Ex Vivo Transmigration Sisteminde Lenfosit Göçünün Değerlendirilmesi

Bu orijinal transmigration yöntemi Stephen Boyden tarafından 1962 yılında Journal of Experimental Medicine^1'desunulmuştur. Kemotaksis ve keokinetik hakkında bildiklerimiz Boyden odasının gelişimi olmadan mümkün olmazdı. 1977 yılında ilk kemokin keşfinden önce, ex vivo transmigration sistemleri nötrofiller hücresel hareketlilik yükseltirken makrofajlarda hücresel hareketi durdurabilecek serum faktörleri hakkında bilgi edinmek için kullanılmıştır^1,2. Bağışıklık hücresi göçü ile ilgili olarak büyük bir bilgi zenginliği geliştirilmiştir, ve bugüne kadar, 47 kemokinler şimdi 19 ilgili reseptörleri³ile keşfedilmiştir^,4. Buna ek olarak, inhibitörleri / bu kemokin yollarının arttırıcılar çoksayıda terapötik amaçlar için geliştirme uğramıştır^5,6,7,8. Bu bileşiklerin çoğu belirli bir kemokin 9 bileşikler ve bağışıklık hücresi yanıt arasındaki doğrudan etkileşimleri anlamak için benzer transmigration odalarında test edilmiştir^.

Transmigration, veya diapedesis, iltihaplı doku içine açık enfeksiyon için sağlıklı bir inflamatuar yanıt için önemli bir süreçtir^10,11. Bir Boyden odası, transmigration sistemi, veya transwell cihazları genellikle gözenekli bir membran^1,12ile ayrılmış iki odacık oluşur. Alt oda en sık ilgi chemokine içeren medya tutar, lökositler üst odaya yerleştirilir iken. Membrandaki gözeneğin boyutu, ilgi çeken hücrenin büyüklüğüne göre seçilebilir. Bu proje için, lenfoid hücreler hücresel gelişim aşamasına bağlı olarak 7-20 μm boyutunda olduğundan, 3 μm gözenekli membran seçtik. Bu gözenek boyutu, bu hücrelerin gözeneklerin içinden pasif olarak düşmemesini, ancak kemokin degradesine yanıt olarak aktif olarak göç etmesini sağlar.

Bu protokolün en büyük avantajı maliyet etkinliğidir. In vivo transmigration zordur, çünkü hayvan taşıma ve cerrahi konusunda kapsamlı bir eğitim gerektirir ve genellikle bir araştırmacının her zaman kullanamadığı yüksek güçlü mikroskopi içerir. Transmigration'i artırıcı veya inhibe ettiği düşünülen bileşiklerin uygun maliyetli taranması in vivo görüntüleme öncesinde gerçekleştirilebilir. Transmigration sistemi sıkı bir şekilde kontrol edilince, hücreler başlangıçta transwell cihazına eklenebilir, ya da tam tersi, kemokin önce keokin inhibitörü ile tedavi edilebilir, sonra hücreler transwell cihazına eklenebilir. Son olarak, bu bariyer hücrelerinin kemokinetiklere katılımını anlamak için transwell insertinin altına transwell insert1-2 gün önce eklenebilir. Yine, sistemin bu manipülasyonlar vivo çalışmalarda daha karmaşık öncesinde belirli bir bileşiğin etkinliği hakkında önemli bilgileri belirleme güçlü bir araç sağlar.

