Yöntem makalesi

Formalin-Sabit Dokulardan Lyssavirüs Antijen Tespiti için İmmünohistokiniti Testi

DOI:

10.3791/60138

⸱

26 Ekim 2021

 , 
1Poxvirus and Rabies Branch, Division of High-Consequence Pathogens and Pathology, National Center for Emerging and Zoonotic Infectious Diseases, Centers for Disease Control and Prevention

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada formalin-sabit dokular için alternatif tanı testi olarak kuduz virüsü antijeninin tespiti için immünhistokinemya test protokolü sunuyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kuduz için birincil tanı yöntemlerinden biri, enfekte doku örneklerinde viral ribonikleoprotein (RNP) kompleksinin (antijen) saptanmasıdır. Antijen tespiti için doğrudan floresan antikor (DFA) testi veya doğrudan hızlı immünohistokimyasal test (DRIT) en yaygın olarak kullanılırken, her iki test de antikorlar kullanılarak antijen tespit edilmeden önce slaytlardaki gösterimler için taze ve/veya dondurulmuş dokular gerektirir. Örnekler formalin içinde toplanır ve sabitlenirse, her iki test de antijen tespiti için uygun değildir, ancak test parafin bloklarına ve kesitlere gömüldikten sonra geleneksel immünhistokimya (IHC) tarafından yapılabilir. Bu IHC yöntemi ile dokular anti-kuduz antikorları ile lekelenir, bölümler deparaffinize edilir, kısmi proteoliz veya diğer yöntemlerle antijen alınır ve primer ve sekonder antikorlarla inkübe edilir. Antijenler yaban turpu peroksidaz / amino etil karbazol kullanılarak lekelenir ve hafif bir mikroskop kullanılarak görselleştirme için hematoksilin ile karşıtır. Spesifik antijen tespitine ek olarak, formalin fiksasyonu histolojik değişikliklerin belirlenmesi, numune depolama ve taşıma için rahat koşullar (ortam sıcaklıkları altında), retrospektif vakaları test etme yeteneği ve enfeksiyöz ajanların inaktivasyonu yoluyla biyolojik güvenliğin iyileştirilmesi gibi başka avantajlar sunar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kuduz, lyssavirus cinsine ait negatif duyu RNA virüslerinin neden olduğu akut ilerleyici bir ensefalittir1. Cinsin tip üyesi kuduz virüsü (RABV) enfeksiyonundan kaynaklanan tüm insan ölümlerinin yaklaşık% 99'u köpekler tarafından bulaşır2. Şüpheli hayvanların kuduz tanısı, beyin dokusunda genomik RNA (ribonikoprotein kompleksi, RNP) ile komplekste antijenin (öncelikle viral kodlanmış nükleoprotein, N proteini) tespit edilmesine dayanır3. Doğrudan floresan antikor (DFA) testi ile antijen tespiti kuduz tanısı için altın standart olarak kabul edilir4. Yöntemde taze veya taze dondurulmuş beyin materyali, slayt üzerinde dokunma izlenimi, asetonda fiksasyon, ticari olarak mevcut floresan izotiyosiyanat (FITC) etiketli monoklonal veya poliklonal antikorlar (mAbs/pAbs) kullanılarak boyama ve floresan mikroskopisi tarafından okunur5. DFA testi hızlı, hassas ve taze beyin dokusunda kuduz antijen tespiti için özeldir. Son zamanlarda, doğrudan hızlı immünohistokimyasal test (DRIT), modifiye immünhistokimya (IHC) tekniğinin DFA'ya benzer hassasiyet gösterdiği gösterilmiştir, ancak görselleştirme için ışık mikroskopisi avantajı sunmaktadır6. DRIT'de kullanılan algılama yöntemi IHC'ye benzer olsa da, ilk adımda numunenin dokunma izlenimlerini oluşturmak için taze veya dondurulmuş dokular ve ardından formalin fiksasyonu kullanılır.

