İmmün Hücre Kaynaklı Hücre Dışı Veziküllerin Karakterizasyonu ve Hücre Çevresi Üzerindeki Fonksiyonel Etkisinin İncelenmesi

Özet

Bu rapor, mikroglia veya kan makrofajlarından ekstrasellüler vezikül (EV) izolasyonu için kronolojik gereksinimleri vurgulamaktadır. Mikroglia kaynaklı EV'ler nötral büyümenin düzenleyicisi olarak değerlendirilirken, c6 glioma hücre invazyonunun kontrolünde in vitro tahlillerde kan makrofajlı eV'ler incelendi. Amaç, belirli mikroortamlarda bağışıklık arabulucusu olarak bu EV fonksiyonlarını daha iyi anlamaktır.

Özet

Merkezi sinir sisteminin nöroinflamatuar durumu (CNS) fizyolojik ve patolojik koşullarda önemli bir rol oynar. Mikroglia, beyinde yerleşik bağışıklık hücreleri, ve bazen sızan kemik iliği kaynaklı makrofajlar (KBM), CNS kendi mikroortamının inflamatuar profilini düzenler. Bağışıklık hücrelerinden gelen hücre dışı vezikül (EV) popülasyonlarının immün arabulucu olarak hareket ettiği kabul edilir. Bu nedenle, bunların toplanması ve izolasyonu, içeriklerini tanımlamak için önemlidir, aynı zamanda alıcı hücreler üzerindeki biyolojik etkilerini de değerlendirirler. Bu veriler, ultrasantrifüj ve boyut dışlama kromatografisi (SEC) adımları da dahil olmak üzere mikroglia hücrelerinden veya kan makrofajlarından EV izolasyonu için kronolojik gereksinimleri vurgulamaktadır. Hedeflenmemiş bir proteomik analiz, protein imzalarının EV belirteçleri olarak doğrulanmasına izin verdi ve biyolojik olarak aktif EV içeriğini karakterize etti. Mikroglia kaynaklı EVs de işlevsel nöronların birincil kültür de nötrit büyüme bağışıklık mediatörler olarak önemini değerlendirmek için kullanılmıştır. Sonuçlar, mikroglia kaynaklı EV'lerin in vitro neurite büyümesini kolaylaştırmaya katkıda olduğunu göstermiştir. Buna paralel olarak, kan makrofaj kaynaklı EVs fonksiyonel C6 glioma hücrelerinin spheroid kültürlerde bağışıklık aracı olarak kullanılmıştır, bu eVs in vitro glioma hücre invazyonu kontrol gösteren sonuçlar. Bu rapor, EV aracılı bağışıklık hücresi fonksiyonlarını değerlendirme olasılığını vurgular ken, aynı zamanda böyle bir iletişimin moleküler temellerini de anlamaktadır. Bu deşifre doğal veziküllerin kullanımını teşvik edebilir ve / veya cns patolojilerin mikroortamda bağışıklık özelliklerini taklit etmek için terapötik veziküllerin in vitro hazırlanması.

Giriş

Birçok nöropatoloji giderek düşünülen karmaşık bir mekanizma dır nöro-inflamatuar devlet ile ilgilidir, ancak bağışıklık süreçleri çeşitli ve hücre ortamına bağlıdır, çünkü hala kötü anlaşılmaktadır. Gerçekten de, CNS bozuklukları sistematik olarak aynı aktivasyon sinyalleri ve bağışıklık hücre popülasyonları içermez ve bu nedenle pro-veya anti-inflamatuar yanıtları patolojilerin nedenleri veya sonuçları olarak değerlendirmek zordur. "Microglia" adı verilen beyin yerleşik makrofajlar sinir ve bağışıklık sistemleri arasındaki arayüz de gibi görünüyor¹. Mikroglia bir miyeloid kökenli ve ilkel hematopoiesis sırasında beyin kolonize yumurta kesesi türetilmiştir, periferik makrofajlar periferik makrofajlar olmak için kesin hematopoezis sırasında fetal karaciğertülen türetilmiştir ise². Mikroglia hücreleri nöronlar ve astrositler ve oligodendrocytes³3 gibi nöron kaynaklı glial hücreleri ile iletişim . Birkaç yeni çalışmalar mikroglia CNS gelişimi ve yetişkin doku homeostaz sırasında nöronal plastisite dahil olduğunu göstermiştir, ve aynı zamanda nörodejeneratif hastalıklar ile ilişkili inflamatuar devlet^4,5. Aksi takdirde, kan beyin bariyerinin bütünlüğü diğer CNS patolojilerinde tehlikeye olabilir. Bağışıklık yanıtları, özellikle glioblastoma multiforme kanser, kan beyin bariyeri anjiyojenik süreçler ve lenfatik damarların varlığı ile yeniden düzenlenir gibi mikroglia hücreleri tarafından desteklenmez^6,7. Bu nedenle tümöre bağlı anjiyogenez mekanizmaları boyunca beyin tümöründe büyük kemik iliği kaynaklı makrofajlar (MBM) infiltrasyonu meydana gelir⁸. Kanser hücreleri immünsupresif özellikleri ve tümör büyümesi ne kadar opresif özellikleri ve tümör büyümesi ne kadar infiltrasyon lu KBM'ler üzerinde önemli bir etki uygular⁹. Böylece bağışıklık hücreleri ve beyin mikroçevre arasındaki iletişim hücre kökeni ve aktivasyon sinyalleri çeşitli olduğu gibi anlamak zordur^10,11. Bu nedenle fizyolojik koşullarda bağışıklık hücresi ile ilişkili moleküler imzaların işlevlerini yakalamak ilginçtir. Bu bağlamda, bağışıklık hücreleri ve hücre mikroçevre arasındaki hücre-hücre iletişimi ekstrasellüler serbest bırakılması ile incelenebilir (EVs).

