuvvetler hücre göçlerini kontrol etmek için önemlidir. Bu protokol, hücre yapısı ve göç değişiklikleri ortaya çıkarmak için yerel bir sertlik gradyan ile hücreleri uyarmak için bir cam mikropipette ve bir mikromanipülatör kullanılarak deforme edilebilir elastik hidrojellerin kullanımını göstermektedir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Durotaksis, hücrelerin gerilim degradelerini algılama ve tepki verme sürecidir. Bu süreci in vitro olarak incelemek için, bir hücrenin altında yatan substrat sertliği manipüle edilmelidir. Dereceli sertlik ve uzun süreli göç testleri ile hidrojeller durotaksis çalışmalarında yararlı kanıtlanmış olsa da, substrat gerginliği yerel değişikliklere hemen, akut tepkiler bireysel hücre hareketleri ve subselliler sinyal olayları odaklanmış çalışma sağlar. Hücrelerin altta yatan substrat sertliğini algılama ve yanıt verme yeteneğini tekrar tekrar test etmek için, deforme edilebilir hidrojeller üzerinde kültürlenmiş bireysel hücrelere artan gerilimin akut degradelerinin uygulanması için değiştirilmiş bir yöntem kullanılır ve bu yöntem gerçek zamanlı olarak söz konusu hücrelere verilen sertlik degradelerinin gücü ve yönünün manipülasyonu. Ayrıca, mikropipetin şekli ve boyutları veya uygulanan degradenin göreceli konumu, yerleşimi ve yönü gibi tayın ayrıntılarını ve parametrelerini ince ayarlayarak, hassas hücre tipi ve sistemi. Bu parametreler, uygulanan uyaranları güvenilir bir şekilde değiştirmek ve talın işlevselliğini ve çok yönlülüğünü genişletmek için değiştirilebilir. Bu yöntem, değişen sertliğe yanıt olarak hem uzun süreli durotaktik hareketin hem de hücresel sinyalizasyon ve morfolojik dinamiklerde daha acil değişikliklerin incelenmesini sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Son birkaç on yıl içinde, bir hücrenin çevremekanik özelliklerinin önemi hücre biyolojisinde giderek daha fazla tanıma kazanmıştır. Farklı dokular ve hücre dışı matrisler farklı göreceli sertliklere sahiptir ve hücreler vücuda göç ettikçe, bu değişiklikleri yönlendirirler, bu mekanik özellikleri kullanarak onlara rehberlik ederler1,2,3 , 4.2.2 , 5.000 , 6.000 , 7. Hücreler geliştirme, yara iyileşmesi ve kanser metastazı gibi süreçler sırasında onların hareketli davranış bilgilendirmek için belirli bir doku sertliği kullanın. Ancak, bu mekanik girdilerin hissi ve yanıt sağlayan moleküler mekanizmalar büyük ölçüde bilinmeyen kalır1,2,3,4,5, 6.000 , 7 .

Hücrelerin fiziksel çevresel ipuçlarına yanıt verme mekanizmalarını incelemek için, alt tabakanın alt tabakadaki katılığı veya sertliği manipüle edilmelidir. 2000 yılında, Chun-Min Lo, Yu-Li Wang ve meslektaşları değişen mekanik ipuçları için bireysel bir hücrenin hareketli yanıt doğrudan deforme ekstrasellüler matriks (ECM) kaplı poliakrilamid germe tarafından test edilebilir böylece bir test8 geliştirdi hücrelerin kaplandığı hidrojeller. Hücreler daha sert yüzeylere göç etmek için önemli bir tercih sergilerler, bu fenomen "durotaksis" olarak adlandırılır.

