Yöntem makalesi

In Vitro Transcribed mRNA ile Primer Makrofajların Yüksek Verimli Transföytüsü

DOI:

10.3791/60143

⸱

9 Kasım 2019

 ,  ,  ,  , 
1Institute for Medical Microbiology, Immunology and Hygiene, Faculty of Medicine and University Hospital Cologne, University of Cologne, 2Center for Molecular Medicine Cologne, 3Cologne Cluster of Excellence on Cellular Stress Responses in Aging-associated Diseases (CECAD), 4German Center for Infection Research (DZIF)

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Makrofajlar, özellikle birincil makrofajlar, kendi kendine kökenli olmayan molekülleri tespit etmede uzmanlaşdıkları için transfect yapmak zordur. Plazmidler gibi DNA şablonlarından oluşturulan mRNA ile birincil makrofajların yüksek verimli transfeksiyonuna olanak tanıyan bir protokolü tanımlıyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Makrofajlar, kendine özgü olmayan molekülleri tespit etmede uzmanlaşmış fagositik hücrelerdir. Bu amaçla, onlar desen tanıma reseptörleri büyük bir dizi ile donatılmıştır (PRRs). Ne yazık ki, bu da transfection reaktif ve transfected nükleik asitler genellikle non-self olarak PrRs tarafından tanınan olarak transfect özellikle zor makrofajlar yapar. Bu nedenle transfeksiyon genellikle makrofaj aktivasyonu ve transfected nükleik asitlerin bozulması ve hatta makrofajların intiharı ile sonuçlanır. Burada, periton makrofajları (PM) ve kemik iliği kaynaklı makrofajlar (BMDM) gibi mRNA in vitro plazmidler gibi DNA şablonlarından transkripsiyonu ile yüksek verimli transföyt sağlayan bir protokol açıklıyoruz. Bu basit protokol ile PM için yaklaşık %50-65, BmDM için ise yaklaşık %85 transfeksiyon oranları sitotoksisite veya immünojenite gözlenmeden elde edilir. Plazmidler ve transfeksiyon prosedürü gibi DNA yapılarından transfeksiyon için mRNA üretimini ayrıntılı olarak açıklıyoruz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Makrofajlar, mikropları, apoptotik hücreleri ve hücresel enkazı tespit etme, sindiren ve alçaltma konusunda uzmanlaşmış fagositik hücrelerdir. Ayrıca, sitokinler ve kemokinler salgılayarak ve T hücreleri ve B hücrelerine antijenler sunarak bağışıklık yanıtları düzenlemek için yardımcı olur. Makrofajlar aynı zamanda yara iyileşmesi, ateroskleroz, tümörigenez ve obezite gibi birçok diğer süreçlerde de önemli rol oynarlar.

Patojenle ilişkili moleküler desenler (PAMP' ler) ve hasarla ilişkili moleküler desenler (DAMP' ler) gibi yersiz molekülleri tespit edebilmek için makrofajlar geniş bir dizi örüntü tanıma reseptörü (PRR)1ile donatılmıştır. Ne yazık ki, bu da transfeksiyon reaktifi olarak transfect2 özellikle zor makrofajlar yaparve transfected nükleik asitler4,5,6,7 genellikle non-self olarak PrRs tarafından kabul edilmektedir. Bu nedenle, makrofajların kimyasal veya fiziksel yöntemlerle transfeksiyonugenellikle makrofaj aktivasyonu ve transfekte nükleik asitlerin bozulması ve hatta piroptoz yoluyla makrofaj intiharı ile sonuçlanır, dna veya yabancı RNA9gibi sitosolik PAMP'lerin/DAMP'ların tanınmasından sonra tetiklenen programlanmış litik hücre ölümü formu. Vektörler gibi adenovirüs veya lentiviruses gibi virüsler kullanarak makrofajlar biyolojik transfeksiyon genellikle daha verimli, henüz bu tür viral vektörlerin inşaat zaman alıcı ve biyogüvenlik seviyesi 2 ekipmangerektirir 10,11.

Bu nedenle, makrofajlar yoğun araştırma konusu olmasına rağmen, moleküler düzeyde işlevlerinin analizi engellenir çünkü moleküler biyolojinin en önemli araçlarından biri olan nükleik asit infeksiyonu eksojen ifade için proteinler, pek uygulanabilir. Bu genellikle araştırmacıları iyi niyetli makrofajlar yerine makrofaj benzeri hücre hatlarını kullanmaya zorlar. Nükleik asit yapı transfeksiyonu için uygulamalar mutasyona uğramış veya etiketlenmiş protein versiyonlarının ekspresyonu, belirli bir proteinin aşırı ekspresyonu, ilgili nakavt arka planında proteinin yeniden ekspresyonu ve diğer türlerden proteinlerin ekspresyonu (örn. , Cre rekombinaz veya hedeflenen gen nakavt için RNA ve Cas9 kılavuzu).