Bir transmigration oda sistemi kullanarak çeşitli in vivo ve in vitro koşullar altında lenfosit hareketliliği değerlendirmek için etkili bir yoldur^12,13,14. Burada, bir transmigration odasında kemokinlere ex vivo lenfosit duyarlılığını değerlendirmek için optimize edilmiş bir yöntem tanımlıyoruz. Bu örnek deneyde, CD4⁺ T hücreleri ve grup 2 doğuştan gelen lenfoid hücreler (ILC2) OVA-alerjen maruziyetini takiben erkek ve dişi BALB/c farelerinden izole edildi. Alerjene meydan okuyan farelerden CCR4 + CD45⁺ Lineage- (LIN-) ILC2'nin CCR4⁺ CD4⁺ T yardımcı hücrelerden ccl17 ve CCL22'ye daha verimli bir şekilde göç edeceği hipotezi oluşturuldu. CCL17 ve CCL22 genellikle dendritik hücreler ve M2 makrofajlar tarafından üretilen kemokinler (alerjik) fenotip, diğer hücreler arasında, alerji^15,16. CCL17 ve CCL22 onlar kolayca hava yolu alevlenmeleri sırasında akciğerlerde tespit edilir gibi alerjik inflamasyon biyobelirteçleri olarak düşünülebilir^16,17,18. Daha da önemlisi, CCR4 ekspresyonu, ev tozu işledi hayvanlardan izole edilen ILC2'den elde edilen biyoinformatik verilerde ortaya konan ve benzer şekilde IL-33 ile ex vivo ile tedavi edilen saf hayvanlardan ILC2'nin işlenmemiş kontrollere göre yükseltilir ( alerjen teşvik doğuştan sitokin) CCR4^19,20düzenler. Ayrıca, Immünolojik Genom Projesi veritabanında (www.immgen.org) ILC2 verilerine göre, CCR4 mRNA bu doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinde yüksek oranda ifade edilir. Bugüne kadar ILC2'nin dokulara ticareti konusunda çok az şey bilinmektedir, ancak ILC2 ve CD4⁺ T hücrelerinin benzer transkripsiyon faktörleri ve reseptörleri ifade ettikleri için kemotaksiler ve kemokinetikler için benzer kemokinler ve reseptörler kullanmaları muhtemeldir. Böylece, CCL17 karşı CCL22 duyarlılık karşılaştırıldı, ILC2 ve CD4⁺ T lenfositler, hem erkek hem de kadın, OVA meydan hayvanlardan.

Burada açıklanan tüm yöntemler Nebraska Üniversitesi Tıp Merkezi (UNMC) ve Utah Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri tarafından gözden geçirildi ve onaylandı.

1. Reaktiflerin Kurulumu ve Hazırlanması

1. Komple RPMI (Roswell Park Memorial Institute) medya hazırlayın.
   1. 90 mL RPMI'ye 10 mL ısı yalıtılmış fetal sığır serumu (FBS) ekleyin.
   2. 100x Penisilin-Streptomisin-Glutamin 100 mL% 10 FBS RPMI 1mL ekleyin.
2. ILC2 genişletme ortamını hazırlayın.
   1. 10 mL'lik tam RPMI'ye IL-2 ve IL-33 (her sitokine 20 ng/mL) ekleyin.
   2. Stok sitokinleri 10 μg/mL ise, pipet 20 μL IL-2 ve IL-33 10 mL tam RPMI ortam içeren 15 mL'lik bir tüpiçine.
3. Akciğer Dissociation Medium hazırlayın.
   1. 250 mL eklanmamış RPMI tip 1 kollajenaz 50 mg ekleyin.
   2. Adım 1.3.1'deki 250 mL ortama 2,5 mL 100x penisilin-streptomisin-glutamin ekleyin.
   3. Tip 1 Kollajenaz'ın kullanılmadan önce tamamen çözünmesini sağlamak için ortamı hafifçe karıştırın.
4. Serumsuz RPMI hazırlayın.
   1. RPMI 200 mL lyophilized sığır serum albumin (BSA) seyreltilmesi 1 g.
   2. 100x penisilin-streptomisin-glutamin 2 mL ekleyin.
   3. BSA'nın kullanılmadan önce medyada tamamen çözünmesini sağlamak için ortamı yavaşça karıştırın.
5. CCL17 ile Geçiş Ortamı nı Hazırlayın.
   1. 10 mL serumsuz RPMI edinin ve CCL17 [50 ng/mL] ekleyin.
      1. Stok CCL17 10 μg/mL ise, 10 mL serumsuz RPMI ortama 50 μL CCL17 stok ekleyin.
6. CCL22 ile Geçiş Ortamını Hazırlayın.
   1. 10 mL serumsuz RPMI edinin ve CCL22 [50 ng/mL] ekleyin.
   2. Stok CCL22 10 μg/mL ise, 10 mL serumsuz RPMI ortama 50 μL CCL22 stok ekleyin.
7. CCR4 Antikor Boyama Kokteyli hazırlayın.
   1. Toplam 10 test için, aşağıdaki antikorların her birini 5 mL'lik bir tüpe ekleyin: anti-mouse CCR4, CD19, CD11b, CD45, ST2 ve ICOS.
      NOT: 10 örnek için antikor kokteyli nasıl yapılır örneği: Her antikor x 10 numunenin 0,5 μL'si = 1,7.1'de listelenen antikorların her birinin 5 μL'si.
   2. Toplam 10 test için, 1.7.1 adımdan antikor kokteyline aşağıdaki antikorlardan 2.5 μL ekleyin: anti-mouse CD3, CD11c ve NK1.1.
      NOT: Örnek 10 örnek için antikor kokteyli tamamlamak için: 0.25 μL x 10 örnekleri = 2.5 l CD3, CD11c ve NK1.1 antikorları.
   3. CCR4 Antikor Boyama Kokteylini numunelere eklemeye hazır olana kadar 4 °C'de saklayın. Kullanılmadığı takdirde 1 hafta sonra antikor kokteylini atın.
8. 1x Stabilizatör fikstür hazırlayın.
   1. 5 mL 3x stabilizatör konsantresine 10 mL deiyonize su ekleyin

