Burada sunulan kemirgen gözlere biyolojik uzun süreli teslimat için ölümsüzleştirilmiş hücrelerin mikrokapsülasyonu bir polimer olarak aljinat kullanımı için bir protokoldür.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Fare Gözüne Biyolojik Teslim için Kapsüllü Hücre Teknolojisi
Bu makalede
Özet
Özet
Gözün arka kutbu hastalıkları için geliştirilmekte olan birçok mevcut tedavi biyolojiktir. Bu ilaçların sık sık uygulanması gerekir, genellikle intravitreal enjeksiyonları yoluyla. Tercih edilen biyolojik ifade kapsüllü hücreler yerel protein üretimi ve salınımı için bir araç haline gelmektedir (örneğin, uzun süreli ilaç teslimatyoluyla). Buna ek olarak, kapsülleme sistemleri besin, atık ve terapötik faktörlerin hücre içine ve dışarı difüzyon sağlayan geçirilebilir malzemeler kullanır. Bu konak bağışıklık yanıtı hücreleri maskeleme sırasında oluşur, konak bağışıklık sisteminin baskılanması için ihtiyaç kaçınarak. Bu protokol, mikrokapsüllemede polimer olarak aljinat kullanımını, elektrosprey yöntemi ile birleştiğinde mikrokapsülleme tekniği olarak tanımlar. ARPE-19 hücreleri, kendiliğinden ortaya çıkan insan RPE hücre hattı, yaşam boyu işlevselliği nedeniyle uzun vadeli hücre tedavisi deneylerde kullanılmıştır, ve kapsüllerin kapsülleme ve fare gözlerine teslimi için burada kullanılmaktadır. El yazması hücre mikrokapsülasyonu, kalite kontrolü ve oküler teslimat için adımları özetler.
Giriş
Hücre temelli tedaviler tıpta yaygın olarak uygulanan devrimci biyolojik teknikleri temsil eder. Son zamanlarda, onlar başarıyla nörodejeneratif hastalıkların tedavisinde uygulanmıştır, göz hastalıkları, ve kanser. Hücre tedavileri hücre protezinden ilaç dağıtımına kadar geniş bir alanı kapsamaktadır ve bu protokol ikincisine odaklanır. Biyobozunur aljinat mikrokapsüller (MC) bir dağıtım sistemi olarak etkinliğini göstermiştir, ve yaygın biyomedikal alanda kullanılmaktadır. Aljinat basit jelleşme işlemi, biyobozunurluk, mükemmel biyouyumluluk ve in vivo koşullar altında stabilite nedeniyle mikrokapsülasyon kullanılmıştır1,2,3,4.
Elektrosprey yöntemi, mikrokapsülleme tekniği olarak, aljinat (baz polimer) ve poli-l-ornitin (ikincil kaplama polimeri) kullanılarak peptidve proteinleri kapsüllemek için başarıyla kullanılmıştır. Her iki polimerdoğal olarak bulunur ve biyouyumluluk için kullanılır5,6,7. Ancak, hücre tabanlı tedavilerde ana sorun immünsupresif ilaçların neden olduğu yan etkileri önlemek için konak bağışıklık sisteminin bastırılmasıdır. Aljinat mikrokapsüllerin geçirgenliği hücre kapsülülasyonu için uygun bir özellik olarak kabul edilir, hangi besin difüzyon sağlar, atık, ve hücrelerin içine ve dışında terapötik faktörler in host bağışıklık yanıtı onları maskeleme8,9,10.
Gözde, kapsüllü hücreler retinitis pigmentosa veya yaşa bağlı makula dejenerasyonu tedavisi için biyolojik (yani, büyüme faktörleri11,,12 ve büyüme faktörü antagonistleri13)sürekli teslimat için klinik çalışmalarda kullanılmıştır. Kompleman inhibitörleri14 gibi diğer hedefler de şu anda klinik öncesi ortamlarda araştırılmaktadır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm deneyler, Göz Ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımına İlişkin ARVO Bildirimi uyarınca gerçekleştirildi ve Güney Carolina Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi Tarafından 00399 protokolü altında onaylandı.