Burada, plazmidler gibi DNA şablonlarından üretilen mRNA ile mRNA ile mrna peritoneal makrofajlar (PM) ve kemik iliği kaynaklı makrofajlar (BMDM) gibi birincil makrofajların (genellikle transfect zor) yüksek verimli transfeksiyon sağlayan bir protokol açıklar. Daha da önemlisi, bu protokol kullanılarak oluşturulan in vitro transkripsiyonlu mRNA, immünjeniteyi azaltan ve stabiliteyi artıran 5-metil-CTP ve psödo-UTP içeren doğal olarak modifiye edilmiş nükleozitler içerir4,6,7,12,13. Ayrıca, in vitro transkripsiyonu mRNA 5 '-uçları RIG-I kompleksi14,15tarafından tanınmasını önlemek için Antarktika fosfataz tarafından defosforile vardır. Bu in vitro transkripsiyonlu mRNA doğuştan bağışıklık tanıma en aza indirir. Kolay icra edilen protokolümüzle transfeksiyon oranları %50-65 (periton makrofajları (PM)) ve %85 (BMDM) arasında, daha da önemlisi sitotoksisite veya immünojenite gözlenmez. Transfeksiyon için immünolojik olarak susturulan mRNA'nın plazmidler ve (ii) transfeksiyon prosedürü nün kendisi gibi DNA yapılarından nasıl üretilebileceğini ayrıntılı olarak (i) açıklarız.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Farelerden makrofaj izolasyonu, Almanya Hayvan Koruma Kanunu'na uygun olarak Köln Üniversitesi Etik Komitesi'ne uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

NOT: Eldiven giyerek tüm adımları atın. Hücrelerin kontaminasyonunu önlemek için laminar akış başlığı altında tüm transfeksiyon adımlarını uygulayın. mRNA ile çalışmadan önce, pipetler ve her yüzey gibi tüm aletleri %70 etanol ve/veya RNAe bozucu yüzey aktif madde(Malzeme Tablosu)ile temizleyin. Tüm reaksiyon tüplerinin RNaAse içermeyen ve steril olduğundan emin olun. Seyreltmeler için sadece steril, RNAase içermeyen su kullanın. Sadece filtreli pipet uçlarını kullanın. Her pipetleme adımından sonra pipet ipuçlarını değiştirin.

1. DNA Şablonunun Üretimi

NOT: Bu protokolü kullanarak in vitro mRNA transkripsiyonu için DNA şablonu, RNA polimerazın yanaşmasına izin vermek için bir T7 promotor dizisi içermelidir. İlgi proteininin DNA dizilimini içeren plazmid zaten doğru yönlendirilmiş bir T7 promotor dizisi içeriyorsa, plazmidin doğrusallaştırılması (bkz. adım 1.1.) yapılmalıdır. Aksi takdirde, polimeraz zincir reaksiyonu ile ilgi dizisine bir T7 promotörü takın (PCR, bkz. adım 1.2.).

  1. T7 promotor içeren plazmidlerin doğrusallaştırılması
    1. İlgi sırasının dur kodonunun aşağı akışını kesen bir restriksiyon enzimi ile sindirim yoluyla doğru yönlendirilmiş bir T7 promotor dizisi içeren plazmidleri doğrusallaştırın. Aksi takdirde, transkripsiyon ilgi sırası sonra düzgün sona ermez.
      NOT: En iyisi künt uçlar veya 5' çıkıntı bırakarak restriksiyon enzimleri kullanmaktır.
    2. Sindirilmemiş plazmid DNA'sına karşı abirrose jel elektroforezi ile plazmidin tam doğrusallaştırılmasını onaylayın.
    3. Dna arıtma kiti(Tablo Malzemeler)kullanarak in vitro mRNA transkripsiyonu için DNA şablonu olarak kullanılmadan önce doğrusallaştırılmış plazmid DNA'sını arındırın.
  2. T7 promotörün PCR ile bağlanması
    1. Aşağıdaki bileşenleri içeren bir ileri astar kullanın (belirtilen sırada 5' den 3'): promotörün yaklaşık 5 rasgele bp upstream (örneğin, GAAAT); T7 promotor dizisi (TAATACGACTCACTATAG); artan transkripsiyon verimliliği (GG) için iki ekstra Gs; başlangıç kodonunu çevreleyen plazmid dizisine homolog olan hedef diziye özgü parçadır.
      NOT: Bu oluşmalıdır: KOZAK dizisinin 3-6 bp upstream ve start codon, KOZAK dizisi ve başlangıç kodonu (genellikle GCCACC ATG G), 12-18 bp başlangıç kodonun aşağı akışı. İlgi sırası zaten bir KOZAK dizisi veya başlangıç kodonu içermiyorsa, bunlar astar sıralarına eklenerek bu adıma eklenebilir.
    2. Sadece hedef diziye homolog parçayı dikkate alarak ileri astarın tm'sini hesaplayın.
    3. Dimers / saç tokası oluşumunu değerlendirmek için kolayca 50 bp aşabilir tüm astar dizisi kullanın.
    4. Dur kodonunun aşağısında bir yerde bulunan ters astar kullanın.
      NOT: İlgi sırası zaten bir stop kodonu içermiyorsa, bu adımda yalnızca astar sırasını ekleyerek eklenebilir.
    5. Proofreading(Tablo Malzemeler)ile yüksek doğruluklu polimeraz kullanarak bir PCR gerçekleştirmek için ileri ve geri astar kullanın.
    6. Agarose jel elektroforez (örneğin, % 1 agarose jel ve 100 V sabit akım kullanın) tarafından tek bir ürün ve amplicon boyutu üretimi doğrulayın.
    7. DNA arıtma kiti kullanarak in vitro mRNA transkripsiyonu için DNA şablonu olarak kullanmadan önce PCR ürününü arındırın.