2. Alerjene meydan okuyan BALB/c Farelerin hazırlanması

NOT: Erkek ve dişi BALB/c fareleri Charles River (UNMC) veya Jackson Laboratories'den (Utah Üniversitesi) 6-8 haftalık kensatın alındı.

1. Alışma (1 hafta) sonra, OVA tüm hayvanları duyarlı.
   1. 5 mL polistiren tüpte alüminyum hidroksite (20 mg/mL) 100 μg/mL OVA adsorded'i birleştirin.
   2. Tüpü karıştırın ve hemen 500 μL OVA-şap süspansiyonuna 1 mL, 28 G şırınga (insülin şırıngası) içine çekin.
   3. Fareyi izofluran içeren bir çan kavanozuna yerleştirin (1-2 mL yanlış bir zeminin altına, böylece hayvan doğrudan isoflurane'de durmuyor). Farenin yaklaşık 1-2 dakika veya solunum hızı düşene kadar anestezi altında gitmesine izin verin.
   4. Hızlı bir şekilde arka ve omuzlarda kürk tarafından fare almak ve fare^21,22başına OVA-şap intraperitoneally 100 μL enjekte .
   5. Fareyi kafesine geri yerleştirin ve hareket kabiliyetini yeniden kazanmak için izleyin; bu 2-5 dakika içinde meydana gelmelidir.
2. Sensitizasyondan yedi gün sonra, tüm hayvanları 20 dakika boyunca bir nebülizasyon odasında (Data Sciences International) steril salinle seyreltilmiş intranazal (i.n.) %1.5 OVA'ya tabi takın.
   1. Fareleri kafeslerinden çıkarın ve hayvan bulutsusu odasına yerleştirin. Odanın kapağını kapatın.
   2. Nebülizasyon hortumunu nebülizasyon odasındaki giriş emzilesine takın.
   3. Nebülizör üzerindeki nebülizasyon kabına steril salinle seyreltilmiş %1,5 OVA'nın 30 mL'sini ekleyin.
   4. Nebülizörü açın ve odanın 20 dakika boyunca sisle dolmasını bekleyin.
   5. Nebülizörü kapatın ve sisin durulmasına izin verin.
   6. Hayvanları kafeslerine geri getirin.
3. Alerjik inflamasyona neden olmak için 5 gün üst üste 5 kez toplam adım 2.2 tekrarlayın.