EVs sağlıklı yanı sıra patolojik koşullarda bağışıklık fonksiyonlarının düzenlenmesinde daha fazla çalışılmaktadır^12,13. İki popülasyon, ekzozomlar ve mikroveziküller dikkate alınabilir. Farklı biyogenez ve boyut aralıkları sunarlar. Ekzozomlar ~30-150 nm çapında veziküllerdir ve endozomal sistemden üretilir ve plazma zarı ile multiveziküler cisimlerin (MVB) füzyonu sırasında salgılanır. Mikroveziküller çapı yaklaşık 100-1.000 nm ve hücre plazma^membran14bir dış tomurcuklanma tarafından oluşturulur. Ekzozom ve mikrovezilem ayrımcılığının boyutuna ve moleküler kalıplarına göre fark etmesi hala zor olduğundan, bu raporda sadece EVs terimini kullanacağız. Çalışmalar nematodlar, böcekler veya annelidler^15,16dahil omurgasız türlerde rol lerini gösterdi beri CNS EV ilişkili iletişim atalarının bir mekanizma temsil eder. Ayrıca, EVs farklı türlerden hücrelerle iletişim kurabilir gösteren sonuçlar, ilk veziküller ve alıcı hücreler arasında yüzey molekülü tanıma dayalı ve daha sonra arabulucuların alımı na izin bir anahtar kilit sistemi olarak bu mekanizma göstermek^16,17. Gerçekten de, EVs proteinler (örneğin, enzimler, sinyal transdüksiyonu, biyogenez faktörü), lipidler (örneğin, ceramid, kolesterol) veya nükleik asitler (örneğin, DNA, mRNA veya miRNA veya miRNA veya miRNA) gibi birçok molekül içeren alıcı hücre faaliyetlerinin doğrudan veya dolaylı düzenleyicileri olarak hareket¹⁴. Bu nedenle evs izole etmek ve tam olarak protein imzaları karakterize bağışıklık hücreleri üzerinde metodolojik çalışmalar yapıldı^18,19.

İlk çalışmalar bir Wnt3a aşağıdaki indükedilemez bir mekanizma olarak birincil kültürlü sıçan mikroglia ekzozomların serbest olduğunu gösterdi- veya serotonine bağlı aktivasyon^20,21. Fonksiyonel CNS, mikroglia türetilmiş EVs nöronlarda presinaptik terminalleri tarafından nöronal eksitilat kontrolüne katkıda bulunan sinaptik vezikül salınımını düzenleyen^22,23. Mikroglia kaynaklı EVs de büyük beyin bölgelerinde sitokinler aracılı inflamatuar yanıt yaymak olabilir^24,25. Daha da önemlisi, toll benzeri reseptör ailesi için çeşitli ligands microglia²⁶EVs belirli üretimleri etkinleştirmek olabilir. Örneğin, in vitro çalışmalar LPS aktive mikroglia BV2 hücre hatları pro-inflamatuar sitokinler²⁷dahil diferansiyel EV içeriği üretmek olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, CNS bağışıklık hücresi alt popülasyonlarının fonksiyonel çeşitliliği, mikroglia ve bmdm'ler infiltrasyon, alıcı hücreler ve EV içeriğinin belirlenmesi üzerinde EV etkisi de dahil olmak üzere kendi EV popülasyonları ile değerlendirilebilir.

