Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İnsan S100A12 ve Bağışıklık Hücre Stimülasyonu için Iyon kaynaklı Oligomerlerin Saflaştırılması

5.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/60065

⸱

29 Eylül 2019

 ,  , 
1Department of Pediatric Rheumatology and Immunology, University Children's Hospital

Bu makalede

Özet

Bu protokol, rekombinant etiketsiz kalsiyum bağlayıcı protein S100A12 ve insan monosit stimülasyonu tahlilleri için iyonkaynaklı oligomerler için bir arıtma yöntemini tanımlar.

Özet

Bu protokolde, bağışıklık hücresi stimülasyonu için Escherichia coli kültüründen insan kalsiyum bağlayıcı protein S100A12 ve iyon kaynaklı oligomerleri arındırmak için bir yöntem açıklıyoruz. Bu protokol, bir aniyon değişimi kromatografisi sütununda protein ön arıtma ve hidrofobik etkileşim sütununda bir sonraki parlatma adımlarını içeren iki aşamalı bir kromatografi stratejisine dayanmaktadır. Bu strateji yönetilebilir maliyetlerle yüksek saflıkta ve verim S100A12 protein üretir. Bağışıklık hücreleri nihai kalıntı endotoksin kontaminasyonfonksiyonel tahliller için endotoksin içermeyen protein elde etmek için dikkatli izleme ve daha fazla temizlik adımları gerektirir. Endotoksin kontaminasyonlarının çoğu aniyon değişimi kromatografisi ile dışlanabilir. Artık kontaminasyonları tüketmek için, bu protokol santrifüj filtreleri ile bir kaldırma adımı açıklar. Mevcut iyon gücüne bağlı olarak S100A12 farklı homomultimerler içine düzenleyebilirsiniz. Yapı ve fonksiyon arasındaki ilişkiyi araştırmak için, bu protokol s100A12 proteininin iyon tedavisini ve ardından S100A12 oligomerlerini stabilize etmek için kimyasal crosslinking'i ve bunların boyut-dışlanma ile ayrılmasını tanımlar. Kromatografi. Son olarak, saflaştırılmış proteinin biyolojik aktivitesini doğrulayan ve LPS içermeyen hazırlığı doğrulayan hücre bazlı bir test tanımlıyoruz.

Giriş

S100A12 ağırlıklı olarak insan granülositleri tarafından üretilen kalsiyum bağlayıcı bir proteindir. Protein (sistemik) inflamasyon sırasında aşırı ifade edilir ve serum düzeyleri, özellikle sistemik juvenil idiyopatik artrit (sJIA), ailesel Akdeniz ateşi (FMF) veya Kawasaki hastalığı (KD) gibi (oto)inflamatuar hastalıklar hakkında bilgi verebilir hastalık aktivitesi ve tedaviye yanıt. Toll benzeri reseptörler (TLR) gibi örüntü tanıma reseptörlerine (PrR) bağlı olarak, doğuştan gelen bağışıklık sistemi lipopolisakkaritler (LPS) veya hasar ilişkili moleküler desenler (DAMP) gibi patojen ilişkili moleküler desenler (PAMP' ler) tarafından aktive edilebilir; ayrıca 'alarmins' olarak da adlandırılır). DAMP'lar hücresel proteinler, lipidler veya nükleikasitler1 gibi endojen moleküllerdir. DAMP fonksiyonları iyi calgranulin protein ailesinin üyeleri için tarif edilir, S100A8/A9 ve S100A122, ayrıca divalent metal iyon-şelat antimikrobiyal peptidler 3 olarak faaliyet bildirilmiştir3,4, 5,6. Mevcut iyon gücüne bağlı olarak S100A12, S100 ailesinin diğer üyeleri gibi, farklı homomultimerler içine düzenlemek ve yakın zamana kadar PRR-etkileşim, özellikle TLR4 s100A12-oligomerizasyon etkisi bilinmemektedir.