3. CD4⁺ T Hücrelerinin Dalaklardan ve Akciğerlerden OVA'ya Meydan Okuyan Farelerden İzolasyon

1. İnsanca co₂ boğulma tarafından tüm OVA tedavi erkek ve dişi hayvanlar tarafından onaylanmış IACUC protokollerine göre, grup başına 2-3 hayvan kullanarak, deney başına.
2. Besinler in akciğerleri ve hayvanlardan dalak ve hayvanın doku tipi ve cinsiyetine göre ayrı ayrışma tüpleri dokuları yerleştirin²³.
3. 'Akciğer' protokolünü kullanarak otomatik doku dissosiyatöründe 500 μL'lik akciğer dokusunu (25 U/mL; kollajenaz, tip 1) ayrıştırın.
   1. 3.2 ve 3.3'ü toplam iki kez tekrarlayın.
4. Otomatik doku dissosiyatöründeki 'dalak' protokolünü kullanarak 500 μL'lik komple RPMI media'da dalak dokusunu ayrıştırın.
   NOT: Geri kalan adımlar steril teknik kullanılarak Biyolojik Güvenlik kabininde yapılmalıdır.
5. Akciğer ve dalak homojeni içeren ayrışma tüplerini sırasıyla 5 mL ek Akciğer Ayrıştırma media veya Komple RPMI ile durulayın.
6. Filtre hücresi süspansiyonları 40 μm hücresüzden geçirin ve 50 mL konik tüpler halinde toplayın.
7. İnkübasyon akciğer ilerlü15-30 dakika boyunca 37 °C'lik bir kuluçka makinesinde %5 CO₂ ile daha fazla ayrıştırılar.
8. Akciğere 5 mL Komple RPMI ekleyin ve santrifüj kullanarak 50 mL tüplerin altındaki hücreleri dalak homojen ve pelet; Oda sıcaklığında 378 x g (RT) 5 dk.
9. Tek bir 50 mL konik tüp içine splenositler ve akciğer hücreleri birleştirin ve otomatik hücre sayacı kullanarak toplam hücre sayılarını belirlemek.
10. Ayırma tamponunda erkek ve kadın hücre süspansiyonlarını 1 x 10⁸ hücre/mL'ye ayarlayın ve 5 mL polistiren tüpe ekleyin.
    NOT: Zenginleştirme Protokolü, dalak ve akciğerlerden daha fazla hücre elde edildiğinde 14 mL polistiren tüplere kadar ayarlanabilir. Bu protokol grup başına 2-3 fareden dokular için tasarlanmıştır; bu nedenle 5 mL'lik bir tüp yeterli olacaktır.
11. ILC2 zenginleştirme protokolüne göre ILC2 yalıtımı için toplam hücrelerin yaklaşık üçte ikisini kullanın.
    1. Hücre süspansiyonuna antikor kokteyli (50 μL/mL) ekleyin ve RT'de 5 dakika kuluçkaya yatırın.
    2. 30 s için girdap hızlı küreler ve hücre süspansiyon 75 l /mL oranında numuneye ekleyin. Yavaşça karıştırın ve RT 5 dakika kuluçka.
    3. Bölme tamponu ile 3 mL toplam hacmine kadar tüp top ve 8 odalı kolay ayırma mıknatıs yer. RT'de 3 dakika kuluçka.
    4. Mıknatısı ileri ye doğru (tüpün arkasına yapışmış küre-antikor hücre komplekslerinden uzağa) ve hücre süspansiyonundan temiz bir 5 mL tüpe pipet le kaplayın.
    5. Tüplere 1,5 mL tam RPMI ekleyin ve 378 x g'de 5 dakika RT'de santrifüj ekleyin.
    6. Hücre peletinden ortamı dökün ve ILC2'yi mL başına 1 x 10⁷ hücrede yeniden askıya alın.
    7. U-alt, 96-iyi plaka iyi başına erkek ve kadın ILC2 100 uL yerleştirin ve her kuyuya ILC2 Genişleme Medya 100 μL ekleyin.
    8. ILC2 genişletmek için 4-5 gün boyunca hücreleri kuluçka.
    9. ILC2'yi 5 mL'lik bir tüpe toplayın ve 4,5 mL'ye kadar serumsuz RPMI ekleyin. Hücreleri 378 x g'de 5 dk RT'de santrifüj edin.
    10. Serumsuz RPMI'de hemacytometre kullanarak hücreleri sayın ve mL başına 1 x 10⁷ ILC2'de yeniden askıya alın.
12. Fare^CD4 + T hücre izolasyon protokolüne göre birkaç değişiklik le yapılan CD4⁺ T hücre yalıtımı yordamı için kalan hücreleri kullanın.
    1. CD4 T hücre zenginleştirme süspansiyonuna fare serumu (50 μL/mL) ekleyin.
    2. Numuneye Izolasyon kokteyli (50 μL/mL) ekleyin ve RT'de 10 dakika kuluçkaya yatırın.
    3. Girdap hızlı küreler 30 s ve 75 μL/mL oranında numuneye ekleyin.
    4. Hücre süspansiyonuna yavaşça karıştırın ve 2,5 dakika ve RT için kuluçkaya yatırın
    5. Numuneleri 3 mL'ye kadar toplayın ve 5 mL'lik tüpleri 8 odalı kolay ayırma mıknatısına yerleştirin ve 5 dakika boyunca RT'de kuluçkaya yatırın.
    6. Mıknatısı ileri ve pipetle hücre süspansiyonuna temiz bir 5 mL boruya getirin.
    7. Tüplere 1,5 mL serumsuz RPMI ekleyin ve 378 x g'de 5 dakika RT'de santrifüj ekleyin.
    8. Hücre peletinden ortam dökün ve serumsuz RPMI'de CD4⁺ T hücrelerini mL başına 1 x 10⁷ hücrede yeniden askıya alın.

4. FLOW Sitometri ile OVA'ya meydan okuyan Hayvanlardan CD4⁺ T Hücrelerinde CCR4 Ekspresyonu ve Grup 2 Doğuştan Gelen Lenfoid Hücreleri (ILC2) belirleyin

NOT: Steril olmayan teknikler olduğu için aşağıdaki adımlar açık bir bankın üst kısmında gerçekleştirilebilir.