1. Hücre Kültürü
- İnsan retinapigment epitel hücreleri oluşturmak (ARPE-19) hücre hattı stably yayınlanan protokollere göre tercih edilen geni ifade14,15.
- Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta (DMEM)%10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenen hücreleri koruyun.
- Hücreleri 37 °C ve %5 CO2'dekuluçkaya yatırın.
- Orta yı 2-3 günde bir değiştirin.
- Standart doku kültürü prosedürleri kullanılarak %70-%80 biraraya geldikten sonra hücreleri geçiş.
2. Hücre Kapsülleme
- Sodyum aljinat %2 w/v'lik son konsantrasyon için deiyonize (DI) su ile karıştırın ve 0,2 m steril şırınga filtresi ile filtrasyon ile arındırın.
- Hücreleri aljinat çözeltisi ile karıştırılarak 10 mM HEPES tamponlu salin çözeltisi (pH = 7.4) ile inceleyerek, santrifüj ederek ve yıkayarak hazırlayın. Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve aljinat çözeltisinde son hücre konsantrasyonu 1 x 106'ya ayarlayın.
NOT: Kapsülleme işlemi steril bir başlık içinde çalıştırılmalıdır. - 3 mL şırınga içine aljinat ve hücre karışımı ~ 300 μL aliquots yük ve bir şırınga pompası takın. Çözelti, 30 G künt uçlu iğneile steril jelling banyosuna pompalanır ve 7 mm'de şırınga ucunun altında steril 50 mL kabına yerleştirilir.
- Jelleme banyosu 100 mM kalsiyum klorür (CaCl2)ve %0,5 w/v poli-L-ornit (FKÖ) içeren 10 mM HEPES tamponlu salin hacmi40 mL içerir. FKÖ, araştırmacının ihtiyaçlarına göre atlanabilen veya değiştirilebilen ikincil bir polimer kaplamadır.
- Gerilimi ve akış hızını ayarlayın ve kapsülleme işlemi sırasında her ikisini de 60 mm/h akış hızında ve 6,0 kV başlangıç voltajında sabit tutun ve ~150 μm mikrokapsül boyutunda üretin.
- Yüksek voltajlı jeneratör iğne ucunun anodu telinin (kırmızı) klibini iğneye bağlayın ve zemin klibini (siyah) jelle banyosuna yarı yarıya batırılmış bakır kabloya bağlayın. Aljinat + hücre karışımı (1 mL) bir toplu kapsüllü hücreleri (yaklaşık 25.000 mikrokapsül) hazırlamak için yaklaşık 30 dakika sürer.
- Hücreleri içeren mikrokapsülleri yıkama solüsyonuyla yıkayın (10 mM HEPES tamponlu tuzlu içeren 1.5 mM CaCl2, pH = 7.4) iki kez. Yıkama için PBS kullanmayın.
- Kapsüllü hücreleri %10 FBS destekli DMEM media ile 37 °C ve %5 CO2'denemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın.
NOT: Kapsülleme proses aletleri Şekil 1'degösterilmiştir.
3. Kapsüllemenin Hücre Canlılığını Etkilemediğinin Teyidi
- Kapsüllü hücreleri 24 saat boyunca ortama kattıktan sonra, boyama için 500 μL (~30 mikrokapsül) küçük bir örnek hazırlayın.
- Mikrokapsülleri yıkama solüsyonu (10 mM HEPES tamponlu tuzlu 1,5 mM CaCl2)kullanarak yıkayın ve canlı/ölü bir asay kiti kullanarak canlı ölü canlılığı için lekeleyin.
- Calcein (asetoksimetil) ve ethidyum homodimer-1'in boyanma karışımını sırasıyla 2 μM ve 4 ΜM'lik son konsantrasyonlarda hazırlayın.
- Kapsüllü hücrelere 2 mL boyama karışımı ekleyin ve oda sıcaklığında karanlıkta 30-45 dakika kuluçka (RT).