Proteinin monomerik formu (92 amino asit, 10.2 kDa) esnek bir bağlayıcı ile birbirine bağlanan iki EF-el sarlis-döngü-sarlis yapılarından oluşur. C-terminal EF-eli klasik Ca2+-bağlayıcı motifiçerirken, N-terminalEF-eli S100 proteine özgü genişletilmiş döngü yapısını ('pseudo-EF-hand') sergiler ve azaltılmış Ca2+-yakınlığı ortaya çıkarır. Ca2+-S100A12 ile bağlanma proteinlerin C-terminus'unda büyük bir konformasyonel değişikliğe neden olabilir, bu da her monomerde hidrofobik bir yamanın maruz kalmasına neden olur ve dimerizasyon arayüzünü oluşturur. Bu nedenle, fizyolojik koşullar altında, S100A12 tarafından oluşturulan en küçük kuaternary yapı, tek tek monomerlerin antiparalel yönde olduğu kovalent olmayan bir dimer (yaklaşık 21 kDa) dir. Dimer olarak düzenlendiğinde, S100A12 sequester Zn2 + yanı sıra diğer divalent metal iyonları bildirilmiştir, örneğin, Cu2 + yüksek yakınlık ile7. Bu iyonlar S100A12 dimer arabiriminde bir alt birim ve H85 amino asitleri H15 ve D25 yanı sıra anti-paralel diğer alt birim8,9,10H89 tarafından koordine edilir. Daha önceki çalışmalarz Zn2 +yüklü S100A12 homo-tetramer (44 kDa) içine protein organizasyonu neden olabilir ve artmış Ca2 +-afinite11,12, son metal titrasyon neden olabileceğini öne süre çalışmalar6 Zn2 +proteinin afinitesini artırmak için S100A12 tarafından Ca 2+-bağlayıcı öneririz. S100A12 EF-hands tamamen Ca 2+tarafından işgal edildikten sonra, ek Ca2 + dimers arasında bağlamak için düşünülmektedir, hexamer oluşumunu tetikleyen (yaklaşık 63 kDa). Hexameric quarternary yapısının mimarisi tetramerin mimarisinden açıkça farklıdır. Tetramer arabiriminin, hexamerformasyonu 10'afayda sağlayan yeni dimer-dimer arabirimlerine yol vermek için bozulduğu öne sürüldü. S100A12 neredeyse sadece insan granülositler tarafından ifade edilir nerede tüm sitosolik protein13yaklaşık% 5 oluşturmaktadır. Onun DAMP fonksiyonu nda S100A12 tarihsel gelişmiş glisasyon son ürünler için multi-ligand reseptöragonist olarak tarif edildi (RAGE), sonra ekstrasellüler yeni tanımlanan RAGE bağlayıcı protein denir (EN-RAGE)14. Daha önce hem RAGE hem de TLR415için biyokimyasal S100A12-bağlayıcı rapor olsa da, biz son zamanlarda bir TLR4 bağımlı şekilde S100A12 stimülasyon yanıt insan monositler gösterdi16. Bunun için S100A12'nin Ca2+/Zn2+indüklenen hexameric quarternary yapısına düzenlenmesigerekmektedir 16.

Burada rekombinant insan S100A12 ve bağışıklık hücresi stimülasyonu için iyon kaynaklı oligomerler için bir arıtma prosedürü tarif16,17. Bu iki aşamalı kromatografi stratejisine dayanmaktadır, başlangıçta izole etmek ve protein konsantre ve toplu kontaminasyonkaldırmak için bir aniyon değişimi sütun içeren (örneğin, endotoksinler / lipopolisakkaritler)18. İon-exchange kromatografi resinleri farklı net yüzey yükleri temelinde ayrı proteinler. S100A12 (izoelektrik nokta 5.81), pH ile bir tampon sistemi 8.5 ve güçlü bir aniyon değişimi reçine gibi asidik proteinler için iyi bir ayırma yol açar. Bağlı proteinler yüksek tuz tampon gradyanı ile eluted edildi. Elüsyon tamponundaki iyonik mukavemetartışı ile negatif iyonlar rezorin yüzeyindeki yükler için proteinlerle rekabet eder. Proteinler net yüklerine bağlı olarak ayrı ayrı eute ve bunun sonucu olarak, burada açıklanan tamponlar aşırı ifade edilen S100A12 proteinini izole edip konsantre etmelerine olanak sağlar. Lipopolisakkaritlerde negatif yüklü gruplar nedeniyle, bu moleküller de aniyon değişimi reçineler bağlanır. Ancak, onların yüksek net şarj uygulanan yüksek tuz gradyan daha sonra elüsyon sonuçlanır. Arınma prosedürünün ikinci adımı parlatma amacıyla getirilmiştir. Bu, S100A12'nin kalsiyum bağlama yeteneğini kullanır ve hidrofobik etkileşim sütununda kalan yabancı maddeleri ortadan kaldırır. S100A12 kalsiyum bağlanması konformasyonel değişime ve protein yüzeyinde hidrofobik yamalar maruz kalmasına yol açar. Bu durumda, S100A12 resenin hidrofobik yüzeyi ile etkileşime girer. EDTA tarafından kalsiyum-şelat üzerine, bu etkileşim tersine çevrilir. S100A12, başta kalsiyum ve çinko olmak üzere iyonların varlığında homomerik oligomerlere dönüşür. Farklı oligomerlerin yapı-fonksiyon ilişkilerini incelemek için dimerik, tetramerik ve hexameric rekombinant S100A12'yi kimyasal bir çapraz bağlantı ile stabilize ettik ve kompleksleri boyut dışlama kromatografisi sütununda ayırdık. Son olarak, saflaştırılmış proteinin ve iyonkaynaklı oligomerlerin işlevselliğini ve biyolojik aktivitesini analiz etmek için, S100A12 ve LPS uyarılmış monositin sitokin salınımı karşılaştırılabilir.

S100A12'yi arındırmak için şimdiye kadar çeşitli yöntemler tanımlanmıştır. Jackson ve ark.19, örneğin, bir aniyon değişimi sütun ve sonraki boyut dışlama kromatografisi yoluyla arınma ile bir protokol yayınladı. Boyut dışlama sütununda saflaştırma parlatma iyi sonuçlar doğurur, ancak örneğin sınırlı yükleme hacimleri―ölçeklenebilirlik açısından daha az esnektir. Kiss ve ark.20tarafından yayınlanan farklı bir yaklaşım, etiketli proteinin Ni2+ yakınlık sütunu üzerinden saflaştırılmasını ilk saflaştırma adımı olarak tanımlar, ardından etiketi ve daha fazla saflaştırma adımını çıkarmak için enzimatik bölünme yi takip eder. Önseki çalışmaların aksine19,20, bu protokolde açıklandığı gibi üretilen protein bağışıklık hücreleri üzerinde deneyler için belirlenir. Bu nedenle, bakteri kültüründen kalıntı endotoksin kontaminasyonu bir meydan okumadır. Endotoksin çıkarılması için farklı yaklaşımlar şimdiye kadar tarif edilmiş olmasına rağmen, herhangi bir protein çözeltisi için eşit derecede iyi çalışan bir yöntem yoktur21,22.

