Method Article

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinde CRISPR-CAS9 Kullanılarak Tanımlanmış Genomik Modifikasyonların Üretimi

DOI:

10.3791/60085

⸱

September 25th, 2019

 ,  ,  , 
1Center for Cellular and Molecular Therapeutics, The Children's Hospital of Philadelphia, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, The Children's Hospital of Philadelphia, 3Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Pennsylvania

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, insan pluripotent kök hücrelerinde CRISPR-CAS9 kullanılarak tanımlanmış heterozigot veya homozigot nükleotid değişikliklerinin oluşumunu kolaylaştıracak bir yöntem sağlar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan pluripotent kök hücreleri gen fonksiyonunu incelemek ve hastalığa özgü mutasyonları modellemek için güçlü bir sistem sunar. İkinci alelde CRISPR-CAS9 aracılı indel oluşumu nedeniyle hassas heterozigot genetik modifikasyonların oluşturulması zordur. Burada, her iki şablon da yeniden kesme ve indel oluşumunu önlemek için sessiz mutasyonlar içerirken, yalnızca bir tanesinin istenen sıra değişikliğini ifade ettiği iki onarım şablonu kullanarak bu zorluğun üstesinden gelinmesine yardımcı olacak bir protokol gösteriyoruz. Bu metodoloji, insan hastalığı ve biyoloji sinaması için isojenik kontrol ve mutant insan kök hücre hatları oluşturmak için DNA'nın gen düzenleme kodlama bölgeleri için en avantajlı yöntemdir. Buna ek olarak, transfeksiyon ve tarama metodolojilerinin optimizasyonu, gen düzenleme deneyinin işçiliğini ve maliyetini azaltmak için gerçekleştirilmiştir. Genel olarak, bu protokol yaygın insan pluripotent kök hücre modeli kullanan birçok genom düzenleme projeleri için geçerlidir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan embriyonik kök hücreleri (hESCs) ve indüklenen pluripotent kök hücreler (iPSCs) insan hastalığı yenileme kapasiteleri nedeniyle modelleme için değerli araçlar, farklı soy hücre tipleri oluşturmak için yeteneğini korurken1,2 ,3,4. Bu modeller gen fonksiyonunu sorgulama imkanını açar ve spesifik mutasyonların ve fenotiplerin çeşitli hastalıklarla nasıl ilişkili olduğunuanlarlar 5,6. Ancak, belirli bir değişiklik belirli bir fenotip bağlı nasıl anlamak için, eşleştirilmiş bir iyo....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Kılavuz RNA'nın (gRNA) tasarımı ve inşası

NOT: Her gRNA, 100 bp çift iplikçikli (ds) oligonükleotid(Şekil 1A-C)oluşturmak için annealed iki 60 baz çifti (bp) oligonükleotid oluşur. gRNA tasarımı, üretimi ve test kesme verimliliği için zaman çizelgesi yaklaşık 2 haftadır(Şekil 2).

  1. Genom düzenlenecek DNA bölgesini seçin ve formata uygun 3-4 23 bp dizileri tanımlayın, 5'-G(N19)NGG-3'. Bu diziler ilgi alanının 20 bp içinde yer almalıdır.
    NOT: Hedefleme duyu veya anti-sense iplikçik üzerinde yapılabilir.
  2. CRISPOR (http://crispor.tefor....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GRNA'ların üretimi ve indels için tarama

Her gRNA bir plazmid vektör içine klonlanmış olacak ve U6 organizatörü kullanılarak ifade edilecektir. AflII restriksiyon enzimi plazmidi doğrusallaştırmak için kullanılır (addgene #41824) ve U6 organizatöründen sonra bulunur. İki 60 bp oligonun karıştırıldıktan sonra oluşturulan 100 bp bandı, DNA montajı kullanılarak gRNA ekspresyon vektörüne klonlanır. GRNA plazmidleri oluşturulduktan sonra CRISPS-CAS9 GFP plazmidi (addgene #.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde, CRISPR-CAS9'un iki ssODN onarım şablonu ile birlikte belirli heterozigot veya homozigot genom değişiklikleri oluşturmak için kullanılması insan pluripotent kök hücrelerinde gösterilmiştir. Bu yöntem, heterozigot genomik değişiklikleri %10'a yakın bir verimlilikle ifade eden izojenik hücre hatlarının başarılı bir şekilde üretilmesiyle sonuçlandı. Bu protokol, hücre ayrıştırma sonrası düşük yoğunlukta hücre kültürlerinden sonra hücre büyümesini ve sağkalımlarını destekleyen ışınlanmış MEF'lerde yetiştirilen .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma, U01HL099656 (P.G. ve D.L.F.) ve U01HL134696 (P.G. ve D.L.F.) hibeleri yoluyla Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü (NHLBI), Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden fon la desteklenmiştir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Hücre süzgeç kapaklı 5 ml polistiren yuvarlak tabanlı tüpCorning352235
6 oyuklu polistiren doku kültürü kaplarıCorning353046
AflII kısıtlama endonükleazNew England BiolabsR0520
AgarozVWRN605
DMEM/F12 orta boyThermoFisher11320033
dNTP'lerRoche11969064001
Floresanla aktive edilen hücre sıralayıcı (FACS) aparatı
Jel ekstraksiyon kitiMacherey-Nagel740609
Gibson Montaj KitiNew England BiolabsE2611
gRNA_Cloning VectorAddgene41824
50 &mu içeren LB agar plakaları; g/ml kanamisin
Lipofektamin Kök ReaktifiThermoFisher(STEM00001)
Matrigel Büyüme Faktörü Azaltılmış (GFR)Corning354230
Murin embriyonik fibroblastlar (MEF'ler)
Nucleospin Jel Ekstraksiyonu ve PCR Temizleme KitiMacherey-Nagel740609
Orbital çalkalama inkübatörü
pCas9_GFP vektörAddgene44719
PCR şerit tüpleriUSA Scientific1402-2900
Phusion High Fidelity DNA Polimeraz ve 5 kez; Görüş tamponuNew England BiolabsM0530
PurelinkTM Hızlı Plazmid Miniprep KitiİnvitrojenK210011
Proteinaz KQiagen Qiagen19133
StellarTM elektroyetkin Escherichia coli hücreleriTakara636763
SOC ortamıNew England BiolabsB9020S
TrypLE Ekspres EnzimThermoFisher12605036
Y-27632 dihidroklorür/ROCK inhibitörü (ROCKi)Tocris1254

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Srivastava, D., Dewitt, N. Review In Vivo Cellular Reprogramming: The Next Generation. Cell. 166 (6), 1386-1396 (2016).
  2. Clevers, H. Review Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  3. Murry, C. E., Keller, G.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

CRISPR Cas9Human Pluripotent Stem CellsGene EditingIsogenic Cell LinesHeterozygous MutationsRepair TemplatesTransfection OptimizationColony PickingFluorescence Activated Cell SortingRestriction Enzyme Digestion

Related Articles