2. mRNA Üretimi

  1. In vitro mRNA transkripsiyon kitinin tüm bileşenlerini eritin (Bkz. Malzemeler Tablosu). 5 s için girdap ve 2 s için aşağı spin 2,000 x g. Kullanıma kadar buzda tutun.
  2. Aşağıdaki sırada 0,5 mL mikrosantrifüj tüp (toplam hacim 40 μL): 20 μL 10x ARCA/NTP karışımı (in vitro mRNA transkripsiyon kitidahil); 0.25 μL 5-metil-CTP (nihai konsantrasyon (f.c.) 1.25 mM; toplam CTP'nin %50'si); 0.25 μL psödo-UTP (f.c. 1.25 mM; toplam UTP'nin %50'si); DNA şablonunun X μL'si; 2 μL T7 RNA polimeraz karışımı (in vitro mRNA transkripsiyon kitine dahildir); RNAse içermeyen H2O'nun Y μL'si.
    NOT: X, en az 1 μg DNA içeren bir hacimdir. Örneğin, 625 ng/μL stok çözeltisinden 1,6 μL. Y, toplam 40 μL hacmine yedek hacimdir.
  3. 5 s için girdap ve 2 s için aşağı spin 2,000 x g. 37 °C'de 30 dakika 400 rpm'de in vitro transkripsiyon için bir termal mikserde kuluçkaya yatırın.
  4. Daha sonra, şablon DNA'sının çıkarılması için doğrudan reaksiyon karışımına 2 μL DNase I ekleyin. 5 s için girdap ve 2 s için aşağı spin 2,000 x g.
  5. Bir termal mikser üzerinde 400 rpm 15 dakika için 37 °C'de kuluçka. Kontrol jeli (adım 3.3) için 2 μL'lik bir aliquot alın ve -80 °C'de saklayın.
  6. Poli(A) atıkları için aşağıdaki bileşenleri doğrudan önceki reaksiyon karışımına (son 50 μL'lik bir hacim: 5 μL 10x poli(A) polimeraz reaksiyon tamponu ve 5 μL poly(A) polimeraz (her ikisi de in vitro mRNA transkripsiyon kitinde yer almaktadır) ekleyin. 5 s için girdap ve 2 s için aşağı spin 2,000 x g.
  7. Karışımı 37 °C'de 30 dk 400 rpm'de bir thermomixer'da kuluçkaya yatırın. Kontrol jeli (adım 3.3) için 2 μL'lik bir aliquot alın ve -80 °C'de saklayın.
  8. mRNA'nın 5'lik uçlarının fosforilasyonunun defosforilasyoniçin, aşağıdaki bileşenleri doğrudan önceki reaksiyon karışımına ekleyin (60°L'lik son bir hacme: 3 μL RNAse-free H2O; 6 μL 10x Antarktika fosfataz reaksiyon tampon; 3 μL Antarktika fosfataz (60 μL reaksiyon hacmi için 15 birim). 5 s için girdap ve 2 s için aşağı spin 2,000 x g.
  9. Karışımı 37 °C'de 30 dk 400 rpm'de bir termal mikserde kuluçkaya yatırın.
  10. Isı-inaktive Antarktika fosfataz kuluçka ile 80 °C 2 dakika için.
    NOT: İdeal olarak, ayrı bir termal karıştırıcı kullanın, ilk mikser istenilen sıcaklığa ulaşana kadar beklemeyin.