2000 yılında orijinal raporundan bu yana, birçok diğer teknikler durotaksis çalışmaları için istihdam edilmiştir. Dik sertlik degradeleri polistiren boncuklar9 veya sert polimer direkleri 10 gibi sert özellikleri üzerinde jeller döküm tarafından imal edilmiştir veya mekanik oluşturmak için bir cam kapakları11 kenarlarında substrat polimerize tarafından ' adım-sınırlar'. Alternatif olarak, sığ ama sabit sertlik gradyanları ile hidrojeller mikroakışkan cihazlar12tarafındanoluşturulan crosslinker gradyanları 12,13 veya yan yana hidrojel çözelti damlacıkları gibi çeşitli yöntemler tarafından imal edilmiştir farklı sertlik8, veya doğrusal sertlik gradyan oluşturmak için dereceli UV ışık maruziyeti ile tedavi fotoreaktif crosslinker ile hidrojeller14,15. Bu teknikler zaman içinde kitlesel durotaktik hücresel hareketi araştırmak için büyük etkisi kullanılmıştır. Ancak, tipik olarak bu özellikler hücre kaplaması öncesinde imal edilir ve özellikleri mekanik degradelerin örneklemesi için rastgele hücre hareketine güvenerek deney boyunca tutarlı kalır. Bu tekniklerin hiçbiri akut mekanik uyaranlara yanıt olarak hücresel davranışta hızlı değişikliklerin gözlemleneme elverişli değildir.

Mekanik ortamdaki akut değişikliklere hücresel tepkileri gözlemlemek için, tek hücreli durotaksis tahlilleri çeşitli avantajlar sunar. Bu tahlillerde, tek tek hücrelere, altta yatan substratı cam bir mikropipetle hücreden çekerek akut, mekanik bir uyarıcı verilir ve bu da hücre-matris geriliminin yön gradyanı nı ortaya çıkarır. Geçiş hızı veya yönü gibi hareketli davranıştaki değişiklikler daha sonra canlı hücre faz kontrast mikroskobu ile gözlenir. Bu yaklaşım, gerilim degradesinin yönünün ve büyüklüğünün hızlı, yinelemeli manipülasyonuna ve buna bağlı olarak değerlendirilmesine olanak sağladığından, mekanik uyaranlar ve hücre göçü arasındaki neden-sonuç ilişkilerinin doğrudan gözlemleni kolaylaştırır. gerçek zamanlı hücresel tepkiler. Ayrıca, bu yöntem, mechanosensing ve dahil olduğundan şüphelenilen proteinlerin miktarı, aktivitesi veya hücre altı lokalizasyonu değişiklikleri görselleştirmek için floresan füzyon proteinleri veya biyosensörler ifade hücreleri mekanik olarak uyarmak için kullanılabilir ve durotaksis.

Bu teknik durotaksis8,16 çalışma grupları tarafından istihdam edilmiştir ve burada Howe Laboratuvarı tarafından SKOV-3 yumurtalık kanseri hücrelerinin durotaktik davranışı ve moleküler mekanizmaları incelemek için adapte olduğu gibi tanımlanmıştır underly durotaxis17. Ayrıca, değiştirilmiş bir yöntem hücre kültürü yüzeyine yakın floresan mikroküreler tek, hatta tabaka ile hidrojellerin imalatı için açıklanmıştır; mikropipet tarafından üretilen gerinim gradyanlarının görselleştirilmesini ve optimizasyonunu kolaylaştırır ve çile kuvvet mikroskobu ile hücre kontraktilliğinin değerlendirilmesini sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Gömülü Floresan Mikroküreler ile Deforme Polyakrilamid Hidrojellerin İmalatı

NOT: Yönler, 22 μm çapında ve yaklaşık 66 m kalınlığında 25 kPa hidrojelin polimerizasyonunu tanımlar. Bu parametrelerin her biri veya tümü değiştirilebilir ve bunu yapmak için yol tarifi Tablo 1'de ve17.