IHC, parafin bloklarına gömülü formalin-sabit dokularda spesifik antikorlar kullanarak histolojik değişiklikleri ve proteinlerin tespitini belirlemek için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. IHC, doku bölümlerinde kuduz antijen tespiti için belirlenmiş bir alternatif testtir7. IHC özellikle kuduz yükünü belirlemek için nörolojik hastalıklar sergileyen retrospektif vakaların tanısı için kullanılmıştır8. Parafin gömülü formalin sabit dokular, ortam sıcaklığında depolandığında birkaç yıl sonra bile proteinleri tespit için korur9. Formalin tedavisi, amino asit yan zincirlerini çapraz bağlayarak ve değiştirerek proteinleri değiştirir, bu da epitopların antikorlara karşı artık reaktif olmamasını sağlayabilir10. Kuduz antijen tespiti için IHC testi mAbs veya pAbs içerirken, ikincisi birden fazla epitop ve farklı lyssavirüsler tespit edilebildiğinden avantajlıdır11.

IHC'de yer alan standart adımlar dokuların formalin sabitlenmesi, parafin bloklarına gömülmesi, dokuların bölümlenmesi, deparaffinizasyon ve hidrasyon, epitop iyileşmesi, birincil ve ikincil antikorlara karşı reaktivite ve kromojenik substratlar kullanılarak gelişimdir. Bu makalede kuduz tanısı için protokolün ayrıntılı bir anlatımı açıklanmaktadır. Kuduz antijen tespiti için, ABD Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri (CDC) Atlanta, Georgia'da biyotinillenmiş fare karşıtı ikincil antikorlarla birlikte üretilen RABV (pAbs) ile aşılanmış fare serumu kullanılmaktadır. Biyotinilasyonlu Abs, streptavidin-yaban turpu peroksidaz (HRP) kompleksinin eklenmesi ve ardından amino-etilkarbazol substratı ile renk gelişimi ile tespit edilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mevcutsa RABV'yi devre dışı bırakan formalin-sabit dokularda IHC protokolü yapılırken, uygun biyogüvenlik protokollerine uygun şekilde uyulmalıdır. Tüm biyogüvenlik prosedürleri Mikrobiyolojik ve Biyomedikal Laboratuvarlarda Biyogüvenlik (BMBL) 5th Edition (https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm) içinde, uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) giymek ve açıklandığı gibi aşılama gereksinimi dahil olmak üzere açıklanmıştır12. Ek olarak, tehlikeli kimyasalların (formalin, AEC ve ksilen gibi) uygun şekilde muhafaza edilmesi ve işlenmesi takip edilmelidir (örneğin, duman davlumbazları).

1. Dokuların formalin sabitlenmesi

  1. Nekropsi sonrası toplanan 3-5 mm beyin dokularını13% 10 fosfat tamponlu formalin çözeltisine (1:20 ila 1:50 doku/ formalin oranı) 24-72 saat yerleştirin.
    DİkKAT: Formalin toksik bir fiksatiftir.
  2. Yaklaşık doku ağırlığını (boyutunu), doku tipini (beyin bölgelerini) ve formalin hacmini kaydedin. Laboratuvarların sabitleme sürelerine ilişkin kayıtları belgeleması ve tutması önemlidir.
  3. Formalin fiksasyonundan sonra ve işlemden önce daha uzun doku depolaması için, dokuyu% 70 etanol içine yerleştirin.

2. Doku işleme

  1. Örnek fiksasyonunu takiben, dokuyu beyin sapının kesitleri, beyincik (3 lob) veya hipokampus (her ikisi de hipokampi) gibi önemli beyin bölgelerini içerecek şekilde parçalara bölün ve her biri 3 ila 5 mm kalınlığında keser ve işleme kasetlerine yerleştirilir.
  2. Parafin bloklarına gömülü ve bir mikrotom üzerinde bölümlenmiş (3 ila 6 μm) parafin balmumu infiltrasyon için doku kasetlerini işleyin.