1. 3.11.10 ve 1-2.5 x 10⁶ CD4⁺ T hücrelerinden 3.12.8 adımından ayrı 5 mL tüplerde yaklaşık 1-2,5 x 10⁵ ILC2 hücreleri elde edin.
   1. Lekesiz bir kontrol olarak en az 5,0 x 10⁴ CD4+ T hücreden oluşan ek bir tüp tutun.
2. Hücreleri 100-200 μL FACS tamponunda askıya alın ve her tüpe 1 μL Fc Block ekleyin, ardından 10 dakika boyunca buzüzerinde (veya 4 °C'lik bir buzdolabında) kuluçkaya yatırın.
3. RT'de 5 dakika boyunca 378 x g'de her tüpe 1-2 mL FACS Tampon ve santrifüj ekleyin.
4. Supernatant dökün ve FACS Tampon 100-200 μL hücreleri yeniden askıya.
5. 'Lekesiz' hücreleri içeren tüp hariç her tüpteki hücre süspansiyonuna 37,5 l CCR4 Antikor Boyama Kokteyli ekleyin.
6. Tüpleri 20-30 dakika boyunca buz üzerinde veya 4 °C'lik bir buzdolabında kuluçkaya yatırın.
7. RT'de 5 dakika boyunca 378 x g'de her tüpe 1-2 mL FACS Tampon ve santrifüj ekleyin.
8. Supernatant dökün.
9. 4.7 ve 4.8 adımlarını tekrarlayın.
10. Her tüpe 250-300 μL 1x sabitleme fiksatifi ekleyin (Bkz. Malzeme Tablosu).
11. CcR4 antikor kokteylindeki her antikor için tek renkli boncuk kontrolleri, tazminat boncukları ile sağlanan protokole göre hazırlayın.
    1. Vortex tazminat boncuklar.
    2. Her tek renkli kontrol tüpüne boncuk bir damla ekleyin.
    3. CCR4 Antikor kokteylindeki her antikordan 1 μL'lik bir taneyi kendi etiketli tüpüne ekleyin.
    4. 4 °C'lik bir buzdolabında veya buz üzerinde 10 dakika boyunca hafifçe karıştırın ve kuluçkaya yatırın.
    5. Tüm tüplere 1-2 mL FACS Tampon ekleyin ve 378 x g'de 5 dk RT'de santrifüj.
    6. Supernatant dökün ve FACS tampon 200 μL boncuklar resuspend.
    7. Tüm numuneler lekeli ve akış sitometre üzerinde analiz edilinceye kadar tek renkli kontrolleri soğutun.
12. Lekelenmemiş hücreleri, tek renkli kontrolleri ve akış sitometresindeki deneysel örnekleri fiksasyondan 24 saat sonra analiz edin.

5. Ex Vivo Transmigration Prosedürü

NOT: Aşağıdaki adımlar steril teknik gerektirdiğinden Biyolojik Güvenlik Kabini'nde yapılmalıdır.

1. ILC2'yi adım 3.11.10'dan ve CD4 T hücrelerini 3.12.8 adımından edinin ve deney için gereken transwell uçlarının sayısını belirleyin.
   NOT: Örnek: 3.12.8 adımdan zenginleştirilmiş CD4 T hücrelerinin 1,2 mL'si için 1,2 x 1.000 μL = 1.200 μL çarpın; sonra 1.200 uL'yi 100 μL = 12'ye bölün, CD4 T geçişi için gereken kesici uç sayısı.
2. 24 kuyulu bir plakanın orta sıralarından 3 μm transwell kesici uçları yavaşça hareket ettirin.
3. CCL17 ile 500 μL'lik geçiş ortamını kuyuların yaklaşık üçte birine ekleyin.
4. Kuyuların üçte birine CCL22 ile 500 μL'lik geçiş ortamı ekleyin.
5. Kuyuların son üçte birine kemokin içermeyen 500 μL serumsuz RPMI ekleyin.
6. Plakanın kapağını alt kuyulara yerleştirilen uygun transmigration ortamıyla net bir şekilde etiketle.
7. Transwell ekler geri çeşitli tedaviler içeren kuyulara yerleştirin.
8. Her kesici uçtaki en üst kuyuya 100 μL CD4 T hücresi veya ILC2 ekleyin. Hücre süspansiyonuna transwelllerde yukarı ve aşağı karıştırmayın veya pipetlemayın, çünkü bu deney sonuçlarını karıştırabilir.
9. Plakanın kapağını her kuyuya yerleştirilen hücre tipiyle net bir şekilde etiketlendirin ve hücrelerin eklendiğinin tarih ve saatini yazın.
10. Tüm hücreler ortamla transwell kesici uçlara yerleştirilene kadar 5,2 ile 5,9 adımlarını tekrarlayın.
11. Plakayı % 5 CO 2 ile %5 CO₂ ile 37 °C'lik bir kuluçka makinesine yerleştirin.

