Yöntem makalesi

Primer Nöronlarda Neurite Outgrowth Çalışma için Geliştirilmiş Yeşil Floresan Protein Tabanlı Test

6.3K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/60031

⸱

19 Ekim 2019

 ,  ,  , 
1School of Life Sciences, The Chinese University of Hong Kong, Hong Kong Special Administrative Region, 2Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences, Shenzhen

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu yazıda, EGFP ve ilgi proteini ile birlikte transfekting tarafından embriyonik sıçan kortikal nöronlarda neurite büyüme incelenmesi için basit bir protokol açıklanmıştır.

Özet

Neurite büyüme sinir sistemi gelişimi sırasında nöral devrelerin oluşumunda temel bir olaydır. Şiddetli nötrit hasarı ve sinaptik disfonksiyon çeşitli nörodejeneratif hastalıklarda ve yaşa bağlı dejenerasyonda meydana gelir. Neurite büyümesini düzenleyen mekanizmaların araştırılması sadece beyin gelişim süreçlerine değil, aynı zamanda bu tür nörolojik bozukluklara da değerli Bir ışık tutamaz. Düşük transfeksiyon verimliliği nedeniyle, şu anda birincil memeli nöronlarda nörit büyüme üzerinde belirli bir proteinin etkisini incelemek zordur. Burada, egfp ve ilgi bir protein (POI) ile birincil sıçan kortikal nöronların co-transfeksiyon tarafından neurite outgrowth soruşturma için basit bir yöntem açıklar. Bu yöntem, EGFP sinyali ile POI transfected nöronların belirlenmesini sağlar, ve böylece neurite outgrowth poi etkisi tam olarak belirlenebilir. Bu EGFP tabanlı test, neurite büyümesini düzenleyen yolların araştırılması için uygun bir yaklaşım sağlar.

Giriş

Hem aksonlar hem de dendritler de dahil olmak üzere nöritler, nöral ağların kurulmasında rol oynayan nöronların projeksiyonlarıdır. Nöritlerin dinamik büyümesi nörogelişim için gereklidir. Ancak, altında yatan düzenleyici mekanizmalar belirsizliğini koruyor. Özellikle, neurite hasar genellikle çeşitli nörodejeneratif hastalıklarda gözlenen ve beyin yaralanmalarısonra 1. Bu nedenle, çeşitli neurite outgrowth düzenleyici yollarda putatif moleküllerin rollerinin araştırılması süreci anlayışımızı artıracaktır. Ayrıca, çeşitli nörolojik bozukluklar için yeni terapötik hedefler ortaya çıkarabilir. Nöronal hücre hatları onlar işlemek ve transfectkolayolduğu gibi neurite outgrowth dahil olmak üzere nöronal süreçleri incelemek için değerlimodellerdir 2 ,3. Ancak, genetik sürüklenme bazı yaygın olarak kullanılan hücre hatları meydana bildirilmiştir, onların fizyolojik yanıtları varyasyonları yol açabilir4. Ayrıca nöronal hücre hatları ile primer nöronlar arasında diferansiyel protein ekspresyonu gösterilmiştir. Örneğin, PC12, yaygın neuriteoutgrowth2 ,3, NMDA reseptörleri ifade etmez çalışma için kullanılan sıçan adrenal bezinden elde edilen bir nöronal hücre hattı5 . Ayrıca, birincil nöronlara göre nörotoksinlere fare nöroblastom hattı nöroblastom hattı nöro-2a azaltılmış yanıt bazı membran reseptörleri ve iyonkanallarınınifade eksikliği nedeniyle olduğu ileri sürülmuştur 6 . Bu nedenle, birincil nöronlar daha arzu edilen ve temsili bir model neurite outgrowth soruşturma için. Ancak, birincil nöronların kullanımı düşük transfeksiyon verimliliği7tarafından engellenir.