Özetle, protokolümüz bir bakteri sisteminde etiketsiz ifadenin avantajlarını verimli endotoksin giderme ve yüksek saf protein verimi ile birleştirir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

NOT: Tamponlar ve stok çözümlerinin hazırlanması için lütfen Ek Tablo 1'e bakın.

1. E. coli protein ekspresyonu

  1. Klonlama
    1. Klon etiketiz insan S100A12 (NCBI Referans Sırası: NP_005612.1) içine bakteriyel ekspresyon vektör pET11b. Proteini ifade etmek için yapıyı E. coli BL21'e (DE3) dönüştürün.
  2. Kültür
    1. 14 mL yuvarlak alt tüpte 5 mL büyüme ortamına (LB suyu 100 μg/mL ampisilin) tek bir koloni aşılayarak bir başlangıç kültürü hazırlayın. Gece boyunca 37 °C'de 220 rpm'de sallayarak kuluçkaya yatırın. 2 L Erlenmayer şişesinde 400 mL'lik büyüme ortamına gece kültürünün 2−4 mL'sini aktarın ve 220 rpm'de sallayarak kültürü 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
      NOT: Ana kültürün başlangıç yoğunluğu 600 nm (OD600) = 0.1 optik yoğunluk olmalıdır.
    2. Büyüme sırasında OD600'ü izleyin. OD600 = 0.5−0.6'da 1 mM'lik son konsantrasyona 1 M izopropil-ß-D-tiogalaktopiranosid (IPTG) ekleyerek protein ekspresyonunu indükleyin. Ek 4 saat için 37 °C ve 220 rpm'de kuluçkaya yatırın.
      NOT: Genel olarak, 37 °C'de 1,5−2,5 h'den sonra 0,6'lık bir OD600'e ulaşılacaktır.
    3. 50 mM Tris, 50 mM NaCl ve 1 mM etilendim tetraasetik asit (EDTA) 40 mL deiyonize su eriterek 50 mL sonication tampon hazırlayın. HCl ile pH'ı 8.0'a ayarlayın ve 50 mL'ye kadar yapın. Proteaz inhibitörü (50 mL çözeltisi başına 1 tablet) ekleyin ve tamponu 4 °C'ye dengeleyin.
    4. Bakteri kültürünü uygun santrifüj şişelerine aktarın ve hücreleri 3200 x g'de 4 °C'de 30 dk'da hasat edin. Supernatant atın ve buz gibi sonication tampon 25 mL pelet resuspend. Bundan sonra hücreleri buzda tut.
      NOT: Resuspended hücreler kısa süreli olarak -20 °C'de, uzun süreli olarak ise -80 °C'de saklanabilir.
  3. Sonication / lysis
    1. Hücreleri buzüzerinde 30 s 6 döngü için sonicate. Her döngüden sonra hücreleri aşırı ısınmadan korumak için hücreleri 30−60 s kadar dinlendirin.
    2. Hücre süspansiyonunu önceden soğutulmuş 50 mL yüksek hızlı santrifüj tüpüne ve 4 °C'de 30 dakika boyunca 15.000 x g sabit açı rotoruile santrifüje aktarın. Çözünür sitosolik proteinleri içeren temizlenmiş lysat'ı 50 mL'lik taze bir tüpe boşaltın ve peleti atın.

