Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Ex Vivo Transmigration Sisteminde Lenfosit Göçünün Değerlendirilmesi

6.7K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/60060

⸱

20 Eylül 2019

 , 
1Department of Internal Medicine, University of Utah, 2Research Service, VA Nebraska Iowa Health Care System, 3Department of Internal Medicine, University of Nebraska Medical Center, 4Department of Environmental, Agricultural & Occupational Health, University of Nebraska Medical Center

Bu makalede

Özet

Bu protokolde lenfositler, alt odadan gözenekli bir zarla ayrılan bir transmigration sisteminin üst odasına yerleştirilir. Keokin alt hazneye eklenir, bu da bir kemokin gradyan boyunca aktif göçe neden olur. 48 saat sonra, lenfositler transmigration quantitate için her iki odada sayılır.

Özet

Burada, ex vivo transmigration sisteminde lenfosit kemokinetik hareketini değerlendirmek için temel laboratuvar becerileri ve malzemeleri ile yürütülebilecek etkili bir yöntem salıyoruz. Grup 2 doğuştan gelen lenfoid hücreler (ILC2) ve CD4+ T yardımcı hücreleri tavuk yumurtası ovalbumin (OVA)-meydan BALB/ c farelerin dalak ve akciğerlerinden izole edildi. Hem CD4+ T hücrelerinde hem de ILC2'de CCR4 ekspresyonunu nispeten doğruladık. CCL17 ve CCL22 CCR4 için bilinen ligands vardır; bu nedenle, bu ex vivo transmigration yöntemini kullanarak CCL17- ve CCR4+ lenfositlerin CCL22 kaynaklı hareketi inceledik. Kemoin gradyanları oluşturmak için, CCL17 ve CCL22 transmigration sisteminin alt odasına yerleştirildi. İzole lenfositler daha sonra üst odalara eklendi ve 48 saat lik bir süre içinde lenfositler aktif olarak 3 μm gözeneklerden alt odadaki kemokine doğru göç ettiler. Bu lenfositlerin kemokinetikbelirlemek için etkili bir sistemdir, ama, anlaşılır, in vivo organ mikroortamlarında bulunan karmaşıklığı taklit etmez. Bu çalışma altında organ ve lenfositlerin yerinde görüntüleme eklenmesi ile aşılabilir yöntemin bir sınırlamadır. Buna karşılık, bu yöntemin avantajı, canlı görüntüleme çok daha uygun maliyetli bir oranda bir giriş seviyesi teknisyen tarafından yapılabilir olmasıdır. Terapötik bileşikler göçü artırmak için kullanılabilir hale geldikçe, tümör sitotoksik bağışıklık hücrelerine sızma durumunda olduğu gibi, ya da göçü inhibe etmek için, belki de immünolojinin endişe verici olduğu otoimmün hastalıklarda, bu yöntem tarama aracı. Genel olarak, ilgi chemokine sürekli medya kontrolü daha istatistiksel olarak daha yüksek bir düzeyde kemokinetik üreten ise yöntem etkilidir. Bu gibi durumlarda, belirli bir bileşik tarafından inhibisyon / geliştirme derecesi de belirlenebilir.

Giriş

Bu orijinal transmigration yöntemi Stephen Boyden tarafından 1962 yılında Journal of Experimental Medicine1'desunulmuştur. Kemotaksis ve keokinetik hakkında bildiklerimiz Boyden odasının gelişimi olmadan mümkün olmazdı. 1977 yılında ilk kemokin keşfinden önce, ex vivo transmigration sistemleri nötrofiller hücresel hareketlilik yükseltirken makrofajlarda hücresel hareketi durdurabilecek serum faktörleri hakkında bilgi edinmek için kullanılmıştır1,2. Bağışıklık hücresi göçü ile ilgili olarak büyük bir bilgi zenginliği geliştirilmiştir, ve bugüne kadar, 47 kemokinler şimdi 19 ilgili reseptörleri3ile keşfedilmiştir,4. Buna ek olarak, inhibitörleri / bu kemokin yollarının arttırıcılar çoksayıda terapötik amaçlar için geliştirme uğramıştır5,6,7,8. Bu bileşiklerin çoğu belirli bir kemokin 9 bileşikler ve bağışıklık hücresi yanıt arasındaki doğrudan etkileşimleri anlamak için benzer transmigration odalarında test edilmiştir.

Transmigration, veya diapedesis, iltihaplı doku içine açık enfeksiyon için sağlıklı bir inflamatuar yanıt için önemli bir süreçtir10,11. Bir Boyden odası, transmigration sistemi, veya transwell cihazları genellikle gözenekli bir membran1,12ile ayrılmış iki odacık oluşur. Alt oda en sık ilgi chemokine içeren medya tutar, lökositler üst odaya yerleştirilir iken. Membrandaki gözeneğin boyutu, ilgi çeken hücrenin büyüklüğüne göre seçilebilir. Bu proje için, lenfoid hücreler hücresel gelişim aşamasına bağlı olarak 7-20 μm boyutunda olduğundan, 3 μm gözenekli membran seçtik. Bu gözenek boyutu, bu hücrelerin gözeneklerin içinden pasif olarak düşmemesini, ancak kemokin degradesine yanıt olarak aktif olarak göç etmesini sağlar.