Burada, ilgi proteininin (POI) ve EGFP'nin birincil sıçan kortikal nöronlarına birlikte transfeksiyonunu içeren bir yöntemi tanımlıyoruz. EGFP başarılı transfeced nöronların belirlenmesi için bir morfolojik belirteç olarak davranır ve nöritlerin ölçümü sağlar. Bu yöntemi, netürit büyümesini modüle ettiği bildirilen bileşikler/moleküller kullanarak doğruladık. Ayrıca, FE65, neurite büyüme uyarmak için gösterilmiştir bir nöronal adaptör protein, Bu yaklaşım göstermek için kullanılmıştır8,9. Bu protokol (1) embriyonik gün 18 (E18) sıçan embriyolarından birincil kortikal nöronların izolasyonunu, (2) egfp ve POI (bu çalışmada FE65) ile nöronların birlikte transfeksiyonunu ve (3) görüntü işlemeyi kullanarak nöronların görüntülenme ve analizini içerir. NeuronJ eklentisi ile yazılım ImageJ10,11.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Takip edilen tüm prosedürler, Hong Kong Çin Üniversitesi hayvan deneyleri etik komitesinin etik standartlarına uygun du.

1. Kapak Kapaklarının Hazırlanması

  1. 12 kuyulu doku kültürü plakasının her kuyunun içine steril 18 mm'lik dairesel bir kapak yerleştirin.
  2. En az 1 saat nemlendirilmiş 37 °C inkübatörde 5 μg/mL poli-D-lizin çözeltisi ile örtüyü kaplayın.
  3. Poli-D-lizin çözeltisini doku kültür plakasından aspire edin ve kaplamalı kapakları steril suyla bir kez durulayın.

2. Sıçan Embriyonik Nöron Diseksiyonu

  1. 18 günlük gebelik yaşında (E18) zamanlanmış hamile bir Sprague-Dawley sıçanını servikal çıkığı veya CO2 boğulması ile kurban edin.
    NOT: Lütfen hamile farelerin kurban için yerel düzenlemeleri kontrol edin.
  2. Gebe sıçanın karın boşluğunu makasla açın ve rahmi 10 cm Petri kabına aktarın.
  3. Küçük diseksiyon makasla rahmi ve amniyotik keseyi dikkatlice açın ve küçük diseksiyon makasla sıçan embriyosundaki plasentayı çıkarın. Bir çift küçük forsep sinif kullanarak tüm embriyoyu 10 cm'lik petri kabına glukoz (PBS-glukoz, 10 mM sodyum fosfat, 2,68 mM potasyum klorür, 140 mM sodyum klorür ve 3 g/L glukoz) ile takviye edilmiş önceden soğutulmuş fosfat lı bir kabına aktarın.
  4. Kafatasının sagittal sütür boyunca kesin ve küçük diseksiyon makas bir çift ile dikkatlice açın. Küçük bir düz spatula ile embriyonik beyin transferi buz gibi PBS-glikoz ile 10 cm Petri çanak.
  5. Bir diseksiyon mikroskobu altında iki #5 cımbız kullanarak beyincik ve beyin sapından iki serebral hemisfer ayırın.
    NOT: Fare beyninin yapısı için lütfen referans12'ye bakın.
  6. #5 cımbız kullanarak menenjler çıkarın.
  7. Korteksi serebral hemisferlerden iki #5 cımbızla ayırın.
  8. İzole korteksi 15 mL'lik bir santrifüj tüple buz gibi PBS-glikoza aktarın.

3. Primer Kortikal Nöron Kültürü

NOT: 3 ve 4.

