Burada taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanılarak hassas doku örneklerinin görüntülenmesi için ayrıntılı işleme protokolleri salıyoruz. Üç farklı işleme yöntemi, yani, hexamethyl disilazana (HMDS) kimyasal kurutma, basit hava kurutma, ve kritik nokta kurutma sert yumurta kabukları hazırlamak için açıklanmıştır, erken gelişim aşamalarında embriyolar, ve mantar kültürleri sırasıyla.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Taramalı Elektron Mikroskobu için Embriyo, Yumurta Kabuğu ve Mantar Kültürünün İşlenmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Taramalı elektron mikroskobu (SEM) çeşitli biyolojik ve biyolojik olmayan numunelerin ultra-yapısal analizinde yaygın olarak kullanılmakla birlikte, farklı biyolojik numunelerin işlenmesinde kullanılan yöntemler benzersiz uygulamalar içerir. Örneklerin işlenmesi için literatürde açıklanan tüm geleneksel uygulamalar hala yararlı uygulamalar bulmak, ancak örnek hazırlama ince değişiklikler görüntü kalitesini değiştirebilir, hem de, eserler tanıtmak. Bu nedenle, analiz edilen doku tipine özgü benzersiz bir numune hazırlama tekniği nin kullanılması, ultrayapısal çözünürlüğe sahip kaliteli bir görüntü elde etmek için gereklidir. Bu çalışmanın odak noktası SEM kullanarak embriyolar, sert yumurta kabukları ve mantar kültürleri görüntüleme için en uygun örnek hazırlama protokolleri sağlamaktır. İncelenen üç farklı hassas biyolojik örnek için iyi sonuçlar vermek için aşağıdaki optimizasyonlar önerildi. %4 paraformaldehit veya %3 glutaraldehit ve ardından etanol serisi ile dehidratasyon gibi daha hafif fiksatiflerin kullanılması zorunludur. Slayt kültürleri tarafından elde edilen agar bloklar üzerindeki mantar miseli, doğrudan agar plakalarından alınan kültürlere göre daha iyi bir ultrayapısal bütünlük sağlar. HMDS ile embriyoların kimyasal olarak kurutulması, kritik nokta kurutmasına kıyasla yüzey gerilimi objeleri kullanılmadan kurutulmasını sağlar. HMDS, numuneler kurutma sırasında daha az kırılgan olduğundan büzülmenin neden olduğu çatlamaları önler. Ancak, mantar kültürü için, kritik nokta kurutma kimyasal kurutma ile karşılaştırıldığında kabul edilebilir görüntü kalitesi sağlar. Yumurta kabukları montajdan önce iyice yıkama ve hava kurutma dışında özel bir hazırlık adımı olmadan görüntülenebilir. Hazırlama metodolojileri, her denemede elde edilen kabul edilebilir görüntü kalitesine göre standartlaştırılmıştır.
Giriş
Taramalı elektron mikroskobu (SEM) ultrastrüktürel analizi ve hücre içi görüntüleme prokaryotların, bitkilerin ve hayvanların üç boyutlu profilini çıkarmak için ışık mikroskobunu tamamlar. Bir SEM'nin yüksek uzamsal çözünürlüğü, onu nanometreden mikrometre ölçeğine kadar numunelerin mikroyapısal özelliklerinin incelenmesi için mevcut olan en çok yönlü ve güçlü tekniklerden biri haline getirir. Kurutulmuş numuneler, fonksiyonel ilişkiler hakkında geçerli sonuçlar geliştirmenin temelini oluşturan, yoğun ayrıntılarla kompozisyon ve topografik yapılara çözülür1,2,3 , <....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
NOT: Bu çalışmada kullanılan boyalı kaplumbağa(Chrysemys picta)yumurtaları Mayıs-Haziran 2015-16 yılları arasında New York Çevre Bakanlığı'ndan alınan izinle Oswego New York'taki Rice Creek Saha İstasyonu'ndan toplanmıştır. Koruma (DEC).