Daha önce mikroglia ve BMDM kaynaklı EVs onların izolasyon^16,19sonra fonksiyonel özelliklerini değerlendirmek için yöntemler açıklanmıştır. Bu raporda, mikroglia kaynaklı EV'lerin nörit büyüme üzerindeki etkisini ve makrofaj kaynaklı EV'lerin glioma hücre agregalarının kontrolü üzerindeki etkisini bağımsız olarak değerlendirmeyi öneriyoruz. Bu çalışma aynı zamanda EV izolasyon prosedürünü doğrulamak ve biyolojik olarak aktif protein imzalarını belirlemek için EV fraksiyonlarının geniş bir proteomik analizini önermektedir. Yararlı etkileri ve EV içeriğinin moleküler deşifre onların olası manipülasyon yardımcı olabilir ve beyin bozukluklarında terapötik ajanlar olarak kullanmak.

Protokol

1. Mikroglia/Makrofajların Birincil Kültürü

1. Mikroglia birincil kültür
   1. Kültür ticari sıçan birincil mikroglia (2 x 10⁶ hücreleri) (Malzemeler Tablosubakınız) Dulbecco modifiye Kartal orta (DMEM) ile takviye 10% ekzozozomiçermeyen serum, 100 U/ mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin, ve 9.0 g/L glikoz at 37 °C ve% 5 CO₂.
   2. 48 saatlik bir kültürden sonra şartlandırılmış ortamı toplayın ve EVs'lerin izolasyonuna devam edin.
2. Makrofajların birincil kültürü
   1. Kültür ticari sıçan birincil makrofajlar (1 x 10⁶ hücreleri) üretici tarafından sağlanan ortamda (Malzemeler Tablosubakınız) 37 °C ve% 5 CO₂, ekzozomsuz serum ile.
   2. 24 saatlik bir kültürden sonra şartlandırılmış ortamı toplayın ve EVs'lerin izolasyonuna devam edin.

2. EV'lerin İzolasyon

1. EVs'nin klimalı ortamdan önceden izolasyonu
   1. Koşullu kültür ortamını mikroglia veya makrofaj kültürlerinden (adım 1.1.2 veya 1.2.2) konik bir tüpe aktarın.
   2. Hücre peletiçin oda sıcaklığında 10 dakika (RT) için 1.200 x g santrifüj.
   3. Supernatant'ı yeni bir konik tüpe aktarın. Apoptotik organları ortadan kaldırmak için RT 20 dakika için 1.200 x g santrifüj.
   4. Supernatant'ı 10,4 mL'lik polikarbonat tüpe aktarın ve tüpü 70,1 Ti rotora aktarın. Ultracentrifuge 100.000 x g için 90 dk 4 °C'de EVs pelet.
   5. Supernatant atın ve 0.20 μm filtrelenmiş fosfat tampon salin (PBS) 200 μL içinde EVs içeren pelet resuspend.
2. EV'lerin İzolasyon
   1. Ev yapımı boyut dışlama kromatografisi sütununun (SEC) hazırlanması
      1. Bir cam kromatografi sütunu boşaltın (uzunluk: 26 cm; çap: 0,6 cm) (Malzeme Tablosunabakın), yıkayın ve sterilize edin.
      2. Sütunun altına 60 μm filtre yerleştirin.
      3. 0,6 cm çapında ve 20 cm yüksekliğinde sabit bir faz oluşturmak için çapraz bağlı agarose jel filtrasyon taban matris ile sütun yığını.
      4. 0,20 m filtrelenmiş PBS 50 mL ile faz duruleyin. Gerekirse daha sonra kullanılmak üzere 4 °C'de saklayabilirsiniz.
   2. Yeniden askıya alınan EV peletini SEC sütununun sabit fazının üzerine yerleştirin.
   3. Sütunun kurumasını önlemek için sabit fazın üstüne 0,20 m filtrelenmiş PBS eklemeye devam ederken 250 μL'lik 20 ardışık kesir toplayın. Kesirleri gerekirse -20 °C'de saklayın.
      NOT: Moleküler analiz için EV bütünlüğünü korumak için -80 °C'de bir haftadan uzun bir depolama yapılabilir.
3. SEC fraksiyonlarının matris destekli lazer desorpsiyon iyonizasyonu (MALDI) kütle spektrometresi analizi
   1. Bölüm 2.2'de açıklandığı gibi EV yalıtımına devam edin.
   2. 200 μL peptit kalibrasyon karışımı çözeltisi ile EV peletini yeniden askıya alın (Malzeme Tablosu'nabakın).
   3. Bölüm 2.2.1 ile 2.2.3 bölümlerinde açıklandığı gibi EV koleksiyonuna devam edin.
   4. Tamamen bir vakum konsantratörü ile fraksiyonu kuru.
   5. Kesirleri %0,1 trifloroasetik asit (TFA) ile 10 μL ile yeniden oluşturur.
   6. Maldi cilalı çelik hedef plaka üzerinde 1 μL α-siyano-4-hidroksinnamik asit (HCCA) matrisi ile yeniden oluşturulmuş fraksiyonun 1 μL'sini karıştırın.
   7. Maldi kütle spektrometresi ile tüm kesirleri analiz edin.
   8. Özel yazılımla oluşturulan spektrumları analiz edin (bkz. Malzeme Tablosu).