  1. İzole korteksi 4 °C'de 5 dk için yer çekimine göre yerleştirin ve PBS-glukoza aspire edin.
  2. İzole kortekse %0,05 Tripsin-EDTA 1 mL ekleyin ve enzimatik sindirime izin vermek için 37 °C'lik bir su banyosunda 10 dakika boyunca dokuya dokunarak ve kuluçkaya yatırarak hafifçe karıştırın. Her 2 dakikada bir karıştırmak için tüpü hafifçe dokunun.
  3. Doku/tripsin karışımına 4 mL bakım ortamı (örn. Nörobazal Orta) ekleyin.
    NOT: Bu protokolde kullanılan tüm bakım ortamı Penisilin-Streptomisin ve B-27 ek13ile desteklenmektedir.
  4. 1 mL pipet kullanarak triturasyon ile dokuyu hafifçe ayırın.
  5. Pelet 5 dk. Supernatant aspire için 200 x g santrifüj tarafından ayrıştırılmış hücreler.
  6. 3,5 ile 3,7 arası adımları iki kez tekrarlayın.
  7. 1 mL bakım ortamında hücre peletini yeniden askıya alın.
  8. Hemositometre ile canlı hücrelerin saylanması için hücre süspansiyonunun 10 μL'sine %0,4 Trypan Blue çözeltisi ekleyin.
  9. 12 kuyulu bir plakada her kuyuda 1 mL bakım ortamında 65.000/cm2 (canlı hücreler) yoğunluktaki nöronları plakalayın.

4. Hücre Transfeksiyonu ve Fiksasyonu

  1. 2 gün in vitro (DIV2), transfect 0.5 g EGFP yapı (pEGFP-C1) ile birlikte veya 0.5g POI olmadan transfeksiyon reaktifi 1 μL kullanarak nöronlara (örneğin, Lipofektamine 2000). Üreticinin yönergelerini kullanın.
    NOT: Endotoksin içermeyen plazmid hazırlama kiti kullanılarak memeli ekspresyonu yapılar hazırlanmıştır. Transfeksiyon sonrası 6 saat te kimyasallar/moleküller (bu el yazması sitodizin D (Cyto D) ve sinir büyüme faktörü (NGF) kullanılmıştır) ile tedavi yapılabilir.
  2. Transfeksiyon sonrası kültür ortamını 24 saat aspiratve 37 °C PBS (10 mM sodyum fosfat, 2,68 mM potasyum klorür, 140 mM sodyum klorür) ile yıkayın.
  3. Oda sıcaklığında karanlıkta 10 dakika pbs% 4 paraformaldehit ile hücreleri düzeltin.
  4. Sabit hücreleri PBS ile üç kez yıkayın.
  5. Mikroskop cam slayt üzerinde floresan montaj ortamı az miktarda ekleyin. Kapak kaymasını 12 kuyulu plakadan cam kaydırağa bakan numuneyle montaj ortamına dikkatlice aktarın.
    NOT: Sulu bir montaj ortamı kullanılıyorsa, kapağın kenarını oje ile kapatın.