3. mRNA Arınma

  1. Özel bir RNA arıtma kiti(Malzeme Tablosu)kullanarak in vitro transkripsiyonlu mRNA'yı arındırın.
    1. Adım 2.10'dan mRNA reaksiyon karışımına X μL elüsyon çözeltisi ekleyin. 5 kez ters çevirerek karıştırın. 300 μL bağlayıcı çözelti konsantresi ekleyin. 5 kez hafif pipetleme ile karıştırın.
      NOT: X, toplam 100 μL'lik yedek hacimdir. Örneğin, 60 μL mRNA reaksiyon karışımına 40 μL elüsyon çözeltisi ekleyin.
    2. 100 μL RNAase içermeyen etanol ekleyin. 5 kez hafif pipetleme ile karıştırın.
    3. Verilen toplama tüplerinden birine bir filtre sütunu yerleştirin. mRNA reaksiyon karışımını filtreye dokunmadan yavaşça filtrenin ortasına aktarın. Oda sıcaklığında 1 dk (RT) için 15.000 x g santrifüj.
    4. Filtre sütununa dikkatlice kaldırın ve akış akışını toplama tüpüne atın. Filtre sütunu aynı toplama tüpüne geri yerleştirin.
    5. 500 μL yıkama çözeltisi ekleyin (yıkama solüsyonunu ilk kez kullanmadan önce 20 mL RNAase içermeyen etanol eklemeyi unutmayın).
    6. Centrifuge 1 dk için 1 5.000 x g RT. Tekrar adımları 3.1.4-3.1.6 bir kez daha yıkamak için.
    7. Filtre sütunundan kalan sıvıyı çıkarmak için RT'de 1 dakika boyunca tam hızda (17.900 x g)santrifüj. Toplama tüpünden filtre sütununa dikkatlice alın. Filtre sütununu yeni bir toplama tüpüne yerleştirin.
    8. Filtreye dokunmadan filtrenin ortasına 50 μL'lik elüyama arabelleği ekleyin. Bir termal mikser üzerinde 10 dakika boyunca 65 °C'de kuluçkaya yatırın.
    9. 1 dk'da 1 dk için 15.000 x g'de santrifüj. Filtre sütunundan çıkarın ve atın.
  2. Örneğin, 260 ve 280 nm'de emiciliği ölçmek için bir mikro hacim spektrofotometre kullanarak, eluted mRNA'nın konsantrasyonve saflığını ölçün.
    NOT: 1.8-2.1 A260/A280 oranı yüksek saflaştırılmış mRNA göstergesidir.
  3. Tek bir ürünün varlığını doğrulayın, doğru transkript uzunluğu ve poli(A) atıkları 2.5 ve 2.7 basamaklarındaki aliquotları denatüre koşullar altında agarose jel elektroforezi ile analiz ederek (örneğin, 20 mM 3-(N-morfololo içeren %1,2 agarose jel kullanın) propanülfonik asit [MOPS], 5 mM sodyum asetat, 1 mM EDTA ve %20 formaldehit ve 20 mM MOPS, 5 mM sodyum asetat, 1 mM EDTA ve % 0.74 formaldehit 100 V sabit akımda çalışır.
  4. Saflaştırılmış mRNA'yı elüsyon tüpünde -80 °C'de transfeksiyona kadar saklayın. Transfeksiyon için mRNA'nın sadece düşük miktarda kullanılması durumunda, tekrarlanan donma-çözülme döngülerini önlemek için mRNA'yı aliquot.
    NOT: mRNA -80 °C'de yaklaşık 1 yıl saklanabilir.