3. Malzemelerin Hazırlanması / Boyama yemekleri

  1. Şekil 1'de gösterildiği gibi boyama kabı14 'i(Malzeme Masası) ayarlayın. Her yemeği 250 mL çözelti ile doldurun.
  2. 3-Amino-9-etilkarbizol (AEC) substrat stok çözeltisinin hazırlanması
    1. Bir 20 mg tablet 3-amino 9-etilcarbazole (AEC) 5 mL N, dimetilformamid cam pipet kullanarak çözün.
      DİkKAT: AEC bir kanserojendir.
  3. Antijen alımı için proteaz (örneğin, Pronaz) stok çözeltisinin hazırlanması
    1. 200 mL PBS'de 7 mg proteaz çözün.
  4. Durulama tamponu PBS-T'nin hazırlanması
    1. 10 mL ara 80 ila 990 mL PBS ekleyin. Homojen bir çözelti oluşturmak için iyice karıştırın.

4. Deparaffinizasyon ve doku rehidrasyonu

  1. Bir mikrotom kullanarak 5 μm parafin bölümü yapın, 38 ° C'de bir su banyosunda yüzdürün ve cam slaytlara toplayın. Slaytları reaktife dayanıklı bir kalem/işaretleyici ile etiketleyin.
  2. Slaytları bir tepsiye yerleştirin ve 55-60 °C fırında 1 saat eritin. Viral antijeni yok edebileceğinden sıcaklığı 60 °C'nin üzerine yükseltmeyin.
  3. Slaytları fırından çıkarın ve 1, 2 ve 3 yemeklerinde her biri 5 dakikalık ardışık 3 ksilen durulamada hemen deparaffinize edin.
  4. Etanolün deiyonize suya seyreltilmesinde sıralı daldırmalarla slayttaki bölümleri yeniden sulandırın: (4 ila 11 bir daldırma durulamadır) çanak 4: ksilen / % 100 etanol (1:1); tabak 5: % 100 etanol; tabak 6: % 100 etanol; tabak 7: 95% etanol; tabak 8: 95% etanol; tabak 9: % 80 etanol; tabak 10: % 70 etanol; çanak 11: deiyonize su (Şekil 1. Çanak kurulumu).
    DİkKAT: Ksilen tehlikeli bir kimyasaldır ve duman kaputunda çalışma yapılmalıdır.

5. Proteolitik antijen alımı

  1. Slaytları proteazla (PBS'nin 2,5 μg/mL'si) proteolitik antijen alımı için 30 dakika boyunca tedavi edin 12.
  2. Ardından PBS-T'de 10 dakika durulayın (yemek 13).
  3. 10 dakika boyunca% 3 hidrojen peroksit ile tedavi edin (tabak 14).
  4. Yine PBS-T ile 10 dakika (bulaşık 15) yıkayın.