5. Neurite Büyümeölçümü

  1. Epi-floresan mikroskobu kullanarak görüntüleri yakalamak için 40 x'lik bir hedef kullanın.
  2. Transfeksiyon başına EGFP sinyali ne kadar az 40 bozulmamış nörondan görüntüler yakalayın.
  3. En uzun nöritin uzun luğunu ölçmek için NeuronJ eklentisi11 ile ImageJ yazılımında yakalanan görüntüyü açın, hücre gövdesinden büyüme konisinin ucuna, her görüntülenmiş nöronun ucuna kadar.
  4. Hedeflenen proteinlerin neurite büyümedeki etkisini belirlemek için yazılımla elde edilen verileri analiz edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu metodolojiyi test etmek için, sito D ve sinir büyüme faktörü NGF, sırasıyla inhibe ve nötrit büyümesini uyarmak için gösterilmiştir14,15,16kullanılır. EGFP ile transfektör lüznit uzunluğu Cyto D veya NGF ile tedavi edildikten sonra ölçüldü. EGFP'nin nöronlara transfeksiyon verimi %2.7 (1.068 nöron sayıldı) idi. Şekil 1A'dagösterildiği gibi, Cyto D...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Daha önce de belirtildiği gibi, PC12 ve subklonları yaygın olarak neurite uzantısı çalışmak için istihdam çünkü mükemmel transfeksiyon verimliliği2,3. Buna karşılık, birincil nöronlar düşük transfeksiyon hızıvar, transfeksiyon7ile neurite outgrowth regülatörleri incelenmesi için önemli bir engeldir. Burada, birincil nöronlarda nötrit büyümesini ölçmek için uygun bir protokol uyguluyoruz. Düşük genel transfeksiyon etkinliğine rağmen transfe...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, bu makalenin içeriği ile çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışma Araştırma Hibekonseyi Hong Kong, Sağlık ve Tıbbi Araştırma Fonu (Hong Kong), CUHK doğrudan hibe programı, United College bağış fonu ve TUYF Charitable Trust fonları tarafından desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
#5 cımbızRegine5-COB
18 mm Daire Kapak SlipleriThermo ScientificCB00180RAKullanmadan önce sterilize edin
B27 TakviyesiGibco17504044
Sitokalasin DİnvitrojenPHZ1063DMSO
D-(+)-GlikozSigma-AldrichG8270
Dimetil Sülfoksit İçinde ÇözünmüşSigma-AldrichD2650
Diseksiyon Makası, 10 cmWorld Precision Instruments14393
Diseksiyon Makası, 12.5 cmWorld Precision Instruments15922
EndoFree Plazmid Maxi KitiQIAGEN12362
Floresan Montaj OrtamıDakoS302380
Lipofektamin 2000 Transfeksiyon ReaktifInvitrogen11668019
Nörobazal OrtaGibco21103049
NGF 2.5S Yerli Fare ProteiniGibco13257019
Nugent Utility Forseps, 10 mm, Düz UçluDünya Hassas Aletleri504489
ParaformaldehitSigma-AldrichP6148
pEGFP-C1Clontech#6084-1
pCI FE65Lütfen referanslara bakın 8 ve 15
PBS TabletlerGibco18912014
Penisilin-StreptomisinGibco15140122
Poli-D-lizin hidrobromürSigma-AldrichP7280
SpatulaSigma-AldrichS4147
Tripsin-EDTA (% 0.05), fenol kırmızıGibco25300062
Tripan Mavisi Çözeltisi, %0,4Gibco15250061