4. Makrofaj Hazırlığı

  1. Ötanazi C57/BL6 fareler (aynı cinsiyette ve 6-24 haftalık fareler kullanın) servikal çıkış tarafından.
    NOT: Aynı fareler PM (adım 4.2) ve BMDM üretimi (adım 4.3 ve 4.4) izolasyon için kullanılabilir. PM izolasyon için en az iki fare kullanın. Sadece BMDM oluşturulacak ise genellikle bir fare yeterlidir.
  2. Periton makrofajlarının immünomanyetik zenginleşmesi.
    1. 10 mL'lik bir şırıngayı 0,9 x 40 mm kanül ile 8 mL buz gibi fosfat tamponlu salin (PBS) ve 2 mL hava ile doldurun. Periton boşluğunu PBS ile temizle. Hava, PBS sızıntısını en aza indiren bir kabarcık oluşturacaktır.
    2. Aynı şırıngayla periton lavajını hızlı bir şekilde toplayın ve 50 mL konik santrifüj tüpüne aktarın. Gerekirse birden fazla farenin periton hücrelerini birleştirin. Hücre süspansiyonuna buz da tut.
    3. Santrifüj hücre süspansiyonu 650 x g'de 5 dk 4 °C'de. Süpernatant atın ve kırmızı kan hücreleri lyse için 30 s için 0.2 % NaCl 5 mL hücre pelet resuspend.
    4. İzotonik koşulları yeniden oluşturmak için toplam 10 mL hacmine %1,6 NaCl'lik 5 mL ekleyin. Santrifüj 650 x g için 5 dk 4 °C'de.
    5. 1 periton el lavajı başına (örneğin, üç fare kızarmışsa, 292,5 μL'lik manyetik hücre sıralama (MCS) tamponu (2 mM ethylenediamminetetraacetic asit [EDTA], PBS'de %5 büyükbaş serum albumini [BSA] ) (örneğin, üç fare kızartılırsa, 292,5 μL'de yeniden askıya alın, ).
    6. 97,5 μL hücre süspansiyonu başına CD11b'ye özgü bir antikora konjuge 2,5 μL paramanyetik boncuk ekleyin (örn. 7,5 μL ila 292,5 μL).
    7. Yörüngesel bir çalkalayıcı üzerinde 150 rpm 15 dakika buz üzerinde kuluçka.
    8. 4 °C'de 5 dakika için 650 x g'de santrifüj hücre süspansiyonu, supernatant'ı atın ve 1 mL MCS tamponunda hücre peletini yeniden askıya alın.
    9. Toplam 5 mL'lik hacme 4 mL MCS tamponu ekleyin ve hücreleri üç kez hafifçe yukarı ve aşağı borulandırarak yıkayın.
    10. Toplam üç yıkama adımı için 4.2.8 ve 4.2.9 adımlarını iki kez daha tekrarlayın.
    11. Yıkama adımları sırasında bir LS sütunu manyetik hücre ayırıcısı yerleştirin (bkz. Malzemeler Tablosu). 3 mL MCS arabelleği ile sütunu durulayın.
      NOT: Bu sütun tıkamak olabilir gibi herhangi bir kabarcıklar kaçının.
    12. MCS arabelleği 1 mL hücre pelet resuspend. Toplam 4 mL hacime 3 mL MCS tampon ekleyin, üç kez yukarı ve aşağı borular oluşturarak karıştırın.
    13. Hücre süspansiyonunun 4 mL'sini durulanan LS sütununa aktarın.
      NOT: Yine, bu sütun tıkamak olabilir gibi herhangi bir kabarcıklar kaçının.
    14. Sütunun haznesi tamamen boşalana kadar bekleyin. Sütun damlama durana kadar ek sıvı eklemeyin.
    15. Sütuna 3 mL MCS arabelleği ekleyin. Ardından, sütunun rezervuarı tamamen boşalana kadar bekleyin. Adımı 4.2.15'i iki kez daha tekrarlayın.
    16. LS sütununu 15 mL konik santrifüj tüpüne yerleştirin. Sütuna 5 mL MCS arabelleği uygulayın. 2 mL sıvı sütundan geçene kadar bekleyin, sonra kalan fraksiyonu yavaşça tüpe itmek için pistonu kullanın.
    17. 4 °C'de 5 dk için 650 x g centrifuge hücre süspansiyon ve supernatant atın.
    18. DMEM'in 1 mL'lik hücre pelletini %10 ısı yalıtımlı fetal baldır serumu (FCS) (DMEM+FCS) ile takviye edin.
    19. Neubauer sayma odasında trypan mavisi çözeltisi ve DMEM+FCS'deki tohum hücrelerini kültür plakalarına sayarak canlı hücre sayısını belirleyin.
      NOT: Tohum PM 100.000 hücre / iyi bir düz alt mikrotiter plaka yoğunluğunda. PM bunlardan ayrı tutulamayacağından doku kültürü yle tedavi edilen plakaları kullanmayın. Bunun yerine işlemlenmemiş plakalar kullanın.
  3. BMDM üretimi
    1. Bir makas kullanarak arka bacaklardan deri ve kasları çıkarın. Her bacağı %70 etanolle kısa bir daldırma ile yıkayın.
    2. Bacakları ayırın ve femur ve tibia nın her iki ucunu makasla keserek açın.
    3. 0,6 mm x 30 mm'lik bir kanülle dolu 5 mL'lik çok düşük endotoksin (VLE) RPMI 1640 ile doldurun ve açılan kemiklerden kemik iliğini bir kültür kabına boşaltın.
    4. 4.3.1-4.3.3 adımlarını tekrarlayarak gerekirse birden fazla farenin kemik iliğini birleştirin. Kemik iliğini 50 mL konik santrifüj tüpüne aktarın.
    5. Kemik iliği süspansiyonuna 650 x g'de 4 °C'de 5 dakika santrifüj edin ve süpernatantı atın.
    6. Kırmızı kan hücresi lisis tamponu 5 mL hücre pelet resuspend (8.3% NH4Cl, 0.1 M Tris) ve kırmızı kan hücrelerini lyse RT 5 dakika kuluçka.
    7. Hücre süspansiyonuna 4°C'de 650 x g'de 5 dakika santrifüj edin ve süpernatantı atın.
    8. VLE RPMI 1640 orta 1 mL hücre pelet resuspend 10% FCS, 1% penisilin / streptomisin, 1% HEPES, 1% sodyum pirüuvat ve 10 ng / mL rekombinant makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) (RPMI+++++ile desteklenmiştir).
    9. Toplam 5 mL seshacmine 4 mL RPMI+++++ ekleyin.
    10. Her çanağa 7 mL RPMI+++++ orta boru tutarak fare başına 5 adet 92 mm x 16 mm işlenmemiş Petri kapları (Malzeme Tablosu'nabakın) hazırlayın.
    11. 1 mL hücre çözeltisini hazırlanan 5 kültür yemeğine aktarın ve 37 °C ve %5 CO2'dekuluçkaya yatırın.
    12. 4 gün sonra 4 mL RPMI+++++ekleyerek hücreleri besleyin. 6-7 gün sonra kemik iliği hücreleri tam olarak BMDM'ye ayrılır.
  4. BMDM Hasat
    1. Tamamen kültür yemekleri orta kaldırın. Her çanağa PBS'de 5 mL sıcak 0,2 mM EDTA ekleyin.
    2. BMDM'yi ayırmak için tüm plakayı bir hücre kazıyıcıyla hafifçe kazıyın. Hücre süspansiyonlarını 50 mL konik santrifüj tüpünde birleştirin.
    3. 5 yemeği de tekrar yıkayın. 5 yemek için PBS'de 5 mL sıcak 0,2 mM EDTA hacmini kullanın. Bu hücre süspansiyonu ile bir önceki adımdaki süspansiyonu birleştirin.
    4. Hücre süspansiyonuna 650 x g'de 4°C'de 5 dakika için santrifüj edin ve süpernatantı atın.
    5. VLE RPMI 1640 orta 1 mL hücre pelet resuspend 10% FCS, 1% HEPES, 1% sodyum pirüuvat ve 10 ng / mL rekombinant M-CSF ama hiçbir antibiyotik (RPMI++++)ile takviye.
    6. Neubauer sayma odasında trypan mavi sayarsak ve RPMI++++'daki tohum hücrelerini kültür plakalarına sayarak canlı hücre sayısını belirleyin.
      NOT: Tohum BMDM 50.000 hücre / iyi maksimum bir düz alt mikrotiter plaka yoğunluğunda. BMDM bunlardan güçlükle ayrılabildiği için doku kültürü yle tedavi edilen plakaları kullanmayın. Bunun yerine işlemlenmemiş plakalar kullanın.