6. Boyama prosedürü

  1. Kalan slaytları arabelleğe batırarak slaytları teker teker işleyin (slayt tutucusuna tam olarak çıkarmayın - slaytları ıslak tutun). Doku bölümünü rahatsız etmemeye dikkat ingerek bir kaydırağı çıkarın ve doku bölümünün etrafındaki fazla tamponu (kağıt havlu kullanarak) lekeleyin. Nem odasında, nemlendirilmiş kağıt havlular yerleştirilerek yapılan, laboratuvar tezgahının üstkısmındaki 14'te oda sıcaklığında normal keçi serumu (blokaj) ile 15 dakika boyunca sürtün.
  2. Önceden belirlenmiş en uygun seyreltme primer anti-kuduz antikoru (fare anti-kuduz serumunun 1:250 seyreltilmesi, yayınlanmamış) (pozitif kontrol) ve negatif kontrol antikorlarını oda sıcaklığında yukarıdakiyle aynı şekilde (adım 6.1.) 60 dakika boyunca kuluçkaya bırakın.
  3. 60 dakika sonra PBS-T ile 10 dakika (tabak 16) yıkayın.
  4. Biyotinillenmiş antikorla (türe özgü) oda sıcaklığında 15 dakika boyunca nem odasında kuluçkaya yatırın (adım 6.1 ile aynı şekilde işlenin).
  5. PBS-T ile 10 dakika (bulaşık 16) yıkayın.
  6. Streptavidin-HRP kompleksi ile oda sıcaklığında 15 dakika boyunca bir nem odasında kuluçkaya yatır (6.1 ile aynı işleme).
  7. PBS-T ile 10 dakika (bulaşık 16) yıkayın.
  8. Peroksidaz substratı, amino-etilkarbazol (AEC) ile oda sıcaklığında 10 dakika boyunca bir nem odasında kuluçkalayın. Kullanmadan hemen önce AEC yapın. Bunu yapmak için, 14 mL 0,1M asetat tamponu olan pH 5,2'ye 1 mL AEC stok çözeltisi ekleyin. 0.15 mL% 3 H2O2ekleyin. Karışımı kullanmadan hemen önce filtreleyin (0,45 μm filtre).
    NOT: AEC'nin çalışma çözümü sadece 2-3 saat boyunca kararlıdır. AEC stok çözeltisi buzdolabında daha uzun süre saklanabilir.
  9. İyonize suda yıkayın 10 dk (bulaşık 17)
  10. Gill'in Hematoksilin ile karşıt 2 dakika boyunca deiyonize su ile 1:2 seyreltilmiş (çanak 18).
  11. Fazla Hematoksilin'i deiyonize su daldırma durulama ile durulayın (tabak 19 ve 20).
  12. Scott's Tap suyunda durulayın 30 s (bluing çözeltisi) yemek 21.
  13. İyonize suda yıkayın 10 dk (bulaşık 22)
  14. Slaytları birer birer çıkarın - suda çözünür montaj ortamıyla monte edin.
  15. Işık mikroskopunda slaytları okuyun.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 2, test edilen farklı beyin dokularındaki pozitif ve negatif kontrol örneklerinin temsili IHC boyama sonuçlarını göstermektedir. Şekil 2A,D,G 200x'te pozitif örnekleri temsil ederken, Şekil 2B, E, H sırasıyla 400x büyütmeye karşılık gelir. Şekil 2A-C beyin sapına karşılık gelir; Şekil 2

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Semptom başlangıcından sonra kuduzun yüksek ölüm oranı nedeniyle, RABV enfeksiyonu için şüpheli hayvanların tanısı uygun bir maruziyet sonrası profilaktik tedavi için son derece kritiktir. Kuduz tanısı öncelikle taze veya dondurulmuş dokular kullanılarak DFA, DRIT ve PCR tabanlı tekniklere bağlıdır. Formalin-sabit dokuların test edilmesi için, IHC testi RABV antijeninin hassas ve spesifik tespiti için alternatif bir yöntem sağlar. Formalin ile sabitlenen dokular çapraz bağlama gibi yan zincirlerin modifikasyonu nedeniyle...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Laboratuvar uzmanlarına, epidemiyologlara ve halk sağlığı departmanlarına bağlı kuruluşlara Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezlerine örnek gönderimler için teşekkür ederiz. Bu rapordaki bulgular ve sonuçlar yazarların bulgularıdır ve mutlaka Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezlerinin resmi konumunu temsil etmez. Ticari isimlerin ve ticari kaynakların kullanımı yalnızca tanımlama içindir ve Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri tarafından onay anlamına gelir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
%3 hidrojen peroksitPharamacy markalarıRaftan %3 H2O2
3-Amino-9-etilkarbazol (AEC)Millipore SigmaA6926
Asetat Tamponu pH 5.2Poly Scientific R& D A.Ş.s140
Tamponlu Formalin% 10 Fosfat TamponluFisher ScientificSF100-4Sertifikalı
Lamel CorningFisher Scientific12-553-47124 X 50 mm
Etanol 190 KorumalıPharmco-AAPER111000190
Etanol 200 KorumalıPharmco-AAPER111000200
Gill'in hematoksilen formülasyonu #2Fisher ScientificCS401-1D
HistoMark Biotin-Streptavidin Peroksidaz Kitiseracare71-00-18Fare Birincil Antikoru 
ImmunoHistoMountMillipore Sigmai1161Montaj ortamı
N,N, Dimetil formamid GRFisher ScientificD119
Fosfat Tamponlu Salin HyCloneRR14440.0101M, pH 7.2 (pH 7.2-7.6)
Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 AmaçÇoklu satıcılar
Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 Amaç Çoklusatıcılar
PronaseMillipore Sigma53702Protease, Streptomyces griseus
Scott'ın Musluk Suyu Poli Bilimsel Ar-Ge D A.Ş.s1887
Tissue-Tek Slide Leke SetiFisher Scientific50-294-72
TWEEN-80 Millipore SigmaP1754
KsilenFisher ScientificX3S-4Histolojik Sınıf
Zeiss Axioplan 2 görüntüleme - mikroskopBirden fazla satıcı