  1. Cam dipli tabakların veya kapak kapaklarının aktivasyonu
    1. Bir cam tabanlı görüntüleme çanağının veya canlı hücre görüntüleme odasına sığan bir kapak kaymasının aktivasyonu için bağlama silane çalışma çözümünü hazırlayın. Mix 950 μL 950% etanol, 50 μL buzul asetik asit, ve 5 μL bağlayıcı silane (y-methacryloxypropyltrimethoxysilane).
      NOT: Üst kapak kaymasına göre daha büyük bir alt kapak kayması kullanmak, jeli hazırlarken çalışmak için ek alan sağlayacak ve daha sonraki adımlarda cam mikropipetin inatla konumlandırılmasını kolaylaştıracaktır. Ayrıca, cam tabanlı görüntüleme çanak yerine coverslip kullanıyorsanız, aşağıdaki bölümde açıklandığı gibi coverslip temizleyin.
    2. Bir korona değnek ile 20 s cam yüzeyini etkinleştirin ve hemen bind silane çalışma çözeltisi 50 μL bindirme. Çözeltinin 10 dk kurumasını bekleyin.
    3. %95 etanol ile iki kez durulayın, sonra iki kez isopropanol ile ve daha sonra yaklaşık 20 dakika boyunca kapaklar airdry izin.
      NOT: Aktif cam lar bir haftaya kadar kurutucuda saklanabilir.
  2. Üst kapaklarıtemizleme
    1. 22 mm üst kapakları 70 °C'de %2 HCl'de 30 dakika kuluçkaya yatarak temizleyin, ardından ddH2O'da 10 dk boyunca iki kez yıkayın.
    2. 30 dk için 50 °C'de ddH2O'da %2 cuvette temizleme konsantresi ile kapakları kuluçkaya yatırın, ardından ddH2O'da 10 dk iki kez yıkayın.
    3. DDH2O'daki kapakları 90 °C'de 30 dakika, sonra 70 °C'de 10 dakika boyunca %70 etanolle ve 60 °C'de en az 2 saat kurulayın.
      NOT: Temizlenmiş kapaklar temiz bir kurutucuda süresiz olarak saklanabilir.
  3. Floresan mikrosfer/boncuk birikimi üst kapaklara
    1. Bir ultrasonik su banyosunda 1 saat için floresan mikrosferlerin stok çözüm Sonicate. Boncuk stoğunu 1:200'ü %100 etanolde seyrelterek çalışan bir boncuk çözeltisi yapın ve 1 saat boyunca tekrar sonicate yapın.
    2. Boncuk çözeltisi sonicating bitmiş önce 15 dk, iyice seramik bir kapak tutucu dikey yerleştirerek kapakları temiz ve bir masa üstü plazma temizleyici 3 dakika oda hava plazma ile tedavi.
    3. Sonraki adımlarda kapak kaymasının kullanımını kolaylaştırmak ve kaymayı önlemek için, bir parça parafilm'i 60 mm Petri kabıkapağına veya benzer bir kapta yerleştirin. Kapak kaymasını dengeleyiciye yerleştirin ve parafilm ile kapak kayması arasında iyi bir temas sağlayarak hafifçe aşağı dokunun.
    4. 22 mm'lik coverslip için, çalışan boncuk çözeltisinin 150 μL'sini coverslip'in üstüne ekleyin. Etanol çözeltisini hemen coverslip'in kenarından aspire edin ve boncukları kapak kaymasında bırakarak kapatın. Kapak kaymasının kurumasını bekleyin.
      NOT: Eklenen boncuk çözeltisi miktarı ~4 μL/cm2 olmalıdır ve herhangi bir boyut kapak lı slip uyacak şekilde ölçeklendirilebilir.
  4. Gömülü floresan boncuklu döküm hidrojeller
    1. Akrilamid ve bis-akrilamid hidrojel çözeltisi hazırlayın. Çözeltiyi Tablo1'e göre karıştırın, ardından 2,5 μL %10 APS ve 0,5 μL TEMED ekleyin. İyi bir şekilde karıştırın. Hemen bir sonraki adıma geçin.
      NOT: Hidrojel çözeltisi karışımı, Tablo1'de gösterildiği gibi akrilamid oranını bis-akrilamid'e değiştirerek Young'ın modülülü veya sertliğini değiştirmek için değiştirilebilir. Bu değerler Howe laboratuvarında atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak kullanılmak üzere doğrulanmıştır ancak kişinin kurum içinde doğrulanması gerekmektedir.
    2. Hidrojel çözeltisini yaptıktan hemen sonra, cam alt çanak veya alt kapak aktif tarafına 25 μL damla ekleyin, sonra hemen çözelti üzerine boncuk kaplı coverslip yerleştirin, boncuk tarafı aşağı. Yavaş düşürme nin ardından kapağın uzak tarafıyla damlaile temas etmek hidrojel içinde hava kabarcıkları yakalama önlemeye yardımcı olur.
      NOT: Hidrojelyüksekliği daha sonraki deneyde kullanılacak objektif lensin çalışma mesafesi içinde olmalıdır. 66 μm'lik bir hidrojel yüksekliği çoğu sistem için iyi çalışır. Hidrojelin boyutu, kapak kaymasının boyutuna bağlı olarak az ya da çok hidrojel çözeltisi eklenerek ölçeklendirilebilir. Hidrojel çözeltisinin uygun hacmini hesaplamak için, bir silindirin hacmi için denklemi kullanın, V = πr2h nerede r kapak yarıçapı ve h istenilen hidrojel yüksekliğidir. Tipik olarak, bu hesaplama, hem üst hem de alt kısmında boncuk kaplı kapaklı bir jel hazırlanarak ve iki boncuk düzlemi arasındaki mesafeyi ölçmek için bir konfokal mikroskop kullanılarak ölçüldüğünde, hidrojelin gerçek yüksekliğini doğru bir doğrulukla tahmin eder. Ancak hidrojelin gerçek yüksekliğinin ± 20 μm(örn. üst cam kapak kaymasının kalınlığına ve üreticisine bağlı olarak) bu hesaplamadan sapabileceği gözlenmiştir. Yukarıda açıklanan yöntemle jel yüksekliğinin doğrudan ölçülmesi önerilir.
    3. Jel 30 dakika polimerize izin verin, sonra forseps ile yavaşça üst kapak kayma sını çıkarın. Tabağa 50 mM HEPES pH 8.5 eklemek çıkarılmasını kolaylaştırabilir. 50 mM HEPES pH 8.5 üç kez 5 dakika yıkayın.
  5. Hidrojel aktivasyonu ve hücre dışı matris kaplama
    1. 50 mM HEPES pH 8.5'te 0.4 mM Sulfo-SANPAH (sulfosuccinimidyl 6-(4'-azido-2'-nitrofenilamino) hekzanomino su yüzüne inküterek hidrojel yüzeyini aktif hale getirin. Hemen kapalı bir alanda bir UV ark lambası maruz.
      NOT: Sulfo-SANPAH'ı aktivasyondan önce ışıktan koruyun. 400 W'lık bir lamba için jeli ampulden 10 cm uzakta ışık kutusu içinde yerleştirin ve 100 s boyunca aydınlatın. Sulfo-SANPAH çözeltisi parlak turuncudan koyu kahverengiye dönüşür.
    2. 50 mM HEPES pH 8.5 üç kez 5 dakika yıkayın.
      NOT: Sulu jeller 4 °C'de bir haftaya kadar saklanabilir.
    3. Aktif hidrojeli 50 mM HEPES pH'da 20 μg/mL fibronektin olarak kuluçkaya yatırın ve 1 saat 37 °C'de.
    4. Fibronektin çözeltisini aspire edin ve fosfat tamponlu salinde (PBS) 5 dakika yıkayın. Düşük hacimli bir doku kültürü kaputunda UV ışığı altında 15 dakika boyunca hidrojeli ve yemeğin kapağını sterilize edin. Steril PBS'de bir kez yıkayın.
      NOT: Kollajen ve laminin de dahil olmak üzere hidrojel kaplamak için ecm protein diğer türleri kullanılabilir.