Bu protokolün en büyük avantajı maliyet etkinliğidir. In vivo transmigration zordur, çünkü hayvan taşıma ve cerrahi konusunda kapsamlı bir eğitim gerektirir ve genellikle bir araştırmacının her zaman kullanamadığı yüksek güçlü mikroskopi içerir. Transmigration'i artırıcı veya inhibe ettiği düşünülen bileşiklerin uygun maliyetli taranması in vivo görüntüleme öncesinde gerçekleştirilebilir. Transmigration sistemi sıkı bir şekilde kontrol edilince, hücreler başlangıçta transwell cihazına eklenebilir, ya da tam tersi, kemokin önce keokin inhibitörü ile tedavi edilebilir, sonra hücreler transwell cihazına eklenebilir. Son olarak, bu bariyer hücrelerinin kemokinetiklere katılımını anlamak için transwell insertinin altına transwell insert1-2 gün önce eklenebilir. Yine, sistemin bu manipülasyonlar vivo çalışmalarda daha karmaşık öncesinde belirli bir bileşiğin etkinliği hakkında önemli bilgileri belirleme güçlü bir araç sağlar.

Bir transmigration oda sistemi kullanarak çeşitli in vivo ve in vitro koşullar altında lenfosit hareketliliği değerlendirmek için etkili bir yoldur12,13,14. Burada, bir transmigration odasında kemokinlere ex vivo lenfosit duyarlılığını değerlendirmek için optimize edilmiş bir yöntem tanımlıyoruz. Bu örnek deneyde, CD4+ T hücreleri ve grup 2 doğuştan gelen lenfoid hücreler (ILC2) OVA-alerjen maruziyetini takiben erkek ve dişi BALB/c farelerinden izole edildi. Alerjene meydan okuyan farelerden CCR4 + CD45+ Lineage- (LIN-) ILC2'nin CCR4+ CD4+ T yardımcı hücrelerden ccl17 ve CCL22'ye daha verimli bir şekilde göç edeceği hipotezi oluşturuldu. CCL17 ve CCL22 genellikle dendritik hücreler ve M2 makrofajlar tarafından üretilen kemokinler (alerjik) fenotip, diğer hücreler arasında, alerji15,16. CCL17 ve CCL22 onlar kolayca hava yolu alevlenmeleri sırasında akciğerlerde tespit edilir gibi alerjik inflamasyon biyobelirteçleri olarak düşünülebilir16,17,18. Daha da önemlisi, CCR4 ekspresyonu, ev tozu işledi hayvanlardan izole edilen ILC2'den elde edilen biyoinformatik verilerde ortaya konan ve benzer şekilde IL-33 ile ex vivo ile tedavi edilen saf hayvanlardan ILC2'nin işlenmemiş kontrollere göre yükseltilir ( alerjen teşvik doğuştan sitokin) CCR419,20düzenler. Ayrıca, Immünolojik Genom Projesi veritabanında (www.immgen.org) ILC2 verilerine göre, CCR4 mRNA bu doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinde yüksek oranda ifade edilir. Bugüne kadar ILC2'nin dokulara ticareti konusunda çok az şey bilinmektedir, ancak ILC2 ve CD4+ T hücrelerinin benzer transkripsiyon faktörleri ve reseptörleri ifade ettikleri için kemotaksiler ve kemokinetikler için benzer kemokinler ve reseptörler kullanmaları muhtemeldir. Böylece, CCL17 karşı CCL22 duyarlılık karşılaştırıldı, ILC2 ve CD4+ T lenfositler, hem erkek hem de kadın, OVA meydan hayvanlardan.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Burada açıklanan tüm yöntemler Nebraska Üniversitesi Tıp Merkezi (UNMC) ve Utah Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri tarafından gözden geçirildi ve onaylandı.