5. Makrofajların mRNA ile transfeksiyonu

  1. MRNA transfeksiyon arabelleği gerekli hacmini hesaplayın.
    NOT: Gerekli mRNA transfeksiyon tampon hacmi iyi boyutuna bağlıdır: 6-iyi plaka transfeksiyon için 200 μL, 12-iyi plaka ve benzeri 100 μL kullanın. Her zaman boru kaybı nedeniyle biraz yedek hacim ekleyin (ama çok fazla değil, mRNA gereksiz seyreltme önlemek için). Örneğin, 4 x 100 μL = 400 μL yerine 450 μL kullanın ve 12 kuyuluk bir plakanın 4 kuyusunda transfect kullanın.
  2. MRNA transfeksiyon reaktifinin gerekli hacmini hesaplayın. mRNA transfeksiyon reaktifi 1:50 oranında eklenir. Örneğin, 450 μL'lik son hacim için 9 μL mRNA transfeksiyon reaktifi gereklidir.
  3. Gereken toplam mRNA miktarını hesaplayın. Verimli transfeksiyon için 100.000 makrofaj başına en az 100 ng gereklidir, 200 ng daha da iyi çalışır (örn. transfect 400.000 makrofaj için 800 ng mRNA).
    1. Transfektif olması gereken toplam kuyu sayısı ile gerekli hesaplanan mRNA miktarını çarpın (örn. her biri 400.000 makrofajlı 4 kuyu: tüm kuyular için toplam 4 x 800 ng = 3.200 ng mRNA gereklidir). Örneğin, mRNA stokunuz 426,8 ng/μL ise, her biri 400.000 makrofajiçeren 4 kuyunun optimum transfeksiyonu için 7,49 μL gerekir.
  4. MRNA transfeksiyon arabelleği (adım 5.1.) hesaplanan hacmi eksi mRNA transfeksiyon reaktifi (adım 5.2) ve mRNA (adım 5.3) bir reaksiyon tüpüne ekleyin. Örneğin, 450 μL - 9 μL - 7,49 μL = 433,51 μL.
  5. MRNA stoğunu eritin ve elüsyon tüpünün hafifçe çevrilerek karıştırın. MRNA reaksiyon arabelleği ile reaksiyon tüpüne hesaplanan mRNA hacmini (adım 5.3) ekleyin (yukarıdaki örnekte: 433.51 μL'de 7.49 μL).
  6. 5 s için girdap ve 2 s için aşağı spin 2,000 x g.
  7. Girdap mRNA transfeksiyon reaktifi 5 s ve 2 s için 2 s aşağı spin 2.000 x g.
  8. MRNA transfeksiyon reaktifini içeren reaksiyon tüpüne hesaplanan mRNA transfeksiyon reaktifinin hacmini (adım 5.2) ekleyin (yukarıda sunulan örnekte: 9 μL mRNA transfeksiyon reaktifi).
  9. Girdap transfeksiyon karışımı 5 s ve 2 s için 2 s aşağı spin 2,000 x g.
  10. RT'de 15 dakika kuluçka.
  11. Bu arada, makrofajların kültür ortamını taze ve sıcak kültür ortamıyla değiştirin (bkz. 4.2.18. ve 4.4.5. adımlar).
  12. Kuluçka adımı 5.10'dan sonra, makrofajları içeren kuyulara kuyunun büyüklüğüne uygun bir hacimde transfeksiyon karışımını ekleyin (bkz. adım 5.1). Transfeksiyon karışımını dışarıdan kuyunun ortasına doğru bir daire içine damlaşeklinde ekleyin.
  13. Yavaşça plaka kaya, bir dikey ilk ve daha sonra yatay bir yönde iyi transfection karışımı düzgün dağılımını sağlamak için. Daha sonra, 37 °C ve % 5 CO2'dekuluçkaya yatırın. Transfected mRNA tarafından kodlanmış proteinsentezi transfeksiyondan kısa bir süre sonra başlayacaktır. En iyi sonuçlar için, en az 6 saat kuluçka.
  14. Kuluçkadan sonra transfeksiyon verimliliğini (immüno) floresan mikroskobu, akış sitometrisi veya immünoblot16ile analiz edin veya transfected makrofajları tercih edilen deney için kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Birincil makrofajların transfeksiyonu için FLAG etiketli NEMO ve IKKβ varyantları için mRNA kodlaması oluşturmak için bu protokolü başarıyla kullandık16. FLAG etiketli yabani tip (NEMOWT)ve C54/347A mutant NEMO (NEMOC54/374A) (Malzemeler Tablosunabakınız) için kodlama plazmidler zaten doğru yönde bir T7 promotor içerir(Şekil 1A). Böylece, sadece in vitro transkripsiyon için DNA şa...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada in vitro transkripsiyonu mRNA ile genellikle transfect primer makrofajların yüksek verimli transfeksiyonu için bir protokol salıyoruz. Daha da önemlisi, bu protokolü kullanarak makrofajların transfeksiyonu hücre ölümüne neden olmaz veya proinflamatuar sinyali aktive etmez ve transfeksiyon reaktifinin veya transfected mRNA'nın kendi kendine tanınmadığını gösterir.