2. Kaplama hücreleri

  1. ~1000 hücre/cm 2'lik son hücre yoğunluğu için 60 mm'lik bir kabı doldurmak için21.000 hücre içeren 3 mL ortam ekleyin. Kalabalığı önlemek ve tek tek hücrelerin serbest dolaşımını sağlamak için tohumlama yoğunluğunu gerektiği gibi ayarlayın.
  2. Hücrelerin görüntülemeden önce en az 4 saat ve 18 saate kadar 37 °C'de iyileşmesini bekleyin. Görüntüleme ortamı eklemeden önce iki kez görüntüleme ortamıile durulayarak görüntülemeye hazırlanın. Hücrelerin görüntülemeden önce en az 30 dakika boyunca dengede durmasını bekleyin.
    NOT: Kullanılan hücre hattındageçişi en iyi duruma getirecek koşulları belirlemek için ortam koşullarını önceden ekran. SKOV-3 hücreleri için, fenol kırmızısı olmayan, 20 mM HEPES ve 12.5 ng/mL epidermal büyüme faktörü içeren DMEM en fazla göçü uyarır. Ref52 hücreleri için en uygun koşullar % 10 fetal sığır serumu (FBS) ve 25 ng/mL trombosit kaynaklı büyüme faktörü ile Ringer's Tampon'dur.