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rupprecht, C., Kuzmin, I., Meslin, F. Lyssaviruses and rabies: current conundrums, concerns, contradictions and controversies. F1000Research. 6, 184(2017).
  2. Fooks, A. R., et al. Current status of rabies and prospects for elimination. Lancet. 384 (9951), 1389-1399 (2014).
  3. Finke, S., Brzozka, K., Conzelmann, K. K. Tracking fluorescence-labeled rabies virus: enhanced green fluorescent protein-tagged phosphoprotein P supports virus gene expression and formation of infectious particles. Journal of Virology. 78 (22), 12333-12343 (2004).
  4. WHO. WHO Expert Consulation on Rabies, Third Report. WHO Technical Report Series. 1012, 1(2018).
  5. Goldwasser, R. A., Kissling, R. E. Fluorescent antibody staining of street and fixed rabies virus antigens. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 98 (2), 219-223 (1958).
  6. Lembo, T., et al. Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis. Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).
  7. Fekadu, M., Greer, P. W., Chandler, F. W., Sanderlin, D. W. Use of the avidin-biotin peroxidase system to detect rabies antigen in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Journal of Virological Methods. 19 (2), 91-96 (1988).
  8. Hamir, A. N., Moser, G., Rupprecht, C. E. A five year (1985-1989) retrospective study of equine neurological diseases with special reference to rabies. Journal of Comparative Pathology. 106 (4), 411-421 (1992).
  9. Inoue, S., et al. Cross-reactive antigenicity of nucleoproteins of lyssaviruses recognized by a monospecific antirabies virus nucleoprotein antiserum on paraffin sections of formalin-fixed tissues. Pathology International. 53 (8), 525-533 (2003).
  10. Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).
  11. Feiden, W., et al. Immunohistochemical staining of rabies virus antigen with monoclonal and polyclonal antibodies in paraffin tissue sections. Zentralblatt fur Veterinarmedizin Reihe B. 35 (4), 247-255 (1988).
  12. Manning, S. E., et al. Human rabies prevention--United States, 2008: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices. Morbidity and Mortality Weekly Reports Recommendations and Reports. 57, 1-28 (2008).
  13. WHO. Laboratory techniques in rabies. 1, 5th ed, 67-72 (2018).
  14. Patrick, E. M., et al. Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test. Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).
  15. Whitfield, S. G., et al. A comparative study of the fluorescent antibody test for rabies diagnosis in fresh and formalin-fixed brain tissue specimens. Journal of Virology Methods. 95 (1-2), 145-151 (2001).
  16. WHO. Diagnostic procedures for antigen detection. , https://www.who.int/rabies/about/antigendetection/en (2016).
  17. Jarvis, J. A., Franke, M. A., Davis, A. D. Rabies direct fluorescent antibody test does not inactivate rabies or eastern equine encephalitis viruses. Journal of Virology Methods. 234, 52-53 (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Kuduz Vir s AntijeniParafin G mmeAntijen Geri Kazan mAEC SubstratI k MikroskopisiProteaz lemiHematoksilin Kar t BoyamaPBS T Tamponu

İlgili makaleler