Kaynaklar

  1. Kaplan, A., Bueno, M., Hua, L., Fournier, A. E. Maximizing functional axon repair in the injured central nervous system: Lessons from neuronal development. Developmental Dynamics. 247 (1), 18-23 (2018).
  2. Harrill, J. A., Mundy, W. R. Quantitative assessment of neurite outgrowth in PC12 cells. Methods in Molecular Biology. 758, 331-348 (2011).
  3. Yeyeodu, S. T., Witherspoon, S. M., Gilyazova, N., Ibeanu, G. C. A rapid, inexpensive high throughput screen method for neurite outgrowth. Current Chemical Genomics. 4, 74-83 (2010).
  4. Ben-David, U., et al. Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response. Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).
  5. Edwards, M. A., Loxley, R. A., Williams, A. J., Connor, M., Phillips, J. K. Lack of functional expression of NMDA receptors in PC12 cells. Neurotoxicology. 28 (4), 876-885 (2007).
  6. LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies. Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).
  7. Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).
  8. Cheung, H. N., et al. FE65 interacts with ADP-ribosylation factor 6 to promote neurite outgrowth. The FASEB Journal. 28 (1), 337-349 (2014).
  9. Li, W., et al. Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1. Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).
  10. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  11. Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry. Part A: the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).
  12. Swanson, L. W. Brain maps 4.0-Structure of the rat brain: An open access atlas with global nervous system nomenclature ontology and flatmaps. The Journal of Comparative Neurology. 526 (6), 935-943 (2018).
  13. Brewer, G. J. Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus. Journal of Neuroscience Research. 42 (5), 674-683 (1995).
  14. Yamada, K. M., Spooner, B. S., Wessells, N. K. Axon growth: roles of microfilaments and microtubules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 66 (4), 1206-1212 (1970).
  15. Casella, J. F., Flanagan, M. D., Lin, S. Cytochalasin D inhibits actin polymerization and induces depolymerization of actin filaments formed during platelet shape change. Nature. 293 (5830), 302-305 (1981).
  16. Calabrese, E. J. Enhancing and regulating neurite outgrowth. Critical Reviews in Toxicology. 38 (4), 391-418 (2008).
  17. Lau, K. F., et al. Dexras1 Interacts with FE65 to Regulate FE65-Amyloid Precursor Protein-dependent Transcription. Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34728-34737 (2008).
  18. Cui, X., et al. Niacin treatment of stroke increases synaptic plasticity and axon growth in rats. Stroke. 41 (9), 2044-2049 (2010).
  19. Khodosevich, K., Monyer, H. Signaling involved in neurite outgrowth of postnatally born subventricular zone neurons in vitro. BMC Neuroscience. 11, 18(2010).
  20. Tang, F., et al. Resveratrol Enhances Neurite Outgrowth and Synaptogenesis Via Sonic Hedgehog Signaling Following Oxygen-Glucose Deprivation/Reoxygenation Injury. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 43 (2), 852-869 (2017).
  21. He, W., Liu, Y., Tian, X. Rosuvastatin Improves Neurite Outgrowth of Cortical Neurons against Oxygen-Glucose Deprivation via Notch1-mediated Mitochondrial Biogenesis and Functional Improvement. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 6(2018).
  22. Tesarova, P., et al. Receptor for advanced glycation end products (RAGE)--soluble form (sRAGE) and gene polymorphisms in patients with breast cancer. Cancer Investigation. 25 (8), 720-725 (2007).
  23. Park, S. Y., et al. Hippocalcin Promotes Neuronal Differentiation and Inhibits Astrocytic Differentiation in Neural Stem Cells. Stem Cell Reports. 8 (1), 95-111 (2017).
  24. Radbruch, A. Immunofluorescence: Basic Considerations. Flow Cytometry and Cell Sorting. , Springer Lab Manual Book Series. 38-52 (2000).
  25. Wang, T., Larcher, L. M., Ma, L., Veedu, R. N. Systematic Screening of Commonly Used Commercial Transfection Reagents towards Efficient Transfection of Single-Stranded Oligonucleotides. Molecules. 23 (10), (2018).
  26. Sariyer, I. K. Transfection of neuronal cultures. Methods in Molecular Biology. 1078, 133-139 (2013).
  27. Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Research. 126 (3), 397-425 (1977).
  28. Banker, G. A., Cowan, W. M. Further observations on hippocampal neurons in dispersed cell culture. The Journal of Comparative Neurology. 187 (3), 469-493 (1979).
  29. Biffi, E., Regalia, G., Menegon, A., Ferrigno, G., Pedrocchi, A. The influence of neuronal density and maturation on network activity of hippocampal cell cultures: a methodological study. PLoS One. 8 (12), e83899(2013).
  30. Hiragi, T., et al. Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cell (hiPSC)-Derived Neurons in Mouse Hippocampal Slice Cultures. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 143(2017).
  31. Zeng, H., Sanes, J. R. Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward. Nature Reviews. Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).
  32. Jones, M. R., Villalon, E., Northcutt, A. J., Calcutt, N. A., Garcia, M. L. Differential effects of myostatin deficiency on motor and sensory axons. Muscle & Nerve. 56 (6), E100-E107 (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

EGFP AnaliziKo transfeksiyonKortikal N ron K lt rmm nofloresan BoyamaImageJ AnaliziN rit Uzunlu u l mFE65 ProteiniSinir B y me Fakt r

İlgili makaleler