3. Cam mikropipet hazırlanması: pipet çekme ve dövme

  1. 100 mm uzunluğundaborosilikat cam mikropipetleri 1,0 mm dış ve 0,58 mm iç çapı ile iki adımlı bir işlemle çekin ve ilk milimetrede ~50 μm'ye kadar inen ve son milimetrede uzun, paralel 10 m çapındaki bir tüpe kadar uzanan 2 mm'nin üzerinde bir konik elde edin.
  2. Yük bir mikroforge içine pipet çekti. Pipeti, pipetin geri kalanından ~35° açıyla bükülmüş 250 μm'lik bir bölümün tam ucunda ki 15 μm'lik körelmiş bir ucu olacak şekilde şekillendirin. Bükümde yaklaşık çapı ucuna mukavemet vermek için yaklaşık 30 μm olmalıdır.
    NOT: Konik ve uç boyutları istenilen kuvveti doğru şekilde uygulayacak şekilde ayarlanabilir (bkz. adım 5). Mikropipetlerin ilk adım için 65 °C'de, ikinci adım için 60 °C'de çekilmesi, 3.1. Farklı pipet çekmeceleri kullanılarak elde edilebilecek sonuçlar değişebilir.
  3. Kullanmadan önce mikropipeti %70 etanol ile sterilize edin.

4. Mikromanipülatör ve mikropipetin konumlandırılması

  1. Çanak kapağını çıkarın ve yemeği mikroskop aşamasına ve merkezine yükleyin. 10X veya benzer şekilde düşük büyütme hedefi kullanın. Ortamın buharlaşmasını önlemek için ortamı mineral yağile kaplayın.
  2. Çekilen pipet inserting
    1. Çekilen pipeti mikropipet kılıfına takın ve kancayı çanağa doğru takın. Kancaucu jel indirildiğinde en düşük noktası olacaktır.
    2. Kılıfı mikromanipülatöre yerleştirin ve pipetin ucu hem X hem de Y yönünde objektif lens üzerinde ortalanana kadar ayarlayın.
    3. Boruyu kaba manipülatör kullanarak sıvının yüzeyine dokunana kadar indirin.
  3. Faz kontrastı veya brightfield kullanarak, jel üstündeki boncuk tabakası üzerinde mikroskop odak. Bu referans düzlemi olacak.
  4. Hedefin numuneye veya sahneye çarpma tehlikesi olmadığından emin olun, odak düzlemine gölge düşürmek için X ve Y yol tarifindeki kaba manipülatörün küçük ayarlarını kullanarak mikropipetin ucunu bulmak için jelin üzerine odaklanın. Sadece pipetin çok ucu görüş alanında olduğundan emin olduğunuzda mikropipet indirin.
  5. Mikropipetin körelmiş ucunun, pipeti kılıftaki döndürülerek veya ucu odak düzlemine dik olana kadar mikromanipülatördeki kılıfı döndürerek aşağı doğru işaret ettiğinden emin olun. Gerektiğinde 4.4 ve 4.5 adımlarını tekrarlayın. Borunun ucuna odaklan.
  6. Pipetin jel yüzeyinden ne kadar uzakta olduğunu ölçmek için jelin üst boncuk tabakasına geri odaklanın. Jel ve pipet ucu arasında bir parçası olan bir düzleme geri odaklanın. Orta odak düzlemine ulaşmak için pipeti yavaşça indirin.
  7. Mikropipetin ucundan çok sönük gölgeler kadar tekrar adım 4.6 hidrojel odaklanırken takdir edilebilir. Bir sonraki en yüksek büyütme ye yükselin.
  8. Mikropipetin çok ucunun gölgeleri ve kırılmaları boncuk tabakası odak düzleminde takdir edilene kadar mikromanipülörü düşürün.
  9. Deneyde kullanılacak olan büyütmeyi artırın. Hidrojel yüzeyinin hemen üzerinde gezinene kadar pipeti indirin.

