Burada, fenotitipleme ve fonksiyonel analiz için dorsal kök ganglion'undaki makrofajları hızla izole etmek için mekanik bir ayrışma protokolü salıyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Dorsal Kök Ganglion Makrofajlarının Hızlı İzolasyon
Bu makalede
Özet
Özet
Periferik sinir hasarı sonrası dorsal kök gangliyonunda bağışıklık hücreleri ve duyusal nöronlar arasındaki moleküler ve hücresel etkileşimleri incelemek için artan ilgi alanları vardır. Makrofajlar da dahil olmak üzere periferik monositik hücrelerin fagositoz, antijen sunumu ve sitokin salınımı yoluyla doku hasarına yanıt verebildiği bilinmektedir. Ortaya çıkan kanıtlar sinir hasarı bağlamında nöropatik ağrı gelişimi ve aksonal onarım dorsal kök gangliyon makrofajlar katkısı ima etmiştir. Hızla fenotipleme (veya "hızlı izolasyon") sinir yaralanması bağlamında dorsal kök ganglia makrofajlarının yanıtı bilinmeyen nöroimmün faktörleri belirlemek için istenir. Burada laboratuvarımızın enzimsiz mekanik ayrışma protokolü kullanarak dorsal kök ganglinden makrofajları nasıl hızlı ve etkili bir şekilde izole ettiğimizi gösteriyoruz. Örnekler hücresel stresi sınırlamak için boyunca buz üzerinde tutulur. Bu protokol standart enzimatik protokole göre çok daha az zaman alır ve floresan tarafından aktive edilen Hücre Sıralama analizlerimiz için rutin olarak kullanılmaktadır.
Giriş
Bağışıklık hücrelerinin periferik sinir hasarı sonrası nöropatik ağrıkatkıda önemli kanıtlar var1,2. Olgun makrofajlar da dahil olmak üzere periferik monositik hücrelerin fagositoz, antijen sunumu ve sitokin salınımı yoluyla doku hasarına ve sistemik enfeksiyona yanıt verebildiği bilinmektedir. Spinal dorsal boynuz sinir yaralanması kaynaklı mikroglia aktivasyonu paralel, dorsal kök gangliyonu makrofajlar (DRG) ayrıca sinir yaralanması sonra önemli ölçüde genişletmek3,4. Özellikle, makrofajlar DRG duyusal nöronlar ile etkileşime girerek periferik sinir....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm hayvan deneyleri California San Francisco Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı ve NIH Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Rehberi'ne uygun olarak gerçekleştirildi.
1. Deneysel farelerden lomber DRG toplamak
- Deneye başlamadan önce, 9 ciltlik ortayı 1 birim Ca++ /Mg++-free 10x HBSS ile karıştırarak yoğunluk gradyan ortamının (örneğin, Percoll) çalışma çözümünün hazırlanın. Buzda tut.
- % 2.5 Avertin ile fare anestezik. Hayvanın arka pençe kıskacına yanıt verilmemesi nedeniyle tamamen anestezi yediğini doğrulayın.
NOT: 6-8 haftalık....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
İzole hücreleri doğrulamak için, ilk Macrofaj Fas kaynaklı Apoptosis seçti (MAFIA) transgenik fareler17. Bu çizgi, özellikle makrofajlar ve mikroglia ile ifade edilen BOS1 reseptörünün (BOS1R) promotörü kontrolü altında ilaç lainebilir fk506 bağlayıcı protein (FKBP)-Fas intihar füzyon geni ve yeşil floresan proteini (eGFP) ifade eder. FK bağlayıcı protein dimerizer sistemik enjeksiyon, AP20187 (AP), transgeni ifade eden hücrelerin apoptosis indükler. EGFP ifadesi de bize DRG makrofajlar izlemek iç.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada etkili fare DRG izole makrofajlar zenginleştirmek için yeni bir yöntem tanıtmak. DRG bağışıklık hücrelerini izole etmek için geleneksel yaklaşım enzimatik sindirim gerektirir15,18, şimdi istenmeyen hücre hasarı sınırlamak ve verimi artırmak için protokolümüzde mekanik homojenizasyon ile değiştirilir. Bu nedenle, yeni protokol çok daha az zaman alıcıdır. Daha da önemlisi, enzim sindirim makrofajlar uyarabilir ve moleküler imzayı değiştirmek. Buna karşılık, .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar bu el yazması ile ilgili hiçbir rakip mali çıkarları beyan.
Teşekkürler
Çalışma şu şekilde desteklenmiştir: Anestezi Eğitim ve Araştırma Vakfı (XY); UCSF Anestezi ve Perioperatif Bakım Bölümü (XY); ve 1R01NS100801-01(GZ). Bu çalışma kısmen HDFCCC Laboratuvar Hücre Analizi Paylaşılan Kaynaklar Tesisi tarafından NIH (P30CA082103) hibe si ile desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| AP20187 | Clontech | 635058 | |
| α-fare CX3CR1-APC antikoru | Biolegend | 149007 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Hücre süzgeci (70 mm naylon) | Falcon | 352350 | |
| Santrifüj | Eppendorf | 5810R | |
| Dounce doku homojenizatörü | Wheaton | 357538 ( 1ml) | |
| FACS tüpleri (5ml) | Falcon | 352052 | |
| Friedman-Pearson Rongeur | FST | 16121-14 | |
| HBSS (10x, Ca++/Mg++-ücretsiz) | Gibco | 14185-052 | |
| Noyes Yaylı Makas | FST | 15012-12 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500ml | |
| Propidium iyodür | Sigma | P4864-10ml |
Kaynaklar
- Ji, R. R., Chamessian, A., Zhang, Y. Q. Pain regulation by non-neuronal cells and inflammation. Science. 354 (6312), 572-577 (2016).
- Inoue, K., Tsuda, M. Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential. Nature....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