1. SEM için embriyoları işlemek için kimyasal kurutma yöntemi
- Yuvalama mevsiminde tarla sitelerinden kaplumbağa yumurtaları toplayın. Kapaklı plastik kutulardan (L x W x H) 6,7 cm x 25,4 cm x 10,2 cm dolgulu yem ve turba yosunu (1:1 oran) nemli bir karışımla hazırlanan yatak makinesi ile doldurulmuş kuluçka odalarını önceden hazırlayın. Havalandırma yada kapak kenarları nda ve kapağında y....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Şekil 1, boyalı kaplumbağa(Chrysemys picta) embriyolarının taramalı elektron mikrografik analizini göstermektedir. Kimyasal kuruduktan sonra alüminyum saplara monte edilen bir yatak makinesinde toplanan ve kuluçkaya yatan boyalı kaplumbağa yumurtaları SEM görüntüleme için kullanılmıştır (Şekil 1A-E). Evre 12 embriyonun yanal görünümü kraniyofasiyal yapıları gösterir; maksiller önem mandibular ötesine uzanır ve iyi işaretlenmiş bir burun.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Çalışmamızda sem görüntüleme için üç farklı hassas biyolojik örnek hazırlamak için farklı fiksasyon ajanları, dehidratasyon ve kurutma yöntemleri test edilmiştir: embriyolar, yumurta kabukları ve mantar kültürleri. SEM genellikle yüzey analizi için kullanılır, bu nedenle fiksatif penetrasyon daha az endişe vericidir, ancak kötü sabit iç yapıların içe doğru küçülmeye veya/ve çökmüş yüzey yapılarına neden olacağı anlaşılmalıdır. Daha büyük doku örnekleri için de uzun fiksasyon süresi düşünülmelidir, fiksatif çözeltifikasyo.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Yazarlar Dr Daniel Baldassarre, SUNY Oswego yararlı tartışmalar ve el yazması üzerinde yorum için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Rice Creek Associate Grants, Oswego tarafından desteklenmiştir; Challenge Grants SUNY Oswego ve Ulusal Bilim Vakfı (NSF) PGL ve JG için Küçük Hibeler.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Slayt kültürleri için | Agar | Fischer Scientific | S25127A |
| Alüminyum pim saplaması | Tedpella | 16111 | 12,7 mm x 8 mm |
| BD Difco Susuz Kültür Ortamı: Patates Dekstroz Agar | BD 213400 | DF0013-17-6 | Mantar, maya ve küflerin izolasyonu ve yetiştirilmesi için ortam |
| Kloramfenikol | Fischer BioReagents | BP904-100 | Medya için antibiyotik |
| Kaba Vermikülit | Sera Megastore | SO-VER-12 | yatak ortamı |
| Şeffaf 12 kuyulu plaka | Corning | 07-201-589 | embriyo sabitlemek için |
| Lameller | Fischer Scientific | slayt | kültürü için |
| S17525B Kritik Nokta Kurutucu | Quorum CPD | EMS850 | kritik nokta kurutma |
| Kültür kapları | Fischer Scientific | 08 747B | ÇANAK PETRI 100X10MM 12/PK |
| Etanol | Fischer Scientific | A406P 4 | dehidrasyon ajanı |
| Forseps- Kova Cımbızı | Tedpella | 5804 | stil 4, uzunluk 108 mm, genişlik x kalınlık 0,017 x 0,17 mm |
| Gluteraldehit | Fischer Scientific | G151-1 | sabitleyici |
| Püskürtmeli kaplayıcı için altın hedef | DENTON VACUUM | TAR001-0158 | Altın Hedef, 2.375″ D X .002 ve Başbakan; |
| Heksametildisilazana | Fischer Scientific | C19479-5000 | kimyasal kurutma maddesi |
| Kim mendil | Kimtech | S-8115 | temizleme |
| Mikroskop slaytları | Thermo Scientific | 67-762-16 | slayt kültürü için |
| Mikroskopi Makas | Tedpella | 1327 | Çift uçlu, paslanmaz çelik, 100 mm L (3-5/8"). |
| Mikro makas | Tedpella | 1346 | Vannas tipi, düz, 80mm L |
| Moria Delikli Embriyo Kaşığı | Güzel Bilim Aletleri | 10370-17 | Uzunluk 14,5 cm, uç çapı 20 mm, kaşık derinliği 5 mm |
| Netwell Uçlar | Corning | 0330B09 | 15 mm 74 ve mikro uçlar; m Ağ Boyutu Polyester Membran, farklı çözücülere numune işleme sırasında kullanışlı taşıyıcılar olarak işlev görür |
| Paraformaldehit | Fischer Scientific | T353 500 | sabitleyici |
| Turba yosunu | Walmart- Miracle Gro | 551705263 | yatak ortamı |
| PELCO sekmeleri çift çubuklu karbon iletken bant | Tedpella | 5000 | 12 mm OD |
| Püskürtme kaplayıcı | DENTON VAKUM | MASASI V | ince metal kaplama |
| SEM | JEOL ABD | JEOL JSM 6610LV taramalı elektron kapsamı | elektron mikroskobu |
Kaynaklar
- Packard, M. J. Ultrastructural Morphology of the Shell and Shell Membrane of Eggs of Common Snapping Turtles (Chelydra serpentina). Journal of Morphology. 165 (2), 187-204 (1980).
- Solomon, S. E., Watt, J. M.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