5. Mikromanipülatör ve kuvvet üretimi kalibre

  1. Faz veya parlak alanda, hidrojel yüzeyine dokunmak için havada gezinen mikropipeti düşürün. Pipetin hidrojelle temas halinde nasıl göründüğünü gözlemleyin. X ve Y'deki ayarlamalar hidrojelin bu yönde çekilmesine ve saptırılsa ya da saptırılınana kadar Z'deki mikropipeti düşürmeye devam edin. Mikroküreleri veya yakındaki hücreleri güvenilir işaretler olarak kullanın.
    NOT: Mikromanipülatör faz kondansatör koluna veya tezgaha bağlıysa ve numune aşamasının kendisine bağlıysa, borunun kırılmasını veya hücreleri rahatsız etmesini önlemek için sahneyi hareket ettirmeden önce jeli her zaman devre dışı edin. Pipet kırılırsa, adım 3 ve adım 4'e geri dön.
  2. Jel meşgul hücreleri yoksun bir alan bulun. Her yöne çekin ve mikromanipülasyon jel deformasyon çevirir şekilde rahat olsun.
  3. Hiçbir manipülasyon ile boncuk alanıfloresan görüntüleri alın, pipet jel çekici ile, ve meşgul pipet jel çekerek ile. Bunu mikromanipülatördeki kene işaretleri, pipet ucunun çekmenin her aşamasında faz veya parlaklık alanında nasıl göründüğü ve ucun bu manipülasyonu kullanarak hareket ettiği mesafe ile ilgili iyi notlar alarak birkaç kez tekrarlayın.
  4. Daha önce açıklandığı gibi ImageJ kullanın16,17 göreceli boncuk deplasmanları ve kuvvet pipet nişan olmadan boncuk alanı ile boncuk alanı karşılaştırarak boncuk uygulanan hesaplamak için, jel meşgul ile boncuk alanı ve jel çekti.
  5. Gerilim uyaranını ince ayarlayabilmek için, farklı mikropipet ucu boyutları, hücreden uzaklıklar veya mikromanipülatörtarafından touchdown'un başlangıç noktasından çekilen mesafeyi kullanarak kuvvet uygulamasını karşılaştırın. Mikropipet ucu boyutunun kuvvet uygulaması üzerindeki etkisi kullanıcıya büyük esneklik sağlar, ancak boyutlar ve şekil önceden kalibre edilmiş ipuçlarına yakından benzese bile yeni mikropipetler için kuvvet haritaları oluşturma ihtiyacını da gösterir.

6. Durotaksis titretinin yapılması

  1. Deneyi gerçekleştirmeden önce, jeli bir hücrenin yakınına yerleştirip mikromanipülatör yeniden konumlandırıldığında hücrenin deformasyonunu gözlemleyin.
  2. Açık polaritesi olan ve yönlendirilmiş bir şekilde hareket eden hücreleri tanımlamak için 30 dakika boyunca hareket ediyor gibi görünen bir grup hücreyi izleyin.
  3. Tek, net bir yönde hareket eden bir hücre seçin ve ek bir 30 dakika için istenilen kare hızında izleyin.
  4. Hücreye uygulanan kuvvetlerin belirlenmesi veya hücre tarafından uygulanan gerilim isteniyorsa, her elde edinimde boncuk alan görüntülerini yakalayın. Eğer hücre izleme sırasında yön ünü değiştirirse, uyarımı zorlaştırmak için bu zor olacak gibi izlemek için farklı bir hücre seçin.
  5. Hidrojeli hücreden yaklaşık 50 μm uzağa titretin. Boruyu ön kenarın yakın tarafının önüne yerleştirin ve mikromanipülörü jelin ortogonal olarak hücrenin seyahat yönüne doğru deforme olması için hareket ettirin. Sertliğin akut, lokal degradesine yanıt verebilmek için hücreyi zaman içinde gözlemleyin.
    NOT: Burada verilen zamanlama SKOV3 veya Ref52 fibroblastlarının izlenmesinde etkilidir, ancak aralık ve genel zaman aralığı, gözlenen hücre tipine ve biyolojik olaya uygun olarak ayarlanmalıdır. Floresan mikroskopisi ile eşleştirme varsa, adım 6.5'ten hemen önce floresan edinimini duraklatın, mikropipeti konumlandırmak ve çekmek için faz kontrastı veya brightfield kullanın ve hemen sonra floresan edinimini yeniden başlatın.
  6. Pipet kayArsa veya degrade başka türlü rahatlamış veya serbest bırakılırsa, 6.2 ve 6.3 adımlarını yineleyerek yeni bir hücre bulun.