- Dikkatli aspirasyon ile, boyama çözeltisi aspire ve yıkama çözeltisi ile mikrokapsül 2x yıkayın. Kapsüllenmiş hücreleri gözlemlemek ve görüntülemek için floresan mikroskop sistemi kullanın.
NOT: Kapsülleme dokümantasyonu Şekil 2'degösterilmiştir.
4. Kapsüllerin Biyolojik Teslim ve Teslim için Uygun Boyut olduğunun teyidi
- Fare gözündeki intravitreal enjeksiyonlar genellikle 2,5 μL Hamilton şırıngayA bağlı 27 G künt uçlu iğne (iç çap 210 μm) ile yapılır.
- 100 ila 200 μm arasında değişen kapsüller oluşturun, serumsuz ortamda seyreltin ve dikkatlice Hamilton şırınga içine çekin. PBS uygun bir araç değildir, aljinit kapsüller PBS çözünür gibi.
- Kapsül içeren 1μL damlaları mikroskop slaytına yavaşça çıkarve dik parlak alan mikroskobu kullanarak bütünlüklerini belirleyin.
- Voltajı ve akış hızını buna göre ayarlayarak kapsül boyutunu (bkz. adım 2.3) ayarlayın. Daha küçük mikrokapsüller gerilimi artırarak ve akış hızını biraz azaltarak doğrusal olmayan bir şekilde üretilmektedir8. Elimizde 150 m çapında kapsüllerin en uygun olduğu kanıtlanmıştır. Kapsül boyutunun ayarlanı da diğer parametreleri değiştirirken aljinat konsantrasyonu sabit tutmaya bağlıdır.
- İstenilen biyolojik salgı miktarını belirlemek için serumiçermeyen ortamda uygun boyutta kapsüllerde ayrı bir hücre kümesi saklayın. Supernatant biyolojik konsantrasyonu belirlemek için hassas ELISA veya batı lekeleme kullanın.
- Terapötik bilinen PK/PD'ye (farmakokinetik/farmakodinamik) dayanarak enjekte edilmesi gereken kapsülmiktarını belirleyin. Elimizde, fare gözü başına 10 kapsül en etkili olduğu kanıtlanmıştır.
5. Fare Vitreus içine Kapsül Teslim
- Bir diseksiyon mikroskop kullanarak intravitreal enjeksiyonları gerçekleştirin. Ameliyat sırasında kullanılan cerrahi kurulum ve malzemeler için Şekil 3'e bakınız. İntravitreous enjeksiyonlar için ayrıntılı bir protokol başka bir yerde bulunabilir16.
- Ksilazin ve ketamin intraperitoneal enjeksiyon (20 mg/kg ve 80 mg/kg) veya özel kurumun Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan diğer tercih edilen anestezikler ile fareleri anestezik. Bir parmak tutam17kullanarak anestezi uygun derinliği ni sağlamak.
- Fare gözbebeklerini fenilefrin HCL (%2.5) ile dilate ve atropin sülfat (%1) vitreus odasının iyi görünürlüğü için izin vermek ve işlem sırasında onları sulu tutmak için gözlere bir yağlayıcı göz jeli uygulamak.
- Kılavuz deliği olarak 26 G iğne ile limbustaki sklerayı delin, 1) iğnenin göz ve masa ile 45° açıda olduğundan emin olun ve 2) eğimli uç, merceğin delinmesini önlemek için yukarı doğru işaret edin.
- Kapsülleri, görsel inceleme altında 45° açıyla Hamilton şırıngasına bağlı 27 G künt uçlu iğne kullanarak dikkatlice enjekte edin ve iğneyle merceğe dokunmaktan kaçının. Lensin yaralanması katarakt oluşumuna yol açacaktır. Kapsüller, kesişme mikroskobu kullanılarak vitreusta görülmelidir(Şekil 4A).
- İğnenin geri çekilmesinden sonra, deksametazon oftalmik antibiyotik merhemine ek olarak enjeksiyon bölgesini neomisin ve polimiksin B sülfatları ile tedavi edin.
- Goniotaire hypromellose demulcent oftalmik solüsyon (%2.5) uygulayın her iki göze korneaların iyileşme döneminde kurumasını önlemek için.