2. Protein Arıtma

  1. Aniyon değişimi kromatografisi
    1. Diyaliz
      1. 20 mM Tris, 1 mM EDTA ve 1 mM etilen glikol-bis(2-aminoetitilether)-N,N,N'-tetraasetik asit (EGTA) deiyonize suda eriterek anyon değişimi kromatografisi (AIEX) tamponUnu hazırlayın ve pH'ı HCl ile 8,5'e ayarlayın. Diyaliz için 2 x 5 L ve kromatografi için 2x 1 L AIEX tampon A hazırlayın.
        NOT: Diyaliz hacmi örnek hacmin yaklaşık 100 katı olmalıdır. Kromatografi için kullanılan tüm tamponlar filtre edilmeli (0,45 μm veya daha küçük) ve gazgiderilmelidir (örn. ultrasonik banyo veya vakum lu gaz giderme ile).
      2. Diyaliz borularını (moleküler ağırlık kesme [MWCO]: 3,5 kDa) hava için ek alan ile uygun bir uzunlukta keserek, dönen karıştırma çubuğunun üzerinde numune kaldırma kuvveti sağlayın.
        NOT: Gliserol membran korur ve kullanmadan önce kaldırılmalıdır.
      3. Temizlenmiş protein çözeltisinin viskozitesini adım 1.3.2'den azaltmak için, kromatografi kolonuna sonraki uygulamayı kolaylaştırmak için çözeltiyi 25 mL AIEX tampon A ile seyreltin. İlk kapatmayı boruya takın, numuneyi membrana yükleyin ve ikinci kapatmayı borunun üst ucundan en az 1 cm takın.
      4. AIEX tampon A ile 5 L kabını bir karıştırma plakası üzerine yerleştirin, bir karıştırma çubuğu ve protein çözeltisi ile dolu membran ekleyin. Dönen karıştırma çubuğuna müdahale den kaçınarak numuneyi döndürmek için hızı ayarlayın. 4 °C'de 12−24 saat diyalize koyun, ardından diyaliz tamponu (AIEX tampon A) taze bir önceden soğutulmuş bir hazırlıkla değiştirin ve en az 4 saat daha devam edin. Diyaliz protein çözeltisini 50 mL'lik bir tüpe aktarın ve 0,45 m'lik bir filtre ünitesinden filtreleyin.
        NOT: Depolama mümkün.
    2. Kromatografi
    3. Sıvı kromatografi sistemini (FPLC) genel bakımla başlatın, kolon tamponlarını AIEX A ve AIEX B (AIEX tamponA 1 M NaCl'li A) ve kolon içeren aniyon değişimi reçinesini bağlayın. Genel kromatografik parametreler için Tablo 1'e bakın.
      NOT: Arabellekler, kolon ve FPLC ekipmanları çalıştırmaya başlamadan önce aynı sıcaklığa denk verilmelidir (Tablo 1, Tablo 2, Tablo 3, Tablo 4ve Tablo 5'tekikromatografik parametrelere bakın).
    4. Sütunu AIEX tampon U ile dengeleyin, daha sonra numuneyi kolona yükleyin ve proteinleri %0 ile %100 arasında doğrusal bir degrade yle (AIEX B) uzaklaştırın. Ayrıntılı bir yöntem protokolü için Tablo 2'ye bakın.
    5. Elüsyon sırasında 2 mL fraksiyonu toplayın ve Coomassie lekeli %15 sodyum dodecyl sülfat poliakrilamid jel elektroforezinde (SDS-PAGE) her fraksiyonun 10 μL'sini analiz edin. Diyaliz için S100A12 proteini içeren fraksiyonları havuz.
      NOT: S100A12'nin molekül ağırlığı 10.575 Da'dır.
  2. Kalsiyuma bağımlı hidrofobik etkileşim kromatografisi (HIC)
    1. Diyaliz
      1. 20 mM Tris, 140 mM NaCl, pH 7.5'e karşı 2.1.1 bölümünde açıklanan prosedürü uygulayın.
    2. Kromatografi
      1. Deiyonize suda 20 mM Tris, 140 mM NaCl ve 25 mM CaCl2 eriterek 1 L kromatografi tamponu HIC A hazırlayın ve pH'ı 7,5'e ayarlayın. HIC tampon B için 20 mM Tris, 140 mM NaCl ve 50 mM EDTA çözünür. pH'ı 7.0'a ayarlayın ve arabellekleri filtreleyin ve gazdan arındırın. CaCl2'yi numuneye 25 mM'lik son konsantrasyona ekleyin ve 0,45 m. üzerinden filtre uygulayın.
      2. Sıvı kromatografi sistemini genel bakımla başlatın, hic A ve B sütunaralarını ve sütunu bağlayın. Daha fazla kromatografik parametreler için Tablo 3'e bakın.
      3. Kolonu dengeleyin, numuneyi yükleyin ve UV sinyali taban çizgisine tekrar ulaşana kadar 'bağlı olmayan numuneyi yıkayın' bloğunu genişletin. Sonra tampon içeren bir kalsiyum şelatör ile elütion başlayın (EDTA). Ayrıntılı bir yöntem protokolü için Tablo 4'e bakın.
        NOT: Önceki deneyler, kalsiyum fazlalığı kromatografi rezorne S100A12 bağlanması için yararlı gibi görünüyor göstermiştir.
      4. 2 mL'lik pik fraksiyonları toplayın ve Coomassie lekeli %15 SDS-PAGE'de her fraksiyonun 10 μL'sini analiz edin. Havuz saf S100A12 fraksiyonları ve hepes tamponlu tuzlu (HBS; 20 mM Hepes, 140 mM NaCl, pH 7.0) karşı diyaliz bölüm 2.1.1 açıklandığı gibi.
        NOT: Monomerik S100A12'nin yok olma katsayısı 2980 M-1 cm-1'dir.