6. Ex Vivo Transmigration'ın Nicelleştirilmesi

1. Plakayı kuvözden yavaşça çıkarın ve orta sıralardan tüm transwell kesici uçlarını hemen üstündeki veya altındaki boş kuyulara çıkarın.
2. Hücreleri, transwell eklerin alt ve üst kuyularından ÜST veya ALT ile etiketlenmiş tüplere, CCL17, CCL22 veya ortamla, hücre türüyle ve çoğaltma numarasıyla (deney başına en az 3 çoğaltma) toplayın.
3. Alt kuyuları 500 μL 1x PBS ile durulayın ve bu durulamayı ilgili tüpe toplayın.
4. Üst kuyuları 250 μL 1x PBS ile durulayın ve bu durulamayı ilgili tüpe toplayın.
5. Rt 5 dk için 378 x g santrifüj ile hücreleri pelet.
6. Yavaşça hücre pelet tüm supernatant kapalı pipet.
7. T hücrelerini ve ILC2'yi 1x PBS'nin 50 μL'ine yeniden askıya alın.
8. Hücre süspansiyonlarının 10 μL'sini alın ve %0,4 trypan mavisi 90 μL'ye ekleyin.
9. Otomatik hücre sayacındaki hücreleri say.
   1. %canlılığı kaydedin.
   2. Her örnek için mL başına hücre sayısını kaydedin.
   3. Üst ve alt odadaki tedavi başına toplam hücre sayısını belirleyin; hücre sayılarını kaydedin.

CD4+ T hücrelerinde CCR4 ekspresyonu ve ILC2.

Ex vivo transmigration deneyinin başarısı için, lenfositlerin CCL17 ve CCL22'ye CCR4 ile yanıt verip vermediğini belirlemek zorunludur; bu nedenle hem CD4+ T hücrelerinde hem de ILC2'de ccr4 ekspresyonu akış sitometrisi ile belirledik. OVA'ya özgü CD4+ yardımcı T hücrelerinin CCR4'ü ifade ettiği iyi bilinmekle birlikte, ILC2'deki CCR4 ekspresyonu daha az bilinir. Şekil 1, erkek ve dişi, OVA-meydan okuyan BALB/c farelerinden CD4+ T hücrelerinde(Şekil 1A,C)ve ILC2(Şekil 1B,D)CCR4 ekspresyonunun temsili sonuçlarını göstermektedir. Akış sitometrisi allofikomisin (APC) konjuge monoklonal antikor kullanarak CCR4 saptanması için kullanılmıştır. Varyans Tek Yönlü Analizi (ANOVA) kullanarak, erkek ve kadın konaklar arasında CCR4 ekspresyonunda fark olmadığını belirledik(Şekil 1A–D),ancak ILC2'deki hücre bazında (MFI) CCR4 ifadesi CD4'e göre daha yüksekti + T hücreleri (Şekil 1C Ile Karşılaştırıldığında Şekil 1C). Bu sonuçlar, ilc2 ve CD4+ T hücrelerinin aşağıdaki deneyde CCL17 ve CCL22'ye yanıt vermesi gerektiğini göstermede önemlidir.

CD4+ T hücrelerinin bir transmigration sisteminin üst ve alt odalarındaKI CCR4 ligandlarına duyarlılığı.