- Fareyi 37°C'de tutulan bir ısıtma yastığına yerleştirin ve tamamen uyanana kadar izleyin.
- Kapsüllü ARPE-19 hücrelerinin başarılı bir enjeksiyon optik koherence tomografi veya diğer yöntemlerle göz görüntüleme enkaz sadece küçük miktarlarda farenin vitreus odasında bozulmamış kapsül varlığını ortaya çıkarmalıdır(Şekil 4B).
- Enjekte edilen fare gözü, ameliyat nedeniyle birkaç gün sonra, şimdi eldeki deneysel paradigma için hazırdır.
NOT: Gözdeki kapsüllerin cerrahi kurulumu ve dokümantasyonu sırasıyla Şekil 3 ve Şekil 4'tegösterilmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
ARPE-19 hücreleri kapsüllerin göze yerleştirilmesi üzerine kapsülleme ve uzun süreli sağkalım için uygun olduğu gösterilmiştir bir spontan ölümsüzleştirilmiş insan RPE hücre hattı vardır. Aljinat kapsülleme araçları Şekil 1'degösterilmiştir. Bu çalışmada aljinat kapsüllerinin kapsüllenmesi üzerine aljinit kapsüllü hücrelerin parlak alan görüntüleme ile doğrulanmış olduğu gösterilmiştir(Şekil 2A
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu hücre kapsülleme tekniği nispeten hızlı ve gerçekleştirmek kolaydır; ancak, doğru downstream sonuçları elde etmek için bazı noktalar akılda tutulmalıdır. Hücreler kapsülleme den önce bir Petri kabında kültür de muhafaza edilmeli ve uygun bir araya tutulmalıdır. Kapsülleme, mümkünse düzenlenmiş hava akışı ile uygun bir havalandırma kaputunda yapılmalıdır. Çok güçlü bir hava akımı kapsül oluşumunu etkileyebilir, özellikle uzun vadeli deneylerde. Steril gereçler ve çözümler kapsül içindeki hücrelerin uzun süreli bakımı i...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları beyan.
Teşekkürler
Çalışma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01EY019320), Gazi İşleri Bakanlığı (RX000444 ve BX003050) ve Güney Carolina SmartState Vakfı tarafından B.R.'ye verilen hibelerle desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 3 mL Şırınga | BD | 309656 | |
| 30 G 1 "Künt iğne | SAI İnfüzyon teknolojisi | B30-100 | |
| Kahverengi alglerden aljinik asit sodyum tuzu | Sigma | A0682 | |
| Atropin Sülfat Oftalmolik çözelti (% 1) | Akorn | NDC 17478-215-15 | öğrenci dilatasyonu için |
| BD 1 mL Şırınga 26 G x 3/8 (0,45 mm x 10 mm) | Becton, Dickinson ve Şirket | DG518105 500029609 REF 309625 | kılavuz deliği oluşturmak için |
| Kalsiyum klorür, Susuz, granül | Sigma | C1016 | |
| GenTeal Gözyaşları | Alcon | NDC 0078-0429-47 | anestezi sırasında gözleri yağlamak için |
| Goniotaire: Hipromelloz (%2,5) Oftalmolik Yatıştırıcı Çözelti (Steril) | Altaire İlaç A.Ş. | Anestezi sırasında gözleri yağlamak için | NDC 59390-182-13 |
| Hamilton İğne / şırınga Ucu: 27 G, Küçük Hub RN NDL, custum uzunluğu (12 mm), nokta stili 3, 6 / PK | Hamilton | 7803-01 | kapsüllerin intravitreal iletimi için |
| Hamilton Şırınga: 2.5 ve mikro; L, Model 62 RN SYR, NDL Ayrı Satılır | Kapsüllerin intravitreal iletimi için | Hamilton | 7632-01 |
| HEPES tamponu, 1 M | Fisher Bioreagents | BP299100 | |
| Yüksek gerilim jeneratörü | ESD EMC Teknolojisi | ES813-D20 | |
| CANLI/ÖLÜ Canlılık/Sitotoksisite Kiti | Thermofisher Scientific | L3224 | |
| L-Ornitin hidroklorür, %99 | Alfa Aesar | A12111 | |
| Neomisin ve Polimiksin B Sülfatlar ve Deksametazon Oftalmolik Merhem | SANDOZ | NDC 61314-631-36 | intravitreal enjeksiyon sonrası enfeksiyonu önlemek için antibiyotik |
| Fenolefrin Hidroklorür Oftalmolik Çözelti (% 2.5) | Akorn | NDC 17478-201-15 | öğrenci dilatasyonu için |
| Sodyum Klorür | Sigma | S-5886 | |
| Steril şırınga filtreler, 0.2 & mu; m | VWR | 28143-312 | |
| Şırınga pompası | GRASEBY | MS16A |
Kaynaklar
- Allen, T. M., Cullis, P. R. Drug delivery systems: entering the mainstream. Science. 303 (5665), 1818-1822 (2004).