1. Reaktiflerin Kurulumu ve Hazırlanması

  1. Komple RPMI (Roswell Park Memorial Institute) medya hazırlayın.
    1. 90 mL RPMI'ye 10 mL ısı yalıtılmış fetal sığır serumu (FBS) ekleyin.
    2. 100x Penisilin-Streptomisin-Glutamin 100 mL% 10 FBS RPMI 1mL ekleyin.
  2. ILC2 genişletme ortamını hazırlayın.
    1. 10 mL'lik tam RPMI'ye IL-2 ve IL-33 (her sitokine 20 ng/mL) ekleyin.
    2. Stok sitokinleri 10 μg/mL ise, pipet 20 μL IL-2 ve IL-33 10 mL tam RPMI ortam içeren 15 mL'lik bir tüpiçine.
  3. Akciğer Dissociation Medium hazırlayın.
    1. 250 mL eklanmamış RPMI tip 1 kollajenaz 50 mg ekleyin.
    2. Adım 1.3.1'deki 250 mL ortama 2,5 mL 100x penisilin-streptomisin-glutamin ekleyin.
    3. Tip 1 Kollajenaz'ın kullanılmadan önce tamamen çözünmesini sağlamak için ortamı hafifçe karıştırın.
  4. Serumsuz RPMI hazırlayın.
    1. RPMI 200 mL lyophilized sığır serum albumin (BSA) seyreltilmesi 1 g.
    2. 100x penisilin-streptomisin-glutamin 2 mL ekleyin.
    3. BSA'nın kullanılmadan önce medyada tamamen çözünmesini sağlamak için ortamı yavaşça karıştırın.
  5. CCL17 ile Geçiş Ortamı nı Hazırlayın.
    1. 10 mL serumsuz RPMI edinin ve CCL17 [50 ng/mL] ekleyin.
      1. Stok CCL17 10 μg/mL ise, 10 mL serumsuz RPMI ortama 50 μL CCL17 stok ekleyin.
  6. CCL22 ile Geçiş Ortamını Hazırlayın.
    1. 10 mL serumsuz RPMI edinin ve CCL22 [50 ng/mL] ekleyin.
    2. Stok CCL22 10 μg/mL ise, 10 mL serumsuz RPMI ortama 50 μL CCL22 stok ekleyin.
  7. CCR4 Antikor Boyama Kokteyli hazırlayın.
    1. Toplam 10 test için, aşağıdaki antikorların her birini 5 mL'lik bir tüpe ekleyin: anti-mouse CCR4, CD19, CD11b, CD45, ST2 ve ICOS.
      NOT: 10 örnek için antikor kokteyli nasıl yapılır örneği: Her antikor x 10 numunenin 0,5 μL'si = 1,7.1'de listelenen antikorların her birinin 5 μL'si.
    2. Toplam 10 test için, 1.7.1 adımdan antikor kokteyline aşağıdaki antikorlardan 2.5 μL ekleyin: anti-mouse CD3, CD11c ve NK1.1.
      NOT: Örnek 10 örnek için antikor kokteyli tamamlamak için: 0.25 μL x 10 örnekleri = 2.5 l CD3, CD11c ve NK1.1 antikorları.
    3. CCR4 Antikor Boyama Kokteylini numunelere eklemeye hazır olana kadar 4 °C'de saklayın. Kullanılmadığı takdirde 1 hafta sonra antikor kokteylini atın.
  8. 1x Stabilizatör fikstür hazırlayın.
    1. 5 mL 3x stabilizatör konsantresine 10 mL deiyonize su ekleyin

2. Alerjene meydan okuyan BALB/c Farelerin hazırlanması

NOT: Erkek ve dişi BALB/c fareleri Charles River (UNMC) veya Jackson Laboratories'den (Utah Üniversitesi) 6-8 haftalık kensatın alındı.

  1. Alışma (1 hafta) sonra, OVA tüm hayvanları duyarlı.
    1. 5 mL polistiren tüpte alüminyum hidroksite (20 mg/mL) 100 μg/mL OVA adsorded'i birleştirin.
    2. Tüpü karıştırın ve hemen 500 μL OVA-şap süspansiyonuna 1 mL, 28 G şırınga (insülin şırıngası) içine çekin.
    3. Fareyi izofluran içeren bir çan kavanozuna yerleştirin (1-2 mL yanlış bir zeminin altına, böylece hayvan doğrudan isoflurane'de durmuyor). Farenin yaklaşık 1-2 dakika veya solunum hızı düşene kadar anestezi altında gitmesine izin verin.
    4. Hızlı bir şekilde arka ve omuzlarda kürk tarafından fare almak ve fare21,22başına OVA-şap intraperitoneally 100 μL enjekte .
    5. Fareyi kafesine geri yerleştirin ve hareket kabiliyetini yeniden kazanmak için izleyin; bu 2-5 dakika içinde meydana gelmelidir.
  2. Sensitizasyondan yedi gün sonra, tüm hayvanları 20 dakika boyunca bir nebülizasyon odasında (Data Sciences International) steril salinle seyreltilmiş intranazal (i.n.) %1.5 OVA'ya tabi takın.
    1. Fareleri kafeslerinden çıkarın ve hayvan bulutsusu odasına yerleştirin. Odanın kapağını kapatın.
    2. Nebülizasyon hortumunu nebülizasyon odasındaki giriş emzilesine takın.
    3. Nebülizör üzerindeki nebülizasyon kabına steril salinle seyreltilmiş %1,5 OVA'nın 30 mL'sini ekleyin.
    4. Nebülizörü açın ve odanın 20 dakika boyunca sisle dolmasını bekleyin.
    5. Nebülizörü kapatın ve sisin durulmasına izin verin.
    6. Hayvanları kafeslerine geri getirin.
  3. Alerjik inflamasyona neden olmak için 5 gün üst üste 5 kez toplam adım 2.2 tekrarlayın.