3. Endotoksinin Saptanması ve Çıkarılması

  1. Endotoksin tespiti
    1. Endotoksin kontaminasyonunu belirlemek için seyreltilmiş protein konsantrasyonlarını adım 2.2.2.4'ten ölçün. (örneğin, 1:10 ve HBS 1:100) bir enzim bağlı immünosorbent test kullanarak (ELISA) tabanlı, floresan endotoksin algılama tayini (Malzeme Tablosu). Üreticinin protokolünü izleyerek bu tayini gerçekleştirin.
      NOT: Tampon tarafından endotoksin kontaminasyonunu önlemek için ultra saf deiyonize suda çözünmüş taze hazırlanmış HBS çözeltilerini kullanın.
  2. Endotoksinin çıkarılması ve protein konsantrasyonu
    1. Yaklaşık 10 dk. için 3.200 x g ve 10 °C'de 50 kDa santrifüj filtre ünitesine ve santrifüje 15 mL numune yükleyin. Her adımdan sonra mümkün olduğunca fazla protein ilerletmek için filtre zarını HBS ile iki kez yıkayın.
    2. S100A12 içeren akışı, hacim ilk yükleme hacminin onda birine kadar beşte birine (3.200 x g, yaklaşık 30 dakika boyunca 10 °C'de santrifüj) indirinceye kadar 3 kDa santrifüj filtre kullanarak yoğunlaştırın. Filtreyi gerektiği sıklıkta doldurun, membranı durulayın ve konsantre çözeltiyi her dolumdan sonra yeni bir tüpe aktarın. Akışı atın. Yukarıda açıklandığı gibi 50 kDa ile tekrar filtreuygulayın.
      NOT: Bu işlem sırasında, protein kaybı dikkat çekicidir (%50'ye kadar), ancak kalan protein preparatları LPS'den tamamen tükenir. Bu yöntem 400 mL kültüründen yaklaşık 10−15 mg protein verir.
    3. Protein çözeltisini endotoksinsiz HBS ile 1 mg/mL'ye ayarlayın ve adım 3.1.1'de açıklandığı gibi LPS içeriğini ölçün. Protein çözeltisinin LPS içermeyen (<0.1 EU/mL) olarak hala test edilememiş olması durumunda, endotoksin giderme recibunu kullanarak kalıntı kontaminasyonu ortadan kaldırın.
      NOT: Protein konsantrasyonu 1 mg/mL olan 0.1 EU/mL LPS'nin kontaminasyonu yaklaşık 0.01 pg LPS/μg proteine eşittir.

4. Kimyasal Crosslinking ve Oligomer Ayırma

  1. Kimyasal crosslinking
    1. Ultra saf deiyonize suda 1 M CaCl2 ve 100 mM ZnCl2'lik son derece saf (endotoksiniçermeyen) stok çözeltilerini hazırlayın(Malzeme Tablosu). Bir sonraki adım için bu arabelleği, yeni yapılmış olarak kullanın.
    2. 10 mL saflaştırılmış endotoksinsiz S100A12 (HBS'de konsantrasyon 1 mg/mL) oda sıcaklığında 30 dakika (RT) dimeric/tetrameric için 25 mM CaCl2 veya hexameric/tetrameric S100A12 için 25 mM CaCl2 ve 1 mM ZnCl2 oligomerlar.
    3. Kullanmadan önce 500 μL endotoksinsiz suyun 8 mg BS3 mg'ını eriterek çapraz bağlantıyı hazırlayın (10 mL iyon çivili protein çözeltisi için 8 mg crosslinker 1.4 mM'lik son konsantrasyona eşittir). Çapraz bağlantıyı karıştırın ve rt. 1 M Tris-HCl, pH 7.5 50 mM son konsantrasyonve filtre ile 0.45 μm ile reaksiyon quench ek 30 dakika için pipetleme ve kuluçka ile karıştırın.
  2. Boyut dışlama kromatografisi
    1. Çapraz bağlı numuneyi 12−15 °C (kolon sıcaklığı) arasında dengeleyin ve sıvı kromatografi sistemini genel bakım la çalıştırın. Sütun arabelleği (HBS) ve boyut dışlama sütununa bağlayın. Ayrıntılı bilgi için Tablo 5'e bakın.
    2. HbS'deki kolonu dengeleyin, numuneyi yükleyin ve çalışma sırasında tepe kesirlerini (1−2 mL) toplayın. Bu kesirleri %4−20 degrade SDS-PAGE ve havuz fraksiyonları üzerinde istenilen protein kompleksinin ana bantları ile analiz edin.
      NOT: Sulu çözeltilerde BS3 gibi NHS ester reaktiflerinin hidrolizi 280 nm'de güçlü bir emicilik sağlar. Bağlantısız çapraz bağlantı (molekül ağırlığı: 572 g/mol) koşu sonunda eutes ve güçlü bir tepe ile sonuçlanır.
    3. 10 kDa (dimer), 30 kDa (tetramer) veya 50 kDa (hexamer) MWCOs ile santrifüj filtre üniteleri kullanarak çözeltileri konsantre. Bölüm 3.1'de açıklandığı gibi endotoksin kontaminasyonunu belirleyin. Gerekirse, üreticinin tavsiyelerine(Malzeme Tablosu)uyarak kalan LPS'yi endotoksin giderme reçiyonu ile çıkarın.