3. EV'lerin karakterizasyonu

1. Nanopartikül izleme analizi (NTA)
   NOT: NTA analizi bir nanopartikül izleme analiz cihazı (Malzeme Tablosunabakınız) ve otomatik şırınga pompası ile gerçekleştirilir.
   1. 0,20 μm filtrelenmiş PBS ile adım 2.2.3 her SEC fraksiyonu bir seyreltme (1:50-1:500 aralığı) olun.
   2. Vortex ev agregaları ortadan kaldırmak için çözüm.
   3. Seyreltilmiş çözeltiyi 1 mL şırıngaya koyun ve otomatik şırınga pompasına yerleştirin.
   4. Kamera ayarını ekran kazanç düzeyi (3) ve kamera düzeyine (13) ayarlayın.
   5. Çalıştır'a tıklayın ve aşağıdaki komut dosyasını başlatın.
      1. Numuneyi analiz odasına yükleyin (infüzyon hızı: 15 s için 1.000).
      2. Video kaydı için hız akışını azaltın ve stabilize edin (infüzyon hızı: 15 s için 25). Parçacık akışının art arda üç 60 s video yakalayın.
      3. Video analizinden önce kamera düzeyini (13) ve algılama eşiğini (3) ayarlayın. Ayarlar' a tıklayın| Analizi başlatmak için tamam ve analiz yapıldığında Dışa Aktar'a tıklayın.
   6. Her kesir analizi arasında, 0,20 μm filtrelenmiş PBS 1 mL ile yıkayın.
2. Elektron mikroskobu (EM) analizi
   1. Bölüm 2'de açıklandığı gibi EVs'leri yalıtın.
      NOT: Steril koşullar gerekli değildir.
   2. EVs ölçmek için bölüm 3.1 tekrarlayın.
      NOT: EM analizi için sadece pozitif kesirler kullanılacaktır.
   3. EV içeren SEC fraksiyonlarını yoğunlaştırmak için 50 kDa santrifüj filtre (Bkz. Malzeme Tablosu)kullanın.
   4. Konsantre EV'leri %2 paraformaldehitin (PFA) 30 μL'sinde yeniden askıya alın.
   5. Numunenin 10 μL'sini karbon kaplı bakır ızgaraya yükleyin.
   6. Islı bir ortamda 20 dakika kuluçka.
   7. Izgara üzerindeki numunenin iyi bir emilimi için 3.2.5 ve 3.2.6 adımlarını tekrarlayın.
   8. RT 5 dakika için PBS% 1 glutaraldehit bir damla içine ızgara aktarın.
   9. Numuneyi ultra saf suyla birkaç kez yıkayın.
   10. %4 uranyl asetat ve %2 metilselüloz (1:9, v/v) karışımı yla 10 dk buz üzerinde numuneyi kontrast. Bir filtre kağıdı kullanarak karışımın fazlalıkkaldırın.
   11. Numuneyi kurulayın ve 200 kV'da bir iletim elektron mikroskobu altında gözlemleyin (Bkz. Malzemeler Tablosu).
3. Batı leke analizi
   1. Protein ekstraksiyonu
      1. EVs izole etmek ve konsantre 3.2.1 için 3.2.3 adımları tekrarlayın.
      2. Mix 50 μL RIPA tampon (150 mM sodyum klorür [NaCl], 50 mM Tris, 5 mM Etilen glikol-bis(2-aminoetitillether)-N,N,N′,-tetraasetik asit [EGTA], 2 mM Etilenedanin-tetraasetik asit [EDTA], 100 mM sodyum florür [NaF], 10 mM sodyum pirofosfat, %1 Nonidet P-40, 1 mM Feniltansülsülfonil florür [PMSF], 1x proteaz inhibitörü) ev numunesi (filtredeki EV konsantrasyonundan kaynaklanan 25 μL) ile proteinleri ayıklamak için 5 dk.
      3. Sonicate için 5 s (genlik: 500 W; frekans: 20 kHz), buz üzerinde 3 kez.
      4. 4 °C'de, 10 dakika boyunca 20.000 x g'de vesiküler enkazları santrifüj ile çıkarın.
      5. Supernatant toplamak ve Bradford protein analiz yöntemi ile protein konsantrasyonu ölçmek.
   2. Sodyum dodecyl sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ve batı lekeleme
      1. Protein ekstrelerini (30 μg) 5c Laemmli örnek tampon (v/v) ile karıştırın.
      2. Protein karışımını %12 poliakrilamid jelüzerine yükleyin.
      3. Jeldeki proteinleri TGS tamponu (25 m Tris pH 8.5, 192 mM Glisin ve %0.1 SDS), 70 V'de 15 dakika ve 120 V 45 dakika ile geçirin.
      4. Proteinleri 30 dk boyunca 230 V'de yarı kuru sistemle nitroselüloz membrana aktarın.
      5. Membranı RT'de 1 saat boyunca bloke edici tamponile doygunlaştırın (%0.05 Ara 20 w/v, 0.1 M PBS içinde %5 süt tozu w/v, pH 7.4).