7. Durotaktik göç yanıtının belirlenmesi

  1. ImageJ19 veya başka bir görüntü analiz programını kullanarak, hücrenin ana kenarının ortası 0 dk ile 30 dk sonrası monitör (hücrenin orijinal yörüngesini yansıtan) ve ortası arasında başka bir çizgi arasında bir çizgi çizerek dönüş açısını hesaplayın hemen önce ve 80 dk sonra stimülasyonu ve bu iki satır arasındaki açı ölçme öncü.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yukarıda açıklandığı gibi mikropipetler (Şekil 1) hazırlanarak ve çekme kuvveti oluşumunu normalleştirerek (Şekil2 ve Şekil 3)birden fazla hücre hattı için optimal durotaktik koşullar tanımlanmıştır. Şekil4'te belirtildiği gibi bu tekniği kullanarak, hem SKOV-3 yumurtalık kanseri hücreleri17 hem de Ref52 sıçan embriyonik fibroblastları (Şekil5)cam mi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada gösterildiği tekrarlanabilir, tek hücreli durotaksis titreşme akut mekanik ipuçlarına yanıt olarak bir hücrenin göç davranışını değiştirmek için yeteneğinin değerlendirilmesi sağlar. Bu teknik aynı zamanda floresan mikroskobu ve uygun füzyon proteinleri veya biyosensörler ile birlikte mekanik stimülasyon saniye içinde veya daha uzun bir zaman ölçeği sırasında hücre altı sinyalizasyon ve sitoskeletal olayları incelemek için kullanılabilir durotaktik hareket. Bir hücrenin çevresiile ilişkisini anlamak, o ortamın hem...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Akrilamid %40  Ulusal TeşhisEC-810
Amonyum Persülfat FisherBP179-25
BD20A Yüksek frekans jeneratörüElektro Teknik Ürünler12011A115 V -  El Tipi Corona Değnek
Bağlama Silan (y-metakriloksipropiltrimetoksisilan) (Sigma AldrichM6514
Bis-akrilamid% 2 & nbsp;Ulusal TeşhisEC-820
Borosilikat cam kılcal damarlarDünya Hassas Aletler1B100-4
Branson 2510 Ultrasonik TemizleyiciBransonic40 kHz frekans
Kaba ManipülatörNarshigeMC35A
DMEMCorning10-013-CV
fenol kırmızısı Sigma Aldrich olmadan DMEMD5030
Çift Kademeli Cam Mikropipet ÇektirmeNarshigePC-10
Epidermal Büyüme FaktörüPeprotechAF-100-15
EtanolPharmco-aaper111000200
Fetal Sığır Serumu (Nitelikli Tek Atış)GibcoA31606-02
Fibronektin EMD MilliporeFC010
Fluosfer Karboksilat 0.2 um InvitrogenF8810, F8807, F8811
Fugene 6Roche18150911.5 & mu; g DNA / 6 μ L fugene 6 per 35 mm çanak
Buzul Asetik AsitFisher ChemicalA38SI-212
Cam Alt ÇanakCellVisD60-60-1.5-N
Cam Lamel ElektronMikroskobu Bilimleri72224-0122 mm, #1.5
HClJT Baker9535-03
Hellmanex III  Özel temizleme konsantresiSigma AldrichZ805939Lamelleri temizlemek için ddH2O'da %2 oranında kullanılır
HEPES tozuSigma AldrichH337550mM HEPES tamponu yapın, pH 8.5
Intelli-Ray 400 Kepenkli UV TaşkınUviton InternationalUV0338
İzopropanolFisher ChemicalA417-4
MicroforgeNarshigeMF900
MikromanipülatörNarshigeMHW3
Mineral YağSigma AldrichM5904
Nanopure Yaşam Bilimleri UV / UF SistemiBarnsteadD11931ddH2O
Nikon Eclipse TiNikon
OptiMEMInvitrogen31985062
Parafilm MBemis Company, IncPM-992
PBS139 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 28.6 mM Na2< / sub>HPO4< / sub>, 1.6 mM KH2< / sub>PO4< / sub>, pH 7.4
Trombosit Türetilmiş Büyüme Faktörü-BB (PDGF-BB)sigma AldrichP4056
Ref52Sıçan embriyonik fibroblast hücre hattı; DMEM'de Kültür + %10 FBS
Ringer Tamponu134 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2.4 mM CaCl2, 20 mM HEPES, 5 mM D-Glukoz, pH 7.4
SKOV-3Amerikan Tipi Kültür ToplamaDMEM'de Kültür + %10 FBS
Sülfo-SANPAH Covachem  12414-1
Masaüstü Plazma TemizleyiciHarrick PlazmaPDC-32G
TEMED Sigma AldrichT9281-50
, , Işık