3. CD4+ T Hücrelerinin Dalaklardan ve Akciğerlerden OVA'ya Meydan Okuyan Farelerden İzolasyon

  1. İnsanca co2 boğulma tarafından tüm OVA tedavi erkek ve dişi hayvanlar tarafından onaylanmış IACUC protokollerine göre, grup başına 2-3 hayvan kullanarak, deney başına.
  2. Besinler in akciğerleri ve hayvanlardan dalak ve hayvanın doku tipi ve cinsiyetine göre ayrı ayrışma tüpleri dokuları yerleştirin23.
  3. 'Akciğer' protokolünü kullanarak otomatik doku dissosiyatöründe 500 μL'lik akciğer dokusunu (25 U/mL; kollajenaz, tip 1) ayrıştırın.
    1. 3.2 ve 3.3'ü toplam iki kez tekrarlayın.
  4. Otomatik doku dissosiyatöründeki 'dalak' protokolünü kullanarak 500 μL'lik komple RPMI media'da dalak dokusunu ayrıştırın.
    NOT: Geri kalan adımlar steril teknik kullanılarak Biyolojik Güvenlik kabininde yapılmalıdır.
  5. Akciğer ve dalak homojeni içeren ayrışma tüplerini sırasıyla 5 mL ek Akciğer Ayrıştırma media veya Komple RPMI ile durulayın.
  6. Filtre hücresi süspansiyonları 40 μm hücresüzden geçirin ve 50 mL konik tüpler halinde toplayın.
  7. İnkübasyon akciğer ilerlü15-30 dakika boyunca 37 °C'lik bir kuluçka makinesinde %5 CO2 ile daha fazla ayrıştırılar.
  8. Akciğere 5 mL Komple RPMI ekleyin ve santrifüj kullanarak 50 mL tüplerin altındaki hücreleri dalak homojen ve pelet; Oda sıcaklığında 378 x g (RT) 5 dk.
  9. Tek bir 50 mL konik tüp içine splenositler ve akciğer hücreleri birleştirin ve otomatik hücre sayacı kullanarak toplam hücre sayılarını belirlemek.
  10. Ayırma tamponunda erkek ve kadın hücre süspansiyonlarını 1 x 108 hücre/mL'ye ayarlayın ve 5 mL polistiren tüpe ekleyin.
    NOT: Zenginleştirme Protokolü, dalak ve akciğerlerden daha fazla hücre elde edildiğinde 14 mL polistiren tüplere kadar ayarlanabilir. Bu protokol grup başına 2-3 fareden dokular için tasarlanmıştır; bu nedenle 5 mL'lik bir tüp yeterli olacaktır.
  11. ILC2 zenginleştirme protokolüne göre ILC2 yalıtımı için toplam hücrelerin yaklaşık üçte ikisini kullanın.
    1. Hücre süspansiyonuna antikor kokteyli (50 μL/mL) ekleyin ve RT'de 5 dakika kuluçkaya yatırın.
    2. 30 s için girdap hızlı küreler ve hücre süspansiyon 75 l /mL oranında numuneye ekleyin. Yavaşça karıştırın ve RT 5 dakika kuluçka.
    3. Bölme tamponu ile 3 mL toplam hacmine kadar tüp top ve 8 odalı kolay ayırma mıknatıs yer. RT'de 3 dakika kuluçka.
    4. Mıknatısı ileri ye doğru (tüpün arkasına yapışmış küre-antikor hücre komplekslerinden uzağa) ve hücre süspansiyonundan temiz bir 5 mL tüpe pipet le kaplayın.
    5. Tüplere 1,5 mL tam RPMI ekleyin ve 378 x g'de 5 dakika RT'de santrifüj ekleyin.
    6. Hücre peletinden ortamı dökün ve ILC2'yi mL başına 1 x 107 hücrede yeniden askıya alın.
    7. U-alt, 96-iyi plaka iyi başına erkek ve kadın ILC2 100 uL yerleştirin ve her kuyuya ILC2 Genişleme Medya 100 μL ekleyin.
    8. ILC2 genişletmek için 4-5 gün boyunca hücreleri kuluçka.
    9. ILC2'yi 5 mL'lik bir tüpe toplayın ve 4,5 mL'ye kadar serumsuz RPMI ekleyin. Hücreleri 378 x g'de 5 dk RT'de santrifüj edin.
    10. Serumsuz RPMI'de hemacytometre kullanarak hücreleri sayın ve mL başına 1 x 107 ILC2'de yeniden askıya alın.
  12. FareCD4 + T hücre izolasyon protokolüne göre birkaç değişiklik le yapılan CD4+ T hücre yalıtımı yordamı için kalan hücreleri kullanın.
    1. CD4 T hücre zenginleştirme süspansiyonuna fare serumu (50 μL/mL) ekleyin.
    2. Numuneye Izolasyon kokteyli (50 μL/mL) ekleyin ve RT'de 10 dakika kuluçkaya yatırın.
    3. Girdap hızlı küreler 30 s ve 75 μL/mL oranında numuneye ekleyin.
    4. Hücre süspansiyonuna yavaşça karıştırın ve 2,5 dakika ve RT için kuluçkaya yatırın
    5. Numuneleri 3 mL'ye kadar toplayın ve 5 mL'lik tüpleri 8 odalı kolay ayırma mıknatısına yerleştirin ve 5 dakika boyunca RT'de kuluçkaya yatırın.
    6. Mıknatısı ileri ve pipetle hücre süspansiyonuna temiz bir 5 mL boruya getirin.
    7. Tüplere 1,5 mL serumsuz RPMI ekleyin ve 378 x g'de 5 dakika RT'de santrifüj ekleyin.
    8. Hücre peletinden ortam dökün ve serumsuz RPMI'de CD4+ T hücrelerini mL başına 1 x 107 hücrede yeniden askıya alın.