      6. Membranı bir gecede 4 °C'de fare monoklonal insan şoku önleyici protein 90 (HSP90) antikor bloke tamponu (1:100) ile inkübe edin.
      7. Membranı PBS-Tween (PBS, %0,05 Ara 20 w/v) ile 15 dakika boyunca üç kez yıkayın.
      8. Membranı RT'de 1 saat boyunca keçi horseradish peroksidaz-konjuge anti-fare IgG ikincil antikor bloke tampon (1:10,000) seyreltilmiş ile inkübe.
         NOT: Negatif kontrol tek başına ikincil antikor kullanılarak yapılır.
      9. Yıkama adımını tekrarlayın (adım 3.3.2.7).
      10. Gelişmiş kemilüminesans (ECL) batı lekealt tabaka kiti ile membran ortaya (Malzemeler Tablosubakınız).
4. Proteomik analiz
   1. Protein ekstraksiyonu ve jel içi sindirim
      1. EVs izole etmek ve konsantre 3.2.1 için 3.2.3 adımları tekrarlayın. EV protein ekstraksiyonu için adım 3.3.1'i tekrarlayın.
      2. %12 poliakrilamid jelin istifleme jelinde protein göçü yapın.
      3. RT 20 dakika için coomassie mavi ile jel proteinleri düzeltin.
      4. Her renkli jel parça excise ve 1 mm³küçük parçalar halinde kesilmiş.
      5. Jel parçalarını her çözeltiden 300 μL ile art arda yıkayın: 15 dk ultra saf su, 15 dakika için %100 asetonnitil (ACN), 15 dakika için 100 mM amonyum bikarbonat (NH₄HCO_3),ACN:100 mM NH₄HCO₃ (1:1, v/v) 15 dakika boyunca 100% ACN ve 5 dakika boyunca sürekli karıştırma ile %100 ACN.
      6. Vakum konsantratörü ile tamamen jel parçaları kurulayın.
      7. 100 μL 100 mM NH₄HCO₃ içeren 100 mM dithiothreitol ile 56°C'de 1 saat protein azaltımı yapın.
      8. RT'de karanlıkta 45 dakika boyunca 50 mM iodoacetamide içeren 100 mM NH₄HCO₃ ile protein alkiliyasyonu yapın.
      9. Jel parçalarını her çözeltiden 300 μL ile art arda yıkayın: 100 mM NH₄HCO₃ 15 dakika, ACN:20 mM NH₄HCO₃ (1:1, v/v) 15 dakika boyunca ve %100 ACN 5 dakika boyunca sürekli karıştırma ile.
      10. Tamamen bir vakum konsantratörü ile jel parçaları kuru.
      11. Protein sindirimini 20 mM NH₄HCO₃ gecede 37 °C'de 50 μL tripsin (12,5 g/mL) ile gerçekleştirin.
      12. 37 °C'de 30 dakika boyunca %100 ACN 50 000 ACN ve rt'de 15 dk sürekli karıştırarak sindirilmiş proteinleri jelden çıkarın.
      13. Aşağıdaki ekstraksiyon prosedürlerini iki kez tekrarlayın: 20 mM NH₄HCO₃ çözeltisinde %5'lik TFA'nın 50 μL'si 20 dk sürekli karıştırma ile.
      14. 10 dakika boyunca %100 ACN 100 μL'lik sürekli karıştırarak ekleyin.
      15. Bir vakum konsantratörü ile kuru sindirilmiş proteinler ve 20 μL% 0.1 TFA resuspend.
      16. Tatsuzlaştırma ve konsantre peptidler için C18 ters faz ortamına sahip 10 μL pipet ucu kullanarak numuneyi tuzdan arındırın (Malzeme Tablosunabakın) ve ACN:0.1% formik asit (FA) (80:20, v/v) ile elute peptidler.
      17. Sıvı kromatografi tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) için numuneyi vakum konsantratörü ile tamamen kurutun ve %20'lik ACN:0.1% FA (2:98, v/v) oranında yeniden askıya alın.
   2. LC-MS/MS Analizi
      1. Sindirilmiş peptidi LC-MS/MS aletine yükleyin ve başka bir yerde ayrıntılı olarak açıklanan parametrelere göre numune ve veri analizi yapın⁴².
   3. Ham veri analizi
      1. Proteinleri tanımlamak ve her numunenin tanımlanmış proteinlerini standart parametreleri kullanarak nicel proteomik yazılım paketiyle karşılaştırmak için kütle spektrometresi verilerini işleyin.
      2. İhracat, standart parametreleri kullanarak, protein ağları ve biyolojik süreçleri tahmin eden bir yazılım EV pozitif örneklerden özel ve aşırı temsil proteinlerin listesi.
      3. Kesirlerde tanımlanan proteinlerin listesini Exocarta açık erişim veritabanındaki en iyi 100 EV belirteçleriyle karşılaştırın (Bkz. Malzemeler Tablosu).