Bu protokolü kullanarak makrofajların başarılı bir şekilde transfeksiyonu için mRNA'nın kalitesi çok önemlidir. Bu nedenle, m...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
5-metil-CTP (100 mM)Jena BiosienceNU-1138S-20 ° C'de saklanır; C
Antarktika fosfatazNew England BioLabsM0289-20 ° C'de saklanır; C
Antarktika fosfataz reaksiyon tamponu (10x)New England BioLabsB0289-20 °C'de saklanır; C
anti-NEMO / IKK ve gama; antikorInvitrogenMA1-41046-20 ° C'de saklanır; C
anti-β-aktin antikoruSigma-AldrichA2228-20 ° C'de saklanır; C
Petri kapları 92,16 mm kamlıSarstedt821,473
CD11b'de saklanır Microbeads fare ve insanMiltenyi Biotec130-049-6014 &°C'de saklanır; C
Cre rekombinaz + T7-Promotor ileri astarSigma-Aldrich5′-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGGCAGCCGCCACCATGTCC
AATTTACTGACCGTAC-3&akut;, -20 °C'de saklanır; C
Cre rekombinaz + T7-Promotor ters astarSigma-Aldrich5′-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG
C-3′, -20 °C'de saklanır; C
DNA saflaştırma kiti: QIAquick PCR saflaştırma KitiQiagen28104RT
eGFP + T7-Promotor ileri astarSigma-Aldrich5&akut;-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGATCCATCGCCACCATGGTG
AGCAAGG-3&akut;, -20 °C'de saklanır; C
eGFP + T7-Promotor ters astarSigma-Aldrich5&akut;-TGGTATGGCTGATTA
TGATCTAGAGTCG-3&akut;, -20 °C'de saklanır; C
Hızlı Özet tamponu (10x)Thermo ScientificB64-20 °C'de saklanır; C
FastDigest XbaIThermo ScientificFD0684-20 ° C'de saklanır; C
Düzeltme okumalı yüksek kaliteli polimeraz: Q5 Yüksek Kaliteli DNA-PolimerazNew England Biolabs IncM0491S-20 ° C'de saklanır; C
IKK ve beta; + T7-Promotor ileri astarSigma-Aldrich5 & prime; -GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGTTGATCTACCATGGACTACA
AAGACG-3 & prime;, -20 & derecede saklanır; C
IKK & beta; + T7-Promotor ters astarSigma-Aldrich5 & prime ; -GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3 & prime ;, -20 ° C'de saklanır; C
In vitro mRNA transkripsiyon kiti: HiScribe T7 ARCA mRNA kiti (polyA kuyruğu ile)New England BioLabsE2060-20 °C'de saklanır; C
LS SütunlarıMiltenyi Biotec130-042-401
MACS MultiStand'daMiltenyi Biotec130-042-303
mRNA transfeksiyon tamponu ve reaktifinde saklanır: jetMESSENGERPolyplus transfeksiyon409-0001DE,4 &°C'de saklanır; C
Mutant IKK ve beta; IKK-2S177/181E plazmidAddgene11105-20 °C'de saklanır; C
Mutant NEMOC54/347A plazmidAddgene27268-20 ° C'de saklanır; C
pEGFP-N3 plazmidAddgene62043-20 ° C'de saklanır; C
poli (I: C)Calbiochem528906-20 ° C'de saklanır; C
pPGK-Cre plazmidiF.T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, İndüklenebilir Cre rekombinazın yeni varyantları: Cre-PR füzyon proteininin yeni bir mutantı, gelişmiş duyarlılık ve genişletilmiş bir indüklenebilirlik aralığı sergiler. Nükleik Asitler Res. 29, 47e (2001). -20 ° C'de saklanır; C
psödo-UTP (100 mM)Jena BiosienceNU-1139S-20 ° C'de saklanır; C
QuadroMACS AyırıcıMiltenyi Biotec130-090-976RT
Rat-anti-mouse CD11b antikoru, APC konjugeBioLegend1012124 °C'de saklanır; C
Sıçan-anti-fare F4 / 80 antikoru, PE konjugeeBioscience12-4801-824 & °C'de saklanır; C
Rekombinant M-CSFPeprotech315-02-20 ° C'de saklanır; C
RNA saflaştırma kiti: MEGAclear transkripsiyon temizleme kitiThermoFisher ScientificAM19084 &°C'de saklanır; C
RNAse parçalayıcı yüzey aktif madde: RnaseZAPSigma-AldrichR2020
E.coli O111: B4 Invivogen'den RT Ultrapure LPS'de C
Yabani tip IKK & beta; plazmidAddgene11103-20 ° C'de saklanır; C
Yabani tip NEMO plazmidAddgene27268-20 ° C'de saklanır; Ç
RT , , RT saklanır , RT , , , saklanır -20 ° C'de saklanır;