5. Monositler Üzerinde Fonksiyonel Test

  1. Monositlerin hazırlanması
    1. Yoğunluk gradyan santrifüj ve sonraki monosit zenginleştirme ile insan buffy kat monositler izole manyetik boncuk ayırma kiti kullanarak(Malzeme Tablosu).
      NOT: Bu protokol yaklaşık 5−7 x 107 monosit (bir buffy kat) saflık %83−95 ile sonuçlanacaktır. Hücre sayısı nın değil, aynı zamanda yanıt verme nin donöre bağlı olması nedeniyle, protokolün (gerekli hücre sayısına bağlı olarak) ölçeklendirilmesi gerekebilir.
    2. Yoğunluk santrifüjü için ayırma çözeltisini (yoğunluk = 1,077 g/mL) RT'ye dengeleyin ve 20 mL'yi 50 mL santrifüj tüpüne (buffy coat başına 2 tüp) aktarın. Hank'in tamponlu tuz çözeltisi (HBSS) ile insan buffy ceketindeki kanı 60 mL toplam hacimve bu karışımın 30 mL'lik tabakasına kadar seyreltin. Sentrifüj 550 x g 35 dk rt. santrifüj fren ilerler.
    3. Santrifüjden sonra mononükleer periferik kan hücreleri (PBMCs) ayırma ortamının hemen üstünde yer alır. Bu hücreleri 50 mL'lik taze bir santrifüj tüpüne aktarın, HBSS ile 50 mL'ye kadar yapın ve 10 dk.'da 170 x g'de santrifüj yapın.
    4. Tüpü 50 mL'ye kadar doldurun ve 10 dk için 290 x g'da santrifüj doldurun. /c9>) 5 x 107 hücre/mL konsantrasyonuna.
      NOT: HBSS yerine, fosfat tamponlu salin (PBS) hücreleri yıkamak için kullanılabilir.
    5. PBMC'lerden monosit izolasyonu için manyetik negatif hücre izolasyon kiti kullanın ve üreticinin protokolünü uygulayın. Monositleri sayın ve monosit ortamda (RPMI 1640, %15 ısı-inaktive fetal baldır serumu [FCS], 4 mM L-glutamin, 100 U/mL penisilin/streptomisin) 2 x 106 hücre/mL konsantrasyonuna geri alın.
    6. Kültür monositler için, ceket kültür yemekleri (örneğin, 100 mm) bir hidrofobik, gaz geçirilebilir film, süspansiyon hücreleri için uygun(Malzeme Tablosu). Yaklaşık 30 dakika UV ışığı kullanarak plakaları sterilize edin. Hücreleri bu kültür plakalarına aktarın ve 37 °C ve %5 CO2'degece boyunca dinlenmelerini sağlar.
      NOT: Kaplamalı çanak başına 15−25 mL hücre süspansiyonu kullanın.
  2. Monosit stimülasyonu
    1. S100A12 ile stimülasyon (wildtype)
      NOT: İşlenmemiş S100A12'yi (bölüm 2.2.2'den son ürün) çapraz bağlı proteinden ayırt etmek için, aşağıdaki S100A12'ye 'yabani tip' denir.
      1. Dinlenmiş hücreleri 10 dk için 350 x g'de 50 mL santrifüj tüp ve santrifüje aktarın. streptomisin) 2 x 106 hücre/mL konsantrasyonda.
      2. Stimülasyon için, 24 iyi süspansiyon plakası kullanın ve kuyu başına 250 μL hücre süspansiyonu ekleyin (0,5 x 106 hücre/kuyu). Amaçlanan kuyulara 50 g/mL polimaddin B ekleyin ve ardından farklı konsantrasyonlarda LPS (25, 50, 100 ve 200 pg/mL) veya wildtype S100A12 (10, 20, 40, 60 μg/mL) ekleyin. Ayrıca, proteini işlenmemiş veya ısıden arındırılmış (99 °C, 10 dk) farklı konsantrasyonlarda hücrelere uygulayın.
        NOT: Kısa ısıl işlem S100A12 proteinini denatüre eder ancak LPS üzerinde daha az etkisi yoktur.
      3. 37 °C'de 4 saat ve %5 CO2'dekuluçka plakaları. Her kuyunun hücre süspansiyonuna 1,5 mL reaksiyon tüpüne aktararak hücreleri hasat edin. 10 dakika için 500 x g'de santrifüj. Süpernatantları taze tüplere aktarın ve üreticinin tavsiyelerine uygun olarak bir insan TNFα ELISA kiti ile tnfα salınımını farklı seyreltmelerde (örn. 1:2, 1:5, 1:10) ölçün.
    2. S100A12 oligomerleri ile stimülasyon
      1. Hazırlamak ve yukarıda açıklandığı gibi 24 iyi süspansiyon plakaları monositler tohum. Adım 4.2.3 S100A12 oligomerler ekleyerek hücreleri uyarmak. farklı molar konsantrasyonlarında (125 nM, 250 nM, 500 nM, 1000 nM).
        NOT: Farklı oligomerlerin monositleri uyarabilmeleri için hücrelere karşılaştırılabilir azı lı konsantrasyonlarda oligomerler uygulandı.
      2. 37 °C'de 4 saat ve %5 CO2'dekuluçkaya yatın, hücreleri hasat edin ve yukarıda açıklandığı gibi süpernatantlarda TNFα salınımını ölçün.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

AIEX kolonunda ön arıtma(Şekil 1A-C)ve sonraki kalsiyuma bağımlı HIC(Şekil 2A,B)sonra, yüksek saf protein elde edildi (Şekil 2C). Buna ek olarak, endotoksin ölçümleri başarılı LPS kaldırma ortaya. AIEX'i izleyen LPS içeriği, 500 EU/mL'nin üzerinde, yani, assay algılama limitinin 1:10 seyreltmesinde ölçüldü. 50 kDa filtre ünitesinden ilk filtreleme den sonra, LPS içeriği 1 EU/mL'ye düşürüldü. 3 kDa f...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokolde, insan S100A12 etiketsiz bakteriyel ekspresyonu ve saflaştırma yanı sıra bağışıklık hücresi stimülasyonu için farklı iyon kaynaklı oligomerler içine ayırma açıklar. S100A12 protein arınması8,23,24üzerine yayınlanan literatürile karşılaştırıldığında hidrofobik etkileşim kromatografisinde yüksek CaCl2 (25 mM) kullanımı bilgimize özgüdür. 1 ila 5 mM arasında konsantrasyon uygulayan çeşitli protokoller saf p...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, Muenster Üniversitesi tıp fakültesi (KE121201-C.K.) ve Alman Araştırma Vakfı'nın (DFG, Fo354/3-1'den D.F.)'e intramural yenilikçi tıbbi araştırma programı tarafındandesteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
pET11b vektörNovagen   
BL21(DE3) yetkin E. coliNew England BiolabsC2527 
       