4. Fonksiyonel EVs Etkileri Tsası

1. PC-12 hücre hattında neurite outgrowth tsay
   1. Tam DMEM orta kültür PC12 hücre hattı (2 mM L-glutamin, 10% fetal at serumu (FHS), 5% fetal sığır serumu (FBS), 100 UI/mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin).
      NOT: Sera tüm prosedürde exosome ücretsizdir.
   2. 24 kuyulu bir tabağa bir kapak camı (tüm kuyular) ekleyin; poli-D-lizin (0.1 mg/mL) ve tohum 260.000 hücreleri / iyi ile plaka kat.
   3. Hücreleri %5 CO_2'ninaltında 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
   4. 24 saat kuluçkadan sonra orta yı DMEM farklılaştırma ortamına (DMEM ile 2 mM L-glutamin, %0.1 FHS, 100 UI/mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin) 1 x 10⁶ mikroglia EV (adım 1.1.2) değiştirin.
      NOT: Kontrol durumu diferansiyasyon ortasında mikroglia EVs olmadan yapılır.
   5. Tohumlamadan sonra 4.
   6. Tohumlamadan sonra 7.
   7. 4 °C'de 30 dakika rodamin konjuge phalloidin ile hücreleri lekelayın ve PBS ile 3 kez (her biri 10 dakika) durulayın.
   8. Hücreleri seyreltilmiş Hoechst 33342 (1:10,000) ile RT'de 30 dakika boyunca lekelendirin ve PBS ile 3 kez (her biri 10 dakika) durulayın.
   9. Kapak camı floresan montaj ortamına sahip bir slaytüzerine monte edin (bkz. Malzemeler Tablosu).
   10. Bir konfokal mikroskop ile slayt analiz, her slayt 5 rasgele görüntü almak.
   11. Başka bir yerde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi otomatik bir niceliklendirme yazılımı (toplam neurite uzunluğu) kullanarak ölçü nötrit outgrowth⁴³.
2. Sıçan primer nöronlar üzerinde neurite outgrowth
   1. Poli-D-lizin (0.1 mg/mL) ve laminin (20 μg/mL) içeren 8 kuyulu cam kaydırağı katlayın.
   2. Uygun kültür ortamındaki kültür sıçanı ticari birincil nöronlar (bkz.₂
      NOT: Sera tüm prosedürde ekzozomiçermez.
   3. Nöron kültürü ortamına 1 x 10⁶ mikroglia EVs ekleyin ve 37 °C'de %5 CO₂ altında 48 saat daha fazla kuluçkaya yatırın.
      NOT: Kontrol durumu nöron kültür orta mikroglia EVs olmadan yapılır.
   4. Hücreleri düzeltmek ve lekelemek için 4.1.6 ile 4.1.9 adımlarını izleyin.
   5. Slaytı analiz etmek için 4.1.10 ve 4.1.11 adımlarını izleyin.
3. Glioma hücre istilası
   1. Tam DMEM ortamda C6 sıçan glioma hücreleri resuspend (DMEM ile 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 1x antibiyotikler) içeren 5% kollajen içeren 8,000 hücrelerin son konsantrasyonda 20 μL.
      NOT: Sera tüm prosedürde ekzozomiçermez.
   2. 60 mm'lik doku kültürü kabının dibine 5 mL PBS yerleştirin. 20 μL (8.000 hücre) hücre süspansiyonunun kapağının kapağını ve tortu damlalarını kapağın altına ters çevirin.
   3. Kapağı PBS dolu alt haznesine ters çevirin ve hücre küreselleri oluşana kadar plakayı 37 °C ve %5 CO_2'de 72 saat inkübüne çevirin.
   4. 2.2 mg/mL kollajen karışımına (2 mL büyükbaş kollajen tip I çözeltisi [3 mg/mL] 250 μL 10x minimum esansiyel ortam (MEM) ve 0,1 M sodyum hidroksit 500 μL) ile 1 x 10⁸ makrofaj EVs (adım 1.2.2) ekleyin.
      NOT: Kontrol durumu kollajen karışımında makrofaj EV'ler olmadan gerçekleştirilir.
   5. Hücre küresellerini gömmek için 24 kuyuluk bir plaka içinde EVs içeren kollajen karışımı dağıtın.
   6. Her kuyunun ortasına yeni oluşan hücre spheroidlerini yerleştirin.
   7. Jeli katılaştırmak için 37°C'de 30 dakika ve %5 CO_2'de plakayı kuluçkaya yatırın.
   8. Daha sonra, her kuyudaki kollajen matrisinüzerine 400 μL'lik tam DMEM ortamı nı kaplayın.
   9. 37 °C ve %5 CO_2'detoplam 6 gün boyunca komple sistemi kuluçkaya yatırın.
      NOT: Küresel hücre istilası 4x/0.10 N.A. hedefi kullanılarak ters ışık mikroskobu kullanılarak dijital fotoğrafçılık tarafından izlenir.
   10. Her kuyunun her gün görüntülerini edinin.
   11. Görüntüleri işlemek ve daha önce ayrıntılı olarak açıklandığı gibi yazılım kullanarak hücre küresel alanların işgali ölçmek⁴².
       NOT: İstila ve küresel alanlar her gün invazyon ve 0.gün ölçülen küresel bölgelere normalleştirildi.