4. FLOW Sitometri ile OVA'ya meydan okuyan Hayvanlardan CD4+ T Hücrelerinde CCR4 Ekspresyonu ve Grup 2 Doğuştan Gelen Lenfoid Hücreleri (ILC2) belirleyin

NOT: Steril olmayan teknikler olduğu için aşağıdaki adımlar açık bir bankın üst kısmında gerçekleştirilebilir.

  1. 3.11.10 ve 1-2.5 x 106 CD4+ T hücrelerinden 3.12.8 adımından ayrı 5 mL tüplerde yaklaşık 1-2,5 x 105 ILC2 hücreleri elde edin.
    1. Lekesiz bir kontrol olarak en az 5,0 x 104 CD4+ T hücreden oluşan ek bir tüp tutun.
  2. Hücreleri 100-200 μL FACS tamponunda askıya alın ve her tüpe 1 μL Fc Block ekleyin, ardından 10 dakika boyunca buzüzerinde (veya 4 °C'lik bir buzdolabında) kuluçkaya yatırın.
  3. RT'de 5 dakika boyunca 378 x g'de her tüpe 1-2 mL FACS Tampon ve santrifüj ekleyin.
  4. Supernatant dökün ve FACS Tampon 100-200 μL hücreleri yeniden askıya.
  5. 'Lekesiz' hücreleri içeren tüp hariç her tüpteki hücre süspansiyonuna 37,5 l CCR4 Antikor Boyama Kokteyli ekleyin.
  6. Tüpleri 20-30 dakika boyunca buz üzerinde veya 4 °C'lik bir buzdolabında kuluçkaya yatırın.
  7. RT'de 5 dakika boyunca 378 x g'de her tüpe 1-2 mL FACS Tampon ve santrifüj ekleyin.
  8. Supernatant dökün.
  9. 4.7 ve 4.8 adımlarını tekrarlayın.
  10. Her tüpe 250-300 μL 1x sabitleme fiksatifi ekleyin (Bkz. Malzeme Tablosu).
  11. CcR4 antikor kokteylindeki her antikor için tek renkli boncuk kontrolleri, tazminat boncukları ile sağlanan protokole göre hazırlayın.
    1. Vortex tazminat boncuklar.
    2. Her tek renkli kontrol tüpüne boncuk bir damla ekleyin.
    3. CCR4 Antikor kokteylindeki her antikordan 1 μL'lik bir taneyi kendi etiketli tüpüne ekleyin.
    4. 4 °C'lik bir buzdolabında veya buz üzerinde 10 dakika boyunca hafifçe karıştırın ve kuluçkaya yatırın.
    5. Tüm tüplere 1-2 mL FACS Tampon ekleyin ve 378 x g'de 5 dk RT'de santrifüj.
    6. Supernatant dökün ve FACS tampon 200 μL boncuklar resuspend.
    7. Tüm numuneler lekeli ve akış sitometre üzerinde analiz edilinceye kadar tek renkli kontrolleri soğutun.
  12. Lekelenmemiş hücreleri, tek renkli kontrolleri ve akış sitometresindeki deneysel örnekleri fiksasyondan 24 saat sonra analiz edin.

5. Ex Vivo Transmigration Prosedürü

NOT: Aşağıdaki adımlar steril teknik gerektirdiğinden Biyolojik Güvenlik Kabini'nde yapılmalıdır.

  1. ILC2'yi adım 3.11.10'dan ve CD4 T hücrelerini 3.12.8 adımından edinin ve deney için gereken transwell uçlarının sayısını belirleyin.
    NOT: Örnek: 3.12.8 adımdan zenginleştirilmiş CD4 T hücrelerinin 1,2 mL'si için 1,2 x 1.000 μL = 1.200 μL çarpın; sonra 1.200 uL'yi 100 μL = 12'ye bölün, CD4 T geçişi için gereken kesici uç sayısı.
  2. 24 kuyulu bir plakanın orta sıralarından 3 μm transwell kesici uçları yavaşça hareket ettirin.
  3. CCL17 ile 500 μL'lik geçiş ortamını kuyuların yaklaşık üçte birine ekleyin.
  4. Kuyuların üçte birine CCL22 ile 500 μL'lik geçiş ortamı ekleyin.
  5. Kuyuların son üçte birine kemokin içermeyen 500 μL serumsuz RPMI ekleyin.
  6. Plakanın kapağını alt kuyulara yerleştirilen uygun transmigration ortamıyla net bir şekilde etiketle.
  7. Transwell ekler geri çeşitli tedaviler içeren kuyulara yerleştirin.
  8. Her kesici uçtaki en üst kuyuya 100 μL CD4 T hücresi veya ILC2 ekleyin. Hücre süspansiyonuna transwelllerde yukarı ve aşağı karıştırmayın veya pipetlemayın, çünkü bu deney sonuçlarını karıştırabilir.
  9. Plakanın kapağını her kuyuya yerleştirilen hücre tipiyle net bir şekilde etiketlendirin ve hücrelerin eklendiğinin tarih ve saatini yazın.
  10. Tüm hücreler ortamla transwell kesici uçlara yerleştirilene kadar 5,2 ile 5,9 adımlarını tekrarlayın.
  11. Plakayı % 5 CO 2 ile %5 CO2 ile 37 °C'lik bir kuluçka makinesine yerleştirin.