100x Esansiyel olmayan amino asitlerMerckK 0293
%25 HClCarl RothX897.1
4&eksi; % 20 Mini-PROTEAN TGX Protein JelleriBioRad4561093
Ampisilin sodyum tuzuCarl RothHP62.1
BS3 (bis (sülfosüksinimidil) suberate) - 50 mgThermoFisher Scientific21580
Kalsiyumklorid DihidratCarl Roth5239.1
Coomassie Briliant Blue R250 Leke Giderici SolüsyonBioRad1610438
Coomassie Briliant Blue R250 Boyama SolüsyonuBioRad1610436
EasySep İnsan Monosit Zenginleştirme KitiKök Hücre19059Manyetik negatif hücre izolasyon kiti
EDTA disodyum tuzu dihidratCarl Roth8043.1
EGTACarl Roth3054.3
EndoLISAHyglos609033Endotoksin tespiti tahlil
Endotoksin İçermeyen Ultra Saf SuSigma-AldrichTMS-011-AEndotoksin içermeyen tamponların hazırlanması için ultra saf su
EndoTrap kırmızıHyglos321063Endotoksin giderme reçinesi
FBS (ısıyla etkisizleştirilmiş)Gibco10270
HBSS, kalsiyum yok, magnezyum yokThermoFisher Scientific14175053
HepesCarl Roth9105
Hepes (yüksek kalite, endotoksin testis)Sigma-AldrichH4034
hTNF-alpha - OptEia ELISA SetBD555212
IPTG (izopropil-ß-D-tiyogalaktopiranosid)Carl RothCN08.1
L-Glutamin (200 mM)MerckK 0282
LB-OrtaCarl RothX968.1
E. coli O55:B5MerckL6529
Pancoll, insanPAN BiotechP04-60500Ayırma çözeltisi (yoğunluk gradyan santrifüjü
) Penisilin / Streptomisin (10.000 U / mL)MerckA 2212
Fenil Sefaroz Yüksek PerformanslıGE Healthcare17-1082-01Reçine için hidrofobik etkileşim kromatografisi
Polimiksin BInvivogentlrl-pmb
Proteaz inhibitör tabletleriRoche11873580001
Q Sefaroz Hızlı AkışGE Healthcare17-0510-01Anyon değişim kromatografisi için reçine
RoboSep tamponuKök Hücre20104Hücre ayırma tamponu (bölüm 5.1.4)
RPMI 1640 OrtaMerckF 1215
Sodyum klorür (NaCl)Carl Roth3957.2
Sodyum hidroksitCarl RothP031.1
Tris TabanıCarl Roth4855.3
Çinko klorürCarl RothT887
Labware
0,45 ve mikro; m şırınga filtresiMerckSLHA033SS
14 mL yuvarlak tabanlı tüplerBD352059
2 L Erlenmyer şişesiCarl RothLY98.1
24 kuyulu süspansiyon plakalarıGreiner662102
5 L ölçüm kabıCarl RothCKN3.1
50 mL konik santrifüj tüpleriCorning430829
50 mL yüksek hızlı santrifüj tüpleriEppendorf3,01,22,178
Amicon Ultra-15 Santrifüj Filtre Ünitesi MWCO 3 kDaMerckUFC900324
Amicon Ultra-15 Santrifüj Filtre Ünitesi MWCO 50 kDaMerckUFC905024
Kültür kabı (100 mm)Sarstedt83.3902
Diyaliz Tüpü KapaklarıSpektrum 132738
EasySep mıknatıs 'The Big Easy'Stemcell18001
Fraksiyon toplayıcı tüpler 5 mLGreiner115101
Lumox film, 25 & m, 305 mm x 40 mSarstedt94,60,77,316Monosit kültür plakaları için film
Spectra/Por Diyaliz Membranı (3,5 kDa)Spektrum132724
Steritop filtre ünitesiMerckSCGPT01RE
Ekipman
37 derece; C İnkübatör (çalkalamalı)New Brunswick ScientificInnova 42
ä KTA temizleyici UPC 10GE HealthcareFPLC Sistemi
Fraksiyon toplayıcıGE HealthcareFrac-920
Santrifüj (rotor A-4-81 ile)Eppendorf5810R
Sabit açılı rotorEppendorfF-34-6-38
Mini Protean Tetra CellBioRad1658000EDU
NanoFotometreImplenP330
SonikatörBrandelinUW2070
Floresan okuyucuTecansonsuz M200PRO
pH metreKnick765