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Acerbi, I., et al. Human breast cancer invasion and aggression correlates with ECM stiffening and immune cell infiltration. Integrative Biology (Camb. 7 (10), 1120-1134 (2015).
  2. Mekhdjian, A. H., et al. Integrin-mediated traction force enhances paxillin molecular associations and adhesion dynamics that increase the invasiveness of tumor cells into a three-dimensional extracellular matrix. Molecular Biology of the Cell. 28 (11), 1467-1488 (2017).
  3. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
  4. Lange, J. R., Fabry, B. Cell and tissue mechanics in cell migration. Experimental Cell Research. 319 (16), 2418-2423 (2013).
  5. Davidson, L. A., Oster, G. F., Keller, R. E., Koehl, M. A. Measurements of mechanical properties of the blastula wall reveal which hypothesized mechanisms of primary invagination are physically plausible in the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus. Developmental Biology. 209 (2), 221-238 (1999).
  6. Li, D., et al. Role of mechanical factors in fate decisions of stem cells. Regenerative Medicine. 6 (2), 229-240 (2011).
  7. Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression. Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).
  8. Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).
  9. Kuo, C. H., Xian, J., Brenton, J. D., Franze, K., Sivaniah, E. Complex stiffness gradient substrates for studying mechanotactic cell migration. Advanced Materials. 24 (45), 6059-6064 (2012).
  10. Breckenridge, M. T., Desai, R. A., Yang, M. T., Fu, J., Chen, C. S. Substrates with engineered step changes in rigidity induce traction force polarity and durotaxis. Cell and Molecular Bioengineering. 7 (1), 26-34 (2014).
  11. Goreczny, G. J., Wormer, D. B., Turner, C. E. A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro. Journal of Visualized Experiments. (102), e52949(2015).
  12. Hartman, C. D., Isenberg, B. C., Chua, S. G., Wong, J. Y. Vascular smooth muscle cell durotaxis depends on extracellular matrix composition. Proceedings of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 113 (40), 11190-11195 (2016).
  13. Vincent, L. G., Choi, Y. S., Alonso-Latorre, B., del Alamo, J. C., Engler, A. J. Mesenchymal stem cell durotaxis depends on substrate stiffness gradient strength. Biotechnology Journal. 8 (4), 472-484 (2013).
  14. Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response. PLoS One. 7 (10), e46107(2012).
  15. Martinez, J. S., Lehaf, A. M., Schlenoff, J. B., Keller, T. C. 3rd Cell durotaxis on polyelectrolyte multilayers with photogenerated gradients of modulus. Biomacromolecules. 14 (5), 1311-1320 (2013).
  16. Plotnikov, S. V., Pasapera, A. M., Sabass, B., Waterman, C. M. Force fluctuations within focal adhesions mediate ECM-rigidity sensing to guide directed cell migration. Cell. 151 (7), 1513-1527 (2012).
  17. McKenzie, A. J., et al. The mechanical microenvironment regulates ovarian cancer cell morphology, migration, and spheroid disaggregation. Scientific Reports. 8 (1), 7228(2018).
  18. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  19. Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
  20. McKenzie, A. J., Campbell, S. L., Howe, A. K. Protein kinase A activity and anchoring are required for ovarian cancer cell migration and invasion. PLoS One. 6 (10), e26552(2011).
  21. Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in Cell Biology. 83, 29-46 (2007).
  22. Plotnikov, S. V., Sabass, B., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. High-resolution traction force microscopy. Methods in Cell Biology. 123, 367-394 (2014).
  23. Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (91), 51873(2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Mechanical MicroenvironmentHydrogel Stiffness GradientMicropipette ManipulationReal time Mechanical StimulationCell Migration BehaviorSubcellular Signaling EventsFocal Adhesion FormationVinculin Tension SensorForster Resonance Energy Transfer

İlgili makaleler