Bu protokol, fare göz küresinin göz kapağı, göz yüzeyi, anterior ve posterior segmentleri ile nispeten sağlam konumda izolasyonu için bir yöntem açıklanmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Histolojik Muayene ve İmmünohistokimya için İntegral Göz Yüzey Dokusu Elde Etmek Için Bozulmamış Göz Küresinin İzolasyon
Bu makalede
Özet
Özet
Oküler yüzey (OS) üç bağlı parçadan oluşan bir epitel levhaoluşur: palpebral konjonktiva, bulbar konjonktiva ve kornea epitel. OS bozulması keratit yol açacak, konjonktivit veya her ikisi (keratokonjonktivit). Belirli genetik modifikasyonlara veya yapay operasyonlara sahip deneysel hayvan modellerinde, her bir parçanın göreceli patogenetik değişikliklerini paralel olarak değerlendirmek için OS epitel sayfasının tüm bölümlerini incelemek yararlıdır. Ancak, distorsiyon veya hasar olmadan bir bütün olarak OS doku diseksiyon, öncelikle yumuşaklık ve os incelik nedeniyle fiziksel olarak ayrı henüz hareketli göz kapakları ve göz küresi yapıştırılmış nedeniyle zor olmuştur. Ayrıca, sert kafatası / orbital kemikler tarafından oluşturulan derin göz soketi tamamen çalışma diseksiyonları için sınırlı alan bırakarak göz küresi tarafından işgal edilir. Sonuç olarak, yüz tarafında ilişkili OS dokuları ile göz küresi doğrudan diseksiyon genellikle doku hasarlarına yol açacak, özellikle palpebral ve bulbar konjonktiva. Bu protokolde, kafatası ve yörünge kemiklerini iki parçalı fare başından sırayla çıkarmak için bir yöntem tanımlanmış, göz kapakları, göz yüzeyi, lens ve retinayı tek parça halinde bırakılmıştır. OS sayfasının bütünlüğü iyi korunmuştur ve histoloji veya immünboyama ile tek bir bölümde incelenebilir.
Giriş
Oküler yüzey palpebral konjonktiva, bulbar konjonktiva ve kornea1dahil olmak üzere bölgesel epitel sürekli bir levha oluşur. Birçok glandüler yapılar oküler yüzey epitel ile ilişkilidir ve birlikte kuruyan ve çevresel istilalar kornea yüzeyini koruyan gözyaşı film bir tabaka oluşturmak2. OS bozulması keratit yol açacak, konjonktivit veya her ikisi (keratokonjonktivit). Hem genetik faktörler hem de çevresel tahriş edici maddeler ya da etkileşimleri OS3,4'ünpatolojik değişikliklerine katkıda bulunur. Buna göre, insan işletim sistemi hastalık süreçlerini incelemek i....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Farelerin kullanımı ile ilgili tüm prosedürler Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi, Zhongshan Oftalmic Merkezi tarafından onaylandı ve Oftalmik ve Vizyon Araştırma Hayvanların Kullanımı için ARVO Bildirimi'ne bağlı.
1. Göz küresinin sağlam göz yüzeyi ve göz kapakları ile diseksiyonu
- Kafasını kes.
- Ötanazi sonrası gün 10 (P10) ve P28 fareler (fare suşları için Malzemeler Tablosu bakınız) servikal çıkış tarafından, keskin makas bir çift tarafından boyun kapalı baş kesti.
- Buruna interparietal kemik rostrally başlayan sagittal orta hat boyunca düz makas bir çift ile bisect baş (Şek....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Farklı bakış açılarından görüntülenen ana kafatası kemikleri Şekil 1A-E'de,farklı kemikleri gösteren renklerle gösterilmiştir. Diseksiyon süreçlerini göstermek için dört haftalık bir hayvan kullandık. Diseksiyon basamakları 1.1.1-1.1.3 ve kısa bir önekasyon (adım 1.1.4) sonra, ilişkili yüz kemikleri ile göz küresi Şekil 1E'degösterilmiştir. Anterior (nazal ve premaxillary) ve posterior (örneğin, .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bozulmamış göz küresi hazırlanması için önemli bir hatırlatma tüm orbital kemiklertamamen kaldırılması gerektiğini, özellikle juga ve gözyaşı kemikleri, hangi küçük ve göz soketi alt yakınında bulunan. Geriye kalan kemikler, takip eden histolojiyi zorlaştırabilir. Küçük bir kemik parçasının kazara diseksiyondan tamamen çıkarılmaması durumunda, bir çift sharptweezers kullanılarak gömme parafin bloğundan seçilebilir. Geride kalan delik bu işlemden sonra erimiş parafin ile doldurulmalıdır.
Lensi .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Yazarlar makalenin eleştirel okuma için Prof Rong Ju teşekkür ve teknik yardım için tüm laboratuvar üyeleri. Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'nın (NSFC: 31571077; Pekin, Çin), Guangzhou Şehir Bilimleri ve Teknolojileri Yenilik Projesi (201707020009; Guangzhou, Guangdong Eyaleti, Çin), Sun Yat-sen Üniversitesi'nden "100 Kişi Planı"(8300-18821104; Guangzhou, Guangdong Eyaleti, Çin) ve Zhongshan Oftalmoloji Devlet Anahtar Laboratuvarı araştırma finansmanı (303060202400339; Guangzhou, Guangdong Eyaleti, Çin).
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1&kez; Fosfat tamponlu salin (PBS) | Transgen Biotech | FG701-01 | |
| 50ml santrifüj tüpü | Corning | 430829 | |
| Yapıştırıcı mikroskop slaytları | Çeşitli | ||
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | Önerilen konsantrasyon 1:500 - 1.000 |
| Alexa Fluor 568 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12380 | Önerilen konsantrasyon 1:500 - 1.000 |
| Anti-K12 antikoru | Abcam | ab124975 | Önerilen konsantrasyon 1:1.000 |
| Anti-K14 antikoru | Abcam | ab7800 | Önerilen konsantrasyon 1:800 |
| Sitrik asit | Çeşitli | ||
| Kapak sürgüsü | Çeşitli | ||
| Kavisli forseps | Dünya Hassas Aletleri | 14127 | |
| Diseksiyon mikroskobu. | Olmpus | SZ61 | |
| Etil alkol | Çeşitli | ||
| Floresan Mikroskop | Zeiss | AxioImager.Z2 | |
| Fluoromount-G Montaj ortamı | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Mikro diseksiyon makası-düz bıçak | Dünya Hassas Aletler | 503242 | |
| Mikrodalga fırınlar | Galanz | P70D20TL-D4 | |
| Fare suşları | C57 / BL6 ve Sv129 karışık | ||
| No.4 düz forseps | Dünya Hassas Aletler | 501978-6 | |
| Normal Keçi Serumu | Çeşitli | ||
| Paraformaldehit (PFA) | Çeşitli | 1 kez% 4'lük bir çözelti hazırlayın; PBS ve 0.45&mu ile filtre; m filtre | |
| membranı Doku kültürü kabı | Çeşitli | ||
| Trisodyum sitrat | Çeşitli | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | SLBW6818 |
Kaynaklar
- Swamynathan, S. K. Ocular surface development and gene expression. Journal of Ophthalmology. 2013, (2013).
- Arita, R., Fukuoka, S., Morishige, N. Functional Morphology of the Lipid Layer of the Tear Film. Cornea. 36 Suppl 1, S60-S66 (2017).
- Guo, D., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