Kaynaklar

  1. Liston, A., Masters, S. L. Homeostasis-altering molecular processes as mechanisms of inflammasome activation. Nature Reviews Immunology. 17 (3), 208-214 (2017).
  2. Kessel, C., Holzinger, D., Foell, D. Phagocyte-derived S100 proteins in autoinflammation: putative role in pathogenesis and usefulness as biomarkers. Clinical Immunology. 147 (3), 229-241 (2013).
  3. Baker, T. M., Nakashige, T. G., Nolan, E. M., Neidig, M. L. Magnetic circular dichroism studies of iron(ii) binding to human calprotectin. Chemical Science. 8 (2), 1369-1377 (2017).
  4. Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein. Nature Chemical Biology. 11 (10), 765-771 (2015).
  5. Nakashige, T. G., Zygiel, E. M., Drennan, C. L., Nolan, E. M. Nickel Sequestration by the Host-Defense Protein Human Calprotectin. Journal of the American Chemical Society. 139 (26), 8828-8836 (2017).
  6. Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12. Chemical Science. 7 (2), 1338-1348 (2016).
  7. Moroz, O. V., et al. Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence. Acta Crystallographica Section D, Biological Crystallography. 59 (Pt 5), 859-867 (2003).
  8. Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation. Journal of Molecular Biology. 391 (3), 536-551 (2009).
  9. Korndorfer, I. P., Brueckner, F., Skerra, A. The crystal structure of the human (S100A8/S100A9)2 heterotetramer, calprotectin, illustrates how conformational changes of interacting alpha-helices can determine specific association of two EF-hand proteins. Journal of Molecular Biology. 370 (5), 887-898 (2007).
  10. Moroz, O. V., et al. Both Ca2+ and Zn2+ are essential for S100A12 protein oligomerization and function. BMC Biochemistry. 10, 11(2009).
  11. Baudier, J., Glasser, N., Gerard, D. Ions binding to S100 proteins. I. Calcium- and zinc-binding properties of bovine brain S100 alpha alpha, S100a (alpha beta), and S100b (beta beta) protein: Zn2+ regulates Ca2+ binding on S100b protein. Journal of Biological Chemistry. 261 (18), 8192-8203 (1986).
  12. Dell’Angelica, E. C., Schleicher, C. H., Santome, J. A. Primary structure and binding properties of calgranulin C, a novel S100-like calcium-binding protein from pig granulocytes. Journal of Biological Chemistry. 269 (46), 28929-28936 (1994).
  13. Vogl, T., et al. S100A12 is expressed exclusively by granulocytes and acts independently from MRP8 and MRP14. Journal of Biological Chemistry. 274 (36), 25291-25296 (1999).
  14. Hofmann, M. A., et al. RAGE mediates a novel proinflammatory axis: a central cell surface receptor for S100/calgranulin polypeptides. Cell. 97 (7), 889-901 (1999).
  15. Foell, D., et al. Proinflammatory S100A12 Can Activate Human Monocytes via Toll-like Receptor 4. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 187 (12), 1324-1334 (2013).
  16. Kessel, C., et al. Calcium and zinc tune autoinflammatory Toll-like receptor 4 signaling by S100A12. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (4), 1370-1373 (2018).
  17. Armaroli, G., et al. Monocyte-Derived Interleukin-1beta As the Driver of S100A12-Induced Sterile Inflammatory Activation of Human Coronary Artery Endothelial Cells: Implications for the Pathogenesis of Kawasaki Disease. Arthritis & Rheumatology. 71 (5), 792-804 (2019).
  18. GE Healthcare. Strategies for Protein Purification. Handbook. , Freiburg, Germany. (2010).
  19. Jackson, E., Little, S., Franklin, D. S., Gaddy, J. A., Damo, S. M. Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12. Journal of Visualized Experiments. (123), (2017).
  20. Kiss, B., Ecsedi, P., Simon, M., Nyitray, L. Isolation and Characterization of S100 Protein-Protein Complexes. Methods in Molecular Biology. 1929, 325-338 (2019).
  21. Magalhaes, P. O., et al. Methods of endotoxin removal from biological preparations: a review. Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 10 (3), 388-404 (2007).
  22. Petsch, D., Anspach, F. B. Endotoxin removal from protein solutions. Journal of Biotechnology. 76 (2-3), 97-119 (2000).
  23. Heilmann, R. M., Suchodolski, J. S., Steiner, J. M. Purification and partial characterization of canine S100A12. Biochimie. 92 (12), 1914-1922 (2010).
  24. Hung, K. W., Hsu, C. C., Yu, C. Solution structure of human Ca2+-bound S100A12. Journal of Biomolecular NMR. 57 (3), 313-318 (2013).
  25. Endotoxin Removal. Application Note - Sartorius Stedim Biotech. , (2010).
  26. Hogasen, A. K. M., Abrahamsen, T. G. Polymyxin-B Stimulates Production of Complement Components and Cytokines in Human Monocytes. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (2), 529-532 (1995).
  27. Valentinis, B., et al. Direct effects of polymyxin B on human dendritic cells maturation - The role of I kappa B-alpha/NF-kappa B and ERK1/2 pathways and adhesion. Journal of Biological Chemistry. 280 (14), 14264-14271 (2005).
  28. Teuber, M., Miller, I. R. Selective Binding of Polymyxin-B to Negatively Charged Lipid Monolayers. Biochimica Et Biophysica Acta. 467 (3), 280-289 (1977).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

S100A12 SaflaştırılmasıAnyon Değişim KromatografisiHidrofobik Etkileşim KromatografisiBoyut Dışlama KromatografisiKimyasal Çapraz BağlamaEndotoksin GidermeMonosit İzolasyonuTNF Alfa Salınımı
İnsan S100A12 ve Bağışıklık Hücre Stimülasyonu için Iyon kaynaklı Oligomerlerin Saflaştırılması
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.