ERKEK, OVA-meydan balb/c farelerinden CD4+ T hücreleri akciğerlerden ve dalaklardan izole edilerek 3 μM gözenekli membran ile ayrılmış bir transmigration cihazının üst haznesine yerleştirildi (Şekil 2). OVA ile tedavi edilen farelerin in vivo hazırlanmasının bir özeti(Şekil 2A) ve transmigration prosedürü(Şekil 2B)referans olarak gösterilmiştir. CCL17 (25 ng/mL) ve CCL22 (25 ng/mL) kombinasyonu, üst hazneye, alt ve alt bölmelere yerleştirildi ve(Şekil 2C),(1) OVA'ya meydan okuyan hayvanlardan cd4+ T hücrelerinin CCR4'e yanıt verdiğini doğrulamak için ligandlar ve (2) bu kemokin kaynaklı göç, T hücrelerinin keokin gradyan yanıt olarak gözenekleri ile hareket ettiği aktif bir süreç oldu, ve lenfositler kemokin bağımsız gözenekleri ile hareket değildi. CD4+ T hücrelerinin uyarılma olmadan 3 μM gözeneklerinden geçemeyeceğini göstermek için bir ortam (Kemokin yok) kontrolü eklenmiştir. Bu durumda, hücrelerin en yüksek yüzdesi üst odada kaldı. Kemokinler aynı anda üst ve alt hazneye yerleştirildiğinde, alt odadaki toplam T hücrelerinin R'sini ve üst odadaki hücrelerin H'ini tespit ettik (ÜST/ALT tedavi). Beklendiği gibi, kemokinin bulunduğu bölmedeki hücrelerin en yüksek yüzdesini tespit ettiğimiziçin, sadece üst veya sadece alt odaya yerleştirilen kemokine yanıt olarak hareket etti.

CD4+ T hücrelerinin ve ILC2'nin CCL17 ve CCL22'ye ex vivo transmigration aparatlarında duyarlılığı.

CD4 T hücreleri ve ILC2 erkek ve dişi, OVA-meydan fareler akciğerler ve dalak lar sonra bir transwell transmigration aparatÜst odasına yerleştirilir izole edildi(Şekil 3). Cihazın alt odası işlenmemiş hücre kültürü ortamı, CCL17 içeren ortam veya CCL22 içeren ortamlarla doluydu. Temsili sonuçlar% 14 'den az (13,37 + 6,5%) daha az olduğunu göstermektedir ortam kontrol koşullarında geçirilen hücrelerin(Şekil 3A-D). CCL22'ye yanıt olarak, her iki hücre tipi, ister erkek ister kadın konaklardan olsunlar, CCL22 'ye(Şekil 3A–D)yanıt verdi, ancak CCL17 sonuçları daha az tutarlıydı. CCL17 sadece kadın CD4 T hücreleri ve ILC2 için sadece medya ile karşılaştırıldığında önemli göç indüklenen(Şekil 3C,D). CCL17 tedavisi erkek CD4+ T hücreleri veya erkek ILC2(Şekil 3A,B)ve CCL22 erkek ILC2'de CCL17'den daha fazla göç emdirildi(Şekil 2B)için ortamdan farklı değildi.

Düşük canlılığa sahip CD4+ T hücreleri için suboptimal transmigration sonuçları.

Alt optimal sonuçlar, araştırmacıya, transmigration deneyi düzgün çalışmadığında neler beklenebilir bir örnek vermek için oluşturulmuştur(Şekil 4). Bu protokole göre erkeklerden cd4+ T hücrelerini izole ettik ve transmigration sisteminin en üst kuyusuna yerleştirdik. CD4+ T hücreleri eklendikten sonra plaka ilk 24 saat oda sıcaklığında kaldı, daha sonra plaka kuluçka döneminin kalan 24 saat için kuvöze taşındı. Beklendiği gibi, CCL17 ve CCL22(Şekil 4A)doğru hiçbir göç tespit ve hücrelerin canlılığı özellikle düşüktü (<15%) üstteki hücreler için (Şekil 4B). Bu hatalı sonuçlar, optimum sonuçlar elde etmek için bu protokolde ayrıntılı olarak belirtilen doğru sıcaklık ve koşulları kullanmanın önemini vurgular.