Sonuçlar

Biyolojik etkilerin hücre dışı veziküllere (EVs) atflanmasının önündeki en büyük zorluklardan biri, EV'leri tüm kültür ortamından izole edebilme yeteneğidir. Bu raporda, EV belirteçlerini doğrulamak ve biyoaktif bileşikleri tanımlamak için protein imzalarının büyük ölçekli analizine bağlı olarak ultracentrifugation (UC) ve boyut dışlama kromatografisi (SEC) kullanılarak bir yöntem salıyoruz. Makrofaj veya mikroglia kaynaklı EV'ler sırasıyla 24 saat veya 48 h kültüründen sonra şartlı ortamdan izole edilmiştir

Tartışma

Merkezi sinir sistemi (CNS) hücre-hücre iletişimi homeostaz için gerekli normal nöronal fonksiyonları düzenleyen karmaşık bir^{dokudur 30}. EVs şimdi yaygın olarak incelenmiş ve hücre-hücre iletişimi için önemli moleküler kargolar olarak tanımlanan^31. Özellikle alıcı hücrelere aracıbir kokteyl teslim ederek sağlıklı ve patolojik koşullarda işlevlerini etkileyen³². Son çalışmalar EVs CNS önemli bir rol oynadığını göstermektedir²⁴<...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
%12 Mini-PROTEAN  TGX Prekast Protein Jelleri	Bio-rad	4561045EDU
Asetonitril	Fisher Kimyasalları	A955-1&	nbsp;
Amicon 50 kDa santrifüj filtre	Merck	UFC505024
Amonyum bikarbonat	Sigma-Aldrich	9830
HSP90 α/β antikor (RRID: AB_675659)	Santa-cruz	sc-13119
B27 Plus takviye edici gıda	Gibco	A3582801
BenchMixer V2 Vorteks Mikser	Benchmark Scientific	BV1003
Bio-Rad Protein Testi Boya Reaktif Konsantresi (Bradford)	Bio-Rad	5000006
C18 Fermuar Uçları	Merck Kırlangıç	ZTC18S096
C6 sıçan glioma hücresi	ATCC	ATCC CCL-107
Kanonik tüpler	Sarstedt	62.554.002
Santrifüj	Eppendorf	5804000010
CO2 İnkübatörü	ThermoFisher
Konfokal mikroskop LSM880	Carl Zeiss	LSM880	ve nbsp;
Kapak camı	Marienfeld	111580
Kültür Kabı (60 mm)	Sarstedt	82.1473
Ditiyotreitol	Sigma-Aldrich	43819
DMEM	Gibco	41966029
EASY-nLC 1000 Sıvı Kromatograf	ThermoFisher
Elektron mikroskobu JEM-2100	JEOL
Etilen glikol-bis (2-aminoetileter) -N, N, N ve asal;, N ve asal; -tetraasetik asit	Sigma-Aldrich	03777-10G	ve nbsp;
Etilendiamintetraasetik asit	Sigma-Aldrich	ED-100G
Exo-FBS	Ozyme	EXO-FBS-50A-1	Eksozom tükenmiş FBS
ExoCarta veritabanı (Evs'in en iyi 100 proteini)			http://www.exocarta.org/
Fetal Sığır Serumu	Gibco	16140071
Fetal At Serumu	Biowest	S0960-500&	nbsp;
Filtropur S 0.2	Sarstedt	83.1826.001
Balıkçı markası  Q500 Problu Sonikatör	Fisherbrand 12893543
FlexAnalysis	Brucker
Floresan montaj ortamı	Agilent	S3023
Formik Asit	Sigma-Aldrich	695076
Formvar-karbon kaplı bakır ızgaralar	Agar scientific Ltd	AGS162-3	& nbsp;
Glikoz	Sigma-Aldrich	G8769
Gluteraldehit	Sigma-Aldrich	340855
Hoechst 33342	Euromedex	17535-AAT
İdoasetamid	Sigma-Aldrich	I1149
InstantBlue Coomassie Protein Lekesi	Expedeon	ISB1L
Ters ışık mikroskobu CKX53	Olympus
L-glutamin	Gibco	25030-024&	nbsp;
LabTek II 8 kuyu	Nunc	154534
Laemmli 2x	Bio-Rad	1610737