6. Ex Vivo Transmigration'ın Nicelleştirilmesi

  1. Plakayı kuvözden yavaşça çıkarın ve orta sıralardan tüm transwell kesici uçlarını hemen üstündeki veya altındaki boş kuyulara çıkarın.
  2. Hücreleri, transwell eklerin alt ve üst kuyularından ÜST veya ALT ile etiketlenmiş tüplere, CCL17, CCL22 veya ortamla, hücre türüyle ve çoğaltma numarasıyla (deney başına en az 3 çoğaltma) toplayın.
  3. Alt kuyuları 500 μL 1x PBS ile durulayın ve bu durulamayı ilgili tüpe toplayın.
  4. Üst kuyuları 250 μL 1x PBS ile durulayın ve bu durulamayı ilgili tüpe toplayın.
  5. Rt 5 dk için 378 x g santrifüj ile hücreleri pelet.
  6. Yavaşça hücre pelet tüm supernatant kapalı pipet.
  7. T hücrelerini ve ILC2'yi 1x PBS'nin 50 μL'ine yeniden askıya alın.
  8. Hücre süspansiyonlarının 10 μL'sini alın ve %0,4 trypan mavisi 90 μL'ye ekleyin.
  9. Otomatik hücre sayacındaki hücreleri say.
    1. %canlılığı kaydedin.
    2. Her örnek için mL başına hücre sayısını kaydedin.
    3. Üst ve alt odadaki tedavi başına toplam hücre sayısını belirleyin; hücre sayılarını kaydedin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

CD4+ T hücrelerinde CCR4 ekspresyonu ve ILC2.

Ex vivo transmigration deneyinin başarısı için, lenfositlerin CCL17 ve CCL22'ye CCR4 ile yanıt verip vermediğini belirlemek zorunludur; bu nedenle hem CD4+ T hücrelerinde hem de ILC2'de ccr4 ekspresyonu akış sitometrisi ile belirledik. OVA'ya özgü CD4+ yardımcı T hücrelerinin CCR4'ü ifade ettiği iyi bilinmekle birlikte, ILC2'deki CCR4 ekspresyonu daha az bilinir. Şekil 1, erkek ve...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada, eksvivo transmigration sisteminde lenfositlerin kemokin kaynaklı göçlerini değerlendirmek için köklü bir yöntem sayılmiyoruz. Protokolde birkaç kritik adım vardır, bunlardan ilki deneydeki bağışıklık hücreleri üzerindeki doğru kemokin reseptörünün ekspresyonunu doğrulamaktır. Elimizde, biz alerjik inflamasyon Th2 yardımcı T hücrelerinde CCR4 önemini vurgulayan literatür vücut nedeniyle CCR4 seçti. Ovalbumin kaynaklı inflamasyon daha önce en az iki CCR4 antagonisti24,