Şekil 1: CD4+ T hücreleri ve ILC2 ccr4 ifade. 7-9 haftalık, erkek ve kadın, BALB/c farelere bir kez 100 μL OVA-adsorbe ile alüminyum hidroksit enjekte edildi (500 μg/mL; OVA ve 20 mg/mL alüminyum hidroksit) ilk inden 7 gün önce 5, tekrarlayan, günlük hava yolu zorlukları ile 1.5% OVA tuzlu. Alerjene meydan okuyan hayvanlar insancıl bir şekilde ötenazi yapıldı ve ILC2 ve CD4+ T hücrelerinin izolasyonu için akciğer ve dalak dokusu toplandı. Hücrelerin küçük bir aliquot sonra lekeli ve her hücre tipinde CCR4 düzeyini belirlemek için akış sitometri tarafından analiz edildi. (A) CD4+ T hücrelerinin FREKANSI CCR4+ olan hücrelerin OVA+ farelerden, hata çubukları ortalamanın standart hatasını temsil ettiği (+ SEM). (B) CCR4+ (+SEM) olan ILC2 frekansı. (C, D) CCR4'ün ortalama floresan yoğunluğu (+SEM) on (C) CD4+ T hücreleri ve (D) ILC2. Bu verileri oluşturmak için toplam 13 fare kullanıldı ve akış deneyi iki kez tekrarlandı ve deney başına her bir tedavinin 3 kez tekrarlandı. Önemi Tek Yönlü ANOVA tarafından belirlendi; n.d. gruplar arasında herhangi bir fark olmadığını gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: CD4+ T hücrelerinin bir transmigration sisteminin üst ve alt odalarındaKI CCR4 ligandlarına duyarlılığı. Erkek BALB/c fareleri, tavuk yumurtası ovalbumin (OVA) ve CD4+ T hücreleri ile hassaslaştırılmış ve meydan okunmuş dalak ve akciğerlerden izole edilmiştir(A, B). Bu transmigration deneyi için CD4+ T hücreleri serumsuz ortamda 1 x 107 hücre/mL olarak askıya alındı. CCL17 ve CCL22 serumsuz ortama 50 ng/mL konsantrasyonla (her kemokinin 25 ng/mL'si toplam 50 ng/mL) olarak eklenmiştir. Kemokin içeren ortam sadece üst hazneye, sadece alt odaya veya hem üst hem de alt bölmelere eklenmiştir. Alt kuyulara toplam 500 μL'lik transmigration media hacmi eklendi ve üst kuyuya 100°L hücresel süspansiyon (1 x 106 hücre/kuyu) eklendi. Transmigration kültürde 48 saat sonra ölçüldü(C). Bu veriler tek bir deneyden elde edildi, doku toplama için 3 OVA ile tedavi edildi, erkek fareler kullanıldı ve tedavi başına 3 kopya üretildi. İstatistiksel anlamlılık Tek Yönlü ANOVA ile belirlendi; *p < 0.05. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: CD4+ T hücrelerinin ve ILC2'nin CCL17 ve CCL22'ye ex vivo transmigration aparatlarında duyarlılığı. Fareler CD4+ T hücresi ve ILC2 izolasyonu için Şekil 1'de olduğu gibi dalak ve akciğerlerden hazırlandı. CD4+ T hücreleri ve ILC2 serumsuz ortamda 1 x 107 hücre/mL olarak askıya alındı. CCL17 veya CCL22 serumsuz ortama 50 ng/mL konsantrasyonla eklendi. Alt kuyulara 500 μL transmigration media eklendi ve üst kuyuya 100°L hücresel süspansiyon (1 x 106 hücre/kuyu) eklendi. Göç kültürde 48 saat sonra ölçüldü. (A) CD4+ T hücreleri ve erkek konaklardan (B) ILC2 medya ile kontrol, CCL17 veya CCL22 olarak ele alındı. Benzer şekilde, (C) kadın CD4+ T hücreleri ve (D) kadın ILC2 media, CCL17 veya CCL22 ile tedavi edildi. Bu verileri oluşturmak için toplam 14 fare kullanıldı. Transmigration deneyi 4 kez tekrarlandı ve deney başına her tedavinin 3-6 kez tekrarlandı. Önemi Tek Yönlü ANOVA tarafından belirlendi; *p < 0.05, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Düşük canlılığa sahip CD4 T hücreleri için suboptimal transmigration sonuçları. Naif erkek BALB/c fareleri akciğer ve dalak doku toplama ve CD4+ T hücre izolasyonu için Şekil 1, Şekil 2ve Şekil 3'teolduğu gibi edinilmiştir. CD4 T hücreleri transmigration cihazının üst haznesine eklendi ve CCL17, CCL22 içeren serumsuz ortam veya alt kuyuya kemokin (medya kontrolü) eklendi. Deneyin ilk 24 saatiçin plaka oda sıcaklığında bırakılmış, daha sonra ek bir 24 saat için% 5 CO2 ile 37 °C inkübatör taşındı (A) 24 saat sonra üst ve alt kuyularda kalan hücrelerin yüzdesi 24 saat. (B) C canlılığı Kötü kuluçka koşullarını takiben üst ve alt odadaki D4+ T hücreleri. Bu veriler tek bir deneyden elde edildi, doku toplama için 3 saf erkek fare kullanıldı ve tedavi başına 3 kopya üretildi. İstatistiksel anlamlılık belirlenemedi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların ifşa etmesi gereken herhangi bir mali açıklama veya çıkar çatışması yoktur.