Laminin	Corning	354232
MaxQuant yazılımı (protein tanımlama yazılımı)			https://maxquant.net/maxquant/
MBT Polonya çelik	Brucker	8268711
MEM 10x	Gibco	21090-022
Metilselüloz	Sigma-Aldrich	M6385-100G
MiliQ su	Merck Millipore
Süt	Regilait	REGILAIT300
Mini PROTEAN Dikey Elektroforez Hücresi	Bio-Rad	1658000FC&	nbsp;
MonoP FPLC sütunu	GE Sağlık		artık mevcut değil
Nanosight NS300	Malvern Panalitik	NS300
NanoSight NTA yazılımı v3.2	Malvern Panalytical
NanoSight şırınga pompası	Malvern Panalytical
Nörobazal	Gibco	21103-049
Nitroselüloz membran	GE Sağlık	10600007
Nonidet P-40	Fluka	56741
Nunc multidish 24 kuyu	ThermoFisher	82.1473
Paraformaldehit	Elektro mikroskopi Bilimi	15713
PC-12 hücre hattı	ATCC	ATCC CRL-1721	ve nbsp;
Penisilin-Streptomisin	Gibco	15140-122
Peptit kalibrasyon karışımı	LaserBio Labs	C101
Peroksidaz AffiniSaf Keçi Anti-Fare IgG (H + L)	Jackson ImmunoResearch	115-035-003	& nbsp;
Perseus yazılımı (Tanımlanan proteinlerin işlenmesi)			https://maxquant.net/perseus/
Phalloidin-tetrametilrodamin eşleniği	Santa-cruz	sc-362065
Fenilmetansülfonil florür	Sigma-Aldrich	78830
Fosfat Tampon Salin	Invitrogen	14190094	kalsiyum içermez, magnezyum
pluri içermezSüzgeç M / 60 ve mikro; m	pluriSelect	43-50060
Poli-D-lizin	Sigma-Aldrich	P6407	& nbsp;
Polikarbonat santrifüj tüpleri	Beckman Coulter	355651
Proteaz İnhibitörü	Sigma-Aldrich	S8830-20TAB
PureCol	Hücre Sistemleri	5005
Q-Exactive kütle spektrometresi	ThermoFisher
rapifleX kütle spektrometresi	Brucker
Sıçan kortikal nöronları	Hücre Uygulamaları	R882N-20	Hücre kökeni: 18. günün serebral kortekslerinden türetilmiştir embriyonik Sprague Dawley sıçan beyinleri
Sıçan Makrofaj & Mikroglia Kültürü Orta	Hücre Uygulamaları	R620K-100	Hücre orjini: Normal sağlıklı Sıçan kemik iliği
Sıçan primer makrofajları	Hücre Uygulamaları	R8818-10a
Sıçan birincil mikroglia	Lonza	RG535
Sepharose CL-2B	GE Sağlık	17014001	& nbsp;
Sıralama Sınıfı Modifiye Tripsin	Promega	V5111	& nbsp;
Slide	Dustsher	100204
Sodyum Klorür	Scharlau	SO0227
Sodyum Dodesil Sülfat	Sigma-Aldrich	L3771
Sodyum Florür	Sigma-Aldrich	S7920-100G
Sodyum hidroksit	Scharlab	SO0420005P
Sodyum pirofosfat	Sigma-Aldrich	S6422-100G
SpeedVac Vakum Konsantratörü	ThermoFisher
Dize yazılımı (fonksiyonel protein ilişkilendirme ağları)			https://string-db.org/
SuperSignal West Dura Uzatılmış Süreli Yüzey	ThermoFisher	34075
Şırınga 1.0 mL	Terumo	8SS01H1
Trans-Blot SD Yarı Kuru Transfer Hücresi	Bio-Rad	1703940
Trifloroasetik asit	Sigma-Aldrich	T6508	ve nbsp;
Tris	Interchim	UP031657
Tris-Glisin	Euromedex	EU0550
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287
Ultrasantrifüj	Beckman Coulter	A95765
Ultrasantrifüj Rotor 70.1 Ti	Beckman Coulter	342184
Uranil	asetat Agar Scientific Ltd	AGR1260A
Whatman filtre kağıdı	Sigma-Aldrich	WHA10347510
&alfa;-Siyano-4-hidroksisinnamik asit	Sigma-Aldrich	C2020-25G