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa etmesi gereken herhangi bir mali açıklama veya çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma Amerikan Akciğer Birliği (K.J.W.), T.A.W. ve K.J.W.'ye verilen Memorial Eugene Kenney fonu, Utah Üniversitesi'nden K.J.W. için cömert başlangıç desteği ve T.A.W. (VA I01BX0003635) gaziler bölümü tarafından finanse edilmiştir. T.A.W. Gaziler İşleri Bölümü'nden Bir Araştırma Kariyer Bilim Adamı Ödülü (IK6 BX003781) sahibidir. Yazarlar Bayan Lisa Chudomelka editoryal yardım kabul etmek istiyorum. Yazarlar bu makale için oluşturulan akış sitometri veri toplama destekiçin UNMC Akış Sitometri çekirdek teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 0.4 Tripan BlueSigma-Aldrich15250061
1 mL şırıngaBD Bioscience329424U-100 Şırıngalar Mikro İnce 28 G 1/2" 1cc
100x Penisilin-Streptomisin, L-GlutaminGibco10378-016RPMI ortamında 1 kata seyreltin
15 mL konik tüplerOlympus Plastics28-101polipropilen tüpler
3 & mu; m transwell eklerGenesee Scientific25-28812 transwell eki içeren 24 oyuklu plaka
3x stabilize edici sabitleyiciBD Pharmigen338036Üretici protokolüne göre 1x çözelti hazırlayın
5 mL polistiren tüplerKÖK Hücre Teknolojileri38007
50 mL konik tüplerOlympus Plastics28-106polipropilen tüpler
8 odacıklı kolay ayırma mıknatısıKÖK Hücre Teknolojileri18103
ACK Lysing BufferLife Technologies CorporationA1049201
40 μ mGenesee Scientific25-375naylon ağ, 40 μ m süzgeçler
Alüminyum Hidroksit, Reaktif SınıfıSigma-Aldrich239186-25G20 mg / mL
anti-fare CCR4; APC konjugeBiolegend1312110.5 & mu; g/test
anti-fare CD11bBD Pharmigen5573960.5 μ g/test
anti-fare CD11c; PE eFluor 610Termo-Fischer Bilimsel61-0114-820.25 & mu; g/test
anti-fare CD16/32, Fc blokBD Pharmigen5531410.5 μ g/test
anti-fare CD19; APC-eFluor 780 konjugeThermo-Fischer Scientific47-0193-820.5 & mu; g/test
anti-fare CD3; PE Cy 7-konjugeBD Pharmigen5527740.25 μ g/test
anti-fare CD45; PE konjugeBD Pharmigen560870.5 & mu; g/test
anti-fare ICOS (CD278)BD Pharmigen5640700.5 & mu; g/test
anti-fare NK1.1 (CD161); FITC ile konjugeBD Pharmigen5531640.25 & mu; g/test
anti-fare ST2 (IL-33R); PerCP Cy5.5 konjugeBiolegend1453110.5 & mu; g/test
Otomatik Hücre SayacıBIORAD1450102
Otomatik AyrıştırıcıMACS Miltenyi Biotec130-093-235
Sığır Serum Albümini, Liyofilize TozSigma-AldrichA2153-10GSerumsuz RPMI'de %0.5
Hücre Sayacı KlidleriBIORAD1450015
Tavuk Yumurtası Ovalbümin, Sınıf VSigma-AldrichA5503-10G500 ve mu; g/mL
Kollajenaz, Tip 1, FiltrelenmişWorthington Biochemical CorporationCLSS-1, 5 X 50 mg flakon (LS004216)25 U/mL olarak satın alın, RPMI
Kompanzasyon boncuklarındaAffymetrix01-1111-41Kontrol tüpü başına 1 damla
Ayrışma TüpleriMACS Miltenyi Biotec130-096-335
FACS TamponBD Pharmigen5546571x PBS +% 2 FBS, sodyum azid ile; 4 & °C'de saklanır; C
Isı İnaktive Edilmiş-FBSGenesee Scientific25-525Htam RPM'de %10 & ILC2 Genişletme
Ortamı Fare CCL17GenScriptZ02954-2050 ng/mL
Fare CCL22GenScriptZ02856-2050 ng/mL
Fare CD4+ T hücre zenginleştirme kitiKÖK Hücre Teknolojileri19852
Fare IL-2GenScriptZ02764-2020 ng/mL
Fare ILC2 zenginleştirme kitiKÖK Hücre Teknolojileri19842
Fare rekombinant IL-33KÖK Hücre Teknolojileri7804420 ng/mL
RPMIYaşam Teknolojileri Şirketi22400071
Ayırma TamponuKÖK Hücre Teknolojileri201441x PBS +% 2 FBS; 4 &°C'de saklanır; C
Küçük hayvan nebulizatörü ve odasıVeri Bilimleri Uluslararası
Steril tuzlusu Baxter2F7124; NDC 0338-0048-04%0,9 Sodyum Klorür
Gelişmiş hücre süzgeci,