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ley, K., Pramod, A. B., Croft, M., Ravichandran, K. S., Ting, J. P. How Mouse Macrophages Sense What Is Going On. Frontiers in Immunology. 7 (204), (2016).
  2. Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biolology. 531, 123-143 (2009).
  3. Guo, X., et al. Transfection reagent Lipofectamine triggers type I interferon signaling activation in macrophages. Immunology and cell biology. 97 (1), 92-96 (2019).
  4. Kariko, K., Weissman, D. Naturally occurring nucleoside modifications suppress the immunostimulatory activity of RNA: implication for therapeutic RNA development. Current Opinion in Drug Discovery and Development. 10 (5), 523-532 (2007).
  5. Van De Parre, T. J., Martinet, W., Schrijvers, D. M., Herman, A. G., De Meyer, G. R. mRNA but not plasmid DNA is efficiently transfected in murine J774A.1 macrophages. Biochemical and biophysical research communications. 327 (1), 356-360 (2005).
  6. Uchida, S., Kataoka, K., Itaka, K. Screening of mRNA Chemical Modification to Maximize Protein Expression with Reduced Immunogenicity. Pharmaceutics. 7 (3), 137-151 (2015).
  7. Kariko, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).
  8. Khantakova, J. N., et al. Transfection of bone marrow derived cells with immunoregulatory proteins. Cytokine. 108, 82-88 (2018).
  9. Franz, K. M., Kagan, J. C. Innate Immune Receptors as Competitive Determinants of Cell Fate. Molecular Cell. 66 (6), 750-760 (2017).
  10. Kaestner, L., Scholz, A., Lipp, P. Conceptual and technical aspects of transfection and gene delivery. Bioorganic & medicinal chemistry letters. 25 (6), 1171-1176 (2015).
  11. Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
  12. Kormann, M. S., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).
  13. Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 23 (2), 165-175 (2005).
  14. Hornung, V., et al. 5'-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I. Science. 314 (5801), 994-997 (2006).
  15. Pichlmair, A., et al. RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5'-phosphates. Science. 314 (5801), 997-1001 (2006).
  16. Herb, M., et al. Mitochondrial reactive oxygen species enable proinflammatory signaling through disulfide linkage of NEMO. Science Signaling. 12 (568), (2019).
  17. Schmidt-Supprian, M., et al. NEMO/IKK gamma-deficient mice model incontinentia pigmenti. Molecular Cell. 5 (6), 981-992 (2000).
  18. Mandal, P. K., Rossi, D. J. Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA. Nature Protocols. 8 (3), 568-582 (2013).
  19. Oh, S., Kessler, J. A. Design, Assembly, Production, and Transfection of Synthetic Modified mRNA. Methods. 133, San Diego, CA. 29-43 (2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Primer Makrofaj TransfeksiyonuKemik li i K kenli MakrofajlarPeritoneal MakrofajlarmRNA Transfeksiyon ProtokolPolyA KuyruklamaAk SitometrisiFloresan MikroskobuAgaroz Jel ElektroforeziProtein Ekspresyon Analizi

İlgili makaleler