Kaynaklar

  1. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
  2. Moser, B. Editorial: History of Chemoattractant Research. Frontiers in Immunology. 6, 548(2015).
  3. Borroni, E. M., Savino, B., Bonecchi, R., Locati, M. Chemokines sound the alarmin: The role of atypical chemokine in inflammation and cancer. Seminars in Immunology. 38, 63-71 (2018).
  4. Charo, I. F., Ransohoff, R. M. The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation. The New England Journal of Medicine. 354 (6), 610-621 (2006).
  5. Abboud, D., Hanson, J. Chemokine neutralization as an innovative therapeutic strategy for atopic dermatitis. Drug Discovery Today. 22 (4), 702-711 (2017).
  6. Aldinucci, D., Casagrande, N. Inhibition of the CCL5/CCR5 Axis against the Progression of Gastric Cancer. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), E1477(2018).
  7. Chonco, L., et al. Novel DNA Aptamers Against CCL21 Protein: Characterization and Biomedical Applications for Targeted Drug Delivery to T Cell-Rich Zones. Nucleic Acid Therapy. 28 (4), 242-251 (2018).
  8. Trivedi, P. J., Adams, D. H. Chemokines and Chemokine Receptors as Therapeutic Targets in Inflammatory Bowel Disease; Pitfalls and Promise. Journal of Crohn's and Colitis. 12 (12), 1508(2018).
  9. Pietrosimone, K. M., Bhandari, S., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. In vitro assays of chemotaxis as a window into mechanisms of toxicant-induced immunomodulation. Current Protocols in Toxicology. 58 (Unit 18.17), (2013).
  10. Davis, D. M. How studying the immune system leads us to new medicines. Lancet. 391 (10136), 2205-2206 (2018).
  11. Culley, F. J., Pennycook, A. M., Tregoning, J. S., Hussell, T., Openshaw, P. J. Differential chemokine expression following respiratory virus infection reflects Th1- or Th2-biased immunopathology. Journal of Virology. 80 (9), 4521-4527 (2006).
  12. Denney, H., Clench, M. R., Woodroofe, M. N. Cleavage of chemokines CCL2 and CXCL10 by matrix metalloproteinases-2 and -9: implications for chemotaxis. Biochemical and Biophysics Research Communications. 382 (2), 341-347 (2009).
  13. Burrell, B. E., et al. Lymph Node Stromal Fiber ER-TR7 Modulates CD4+ T Cell Lymph Node Trafficking and Transplant Tolerance. Transplantation. 99 (6), 1119-1125 (2015).
  14. Warren, K. J., Iwami, D., Harris, D. G., Bromberg, J. S., Burrell, B. E. Laminins affect T cell trafficking and allograft fate. The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 2204-2218 (2014).
  15. Hirata, H., et al. Th2 cell differentiation from naive CD4(+) T cells is enhanced by autocrine CC chemokines in atopic diseases. Clinical and Experimental Allergy: Journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. , (2018).
  16. Lin, R., Choi, Y. H., Zidar, D. A., Walker, J. K. L. beta-Arrestin-2-Dependent Signaling Promotes CCR4-mediated Chemotaxis of Murine T-Helper Type 2 Cells. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 58 (6), 745-755 (2018).
  17. Zhang, Y., et al. A new antagonist for CCR4 attenuates allergic lung inflammation in a mouse model of asthma. Science Reports. 7 (1), 15038(2017).
  18. Lu, Y., et al. Dynamics of helper CD4 T cells during acute and stable allergic asthma. Mucosal Immunology. 11 (6), 1640-1652 (2018).
  19. Li, B. W. S., Beerens, D., Brem, M. D., Hendriks, R. W. Characterization of Group 2 Innate Lymphoid Cells in Allergic Airway Inflammation Models in the Mouse. Methods in Molecular Biology. 1559, 169-183 (2017).
  20. Li, B. W. S., et al. Group 2 Innate Lymphoid Cells Exhibit a Dynamic Phenotype in Allergic Airway Inflammation. Frontiers in Immunology. 8, 1684(2017).
  21. Warren, K. J., et al. Sex differences in activation of lung-related type-2 innate lymphoid cells in experimental asthma. Annals of Allergy, Asthma, Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, Immunology. , (2016).
  22. Warren, K. J., et al. Ovalbumin-sensitized mice have altered airway inflammation to agriculture organic dust. Respiratory Research. 20 (1), 51(2019).
  23. Poole, J. A., et al. alphabeta T cells and a mixed Th1/Th17 response are important in organic dust-induced airway disease. Annals of Allergy, Asthma, Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, Immunology. 109 (4), 266-273 (2012).
  24. Matsuo, K., et al. A CCR4 antagonist ameliorates atopic dermatitis-like skin lesions induced by dibutyl phthalate and a hydrogel patch containing ovalbumin. Biomedical Pharmacotherapy. 109, 1437-1444 (2019).
  25. Mikhak, Z., et al. Contribution of CCR4 and CCR8 to antigen-specific T(H)2 cell trafficking in allergic pulmonary inflammation. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 123 (1), 67-73 (2009).
  26. Monticelli, L. A., et al. Innate lymphoid cells promote lung-tissue homeostasis after infection with influenza virus. Nature Immunology. 12 (11), 1045-1054 (2011).
  27. Saenz, S. A., et al. IL25 elicits a multipotent progenitor cell population that promotes T(H)2 cytokine responses. Nature. 464 (7293), 1362-1366 (2010).
  28. Hoyler, T., et al. The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).
  29. Nakajima, H., Shores, E. W., Noguchi, M., Leonard, W. J. The common cytokine receptor gamma chain plays an essential role in regulating lymphoid homeostasis. The Journal of Experimental Medicine. 185 (2), 189-195 (1997).
  30. Warren, K. J., et al. RSV-specific anti-viral immunity is disrupted by chronic ethanol consumption. Alcohol. , (2016).
  31. Warren, K. J., Poole, J. A., Sweeter, J. M., DeVasure, J. M., Wyatt, T. A. An association between MMP-9 and impaired T cell migration in ethanol-fed BALB/c mice infected with Respiratory Syncytial Virus-2A. Alcohol. , (2018).
  32. Molteni, R., et al. A novel device to concurrently assess leukocyte extravasation and interstitial migration within a defined 3D environment. Lab on a Chip. 15 (1), 195-207 (2015).
  33. Bersini, S., et al. Human in vitro 3D co-culture model to engineer vascularized bone-mimicking tissues combining computational tools and statistical experimental approach. Biomaterials. 76, 157-172 (2016).
  34. Jeon, J. S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (1), 214-219 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Kemokin GradyanıCCR4 EkspresyonuILC2 İzolasyonuCD4 T HücresiTranswell AnaliziAkış SitometrisiHücre CanlılığıKemokin Taraması
Ex Vivo Transmigration Sisteminde Lenfosit Göçünün Değerlendirilmesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.