- Tonnesen, H. H., Karlsen, J. Alginate in drug delivery systems. Drug Development and Industrial Pharmacy. 28 (6), 621-630 (2002).
- Vilos, C., Velasquez, L. A. Therapeutic strategies based on polymeric microparticles. Journal of Biomedical Biotechnology. 672760, (2012).
- Gasperini, L., Mano, J. F., Reis, R. L. Natural polymers for the microencapsulation of cells. Journal of the Royal Society Interface. 11 (100), 20140817(2014).
- Gasper, D. P. R. Novel strategy to produce a drug delivery system for skin regeneration. Uma nova estratégia para produzir um dispositivo para entrega de fármacos que será usado na regeneração da pele. , (2012).
- Huang, S., Fu, X. Naturally derived materials-based cell and drug delivery systems in skin regeneration. Journal of Controlled Release. 142 (2), 149-159 (2010).
- Nograles, N., Abdullah, S., Shamsudin, M. N., Billa, N., Rosli, R. Formation and characterization of pDNA-loaded alginate microspheres for oral administration in mice. Journal of Bioscience and Bioengineering. 113 (2), 133-140 (2012).
- Moore, K., Amos, J., Davis, J., Gourdie, R., Potts, J. D. Characterization of polymeric microcapsules containing a low molecular weight peptide for controlled release. Microscopy and Microanalysis. 19 (1), 213-226 (2013).
- Xu, Y., Skotak, M., Hanna, M. Electrospray encapsulation of water-soluble protein with polylactide. I. Effects of formulations and process on morphology and particle size. Journal of Microencapsulation. 23 (1), 69-78 (2006).
- Gryshkov, O., et al. Process engineering of high voltage alginate encapsulation of mesenchymal stem cells. Materials Science and Engineering: C. 36, 77-83 (2014).
- Thanos, C. G., et al. Sustained secretion of ciliary neurotrophic factor to the vitreous, using the encapsulated cell therapy-based NT-501 intraocular device. Tissue Engineering. (11-12), 1617-1622 (2004).
- Kauper, K., et al. Two-year intraocular delivery of ciliary neurotrophic factor by encapsulated cell technology implants in patients with chronic retinal degenerative diseases. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (12), 7484-7491 (2012).
- Kauper, K., et al. Long term, sustained intraocular delivery of a VEGF antagonist using encapsulated cell technology implant for the treatment of choroidal neovascular diseases. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, 455(2012).
- Annamalai, B., et al. Encapsulated Cell Technology-Based Delivery of a Complement Inhibitor Reduces Choroidal Neovascularization in a Mouse Model. Translational Visual Science Technology. 7 (2), 3(2018).
- Alge, C. S., et al. Retinal Pigment Epithelium Is Protected Against Apoptosis by αB-Crystallin. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43 (11), 3575-3582 (2002).
- Chiu, K., Chang, R. C., So, K. F. Intravitreous injection for establishing ocular diseases model. Journal of Visualized Experiments. (8), 313(2007).
- Jove Science Education Database. Lab Animal Research. Anesthesia Induction and Maintenance. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Holz, F. G., et al. Efficacy and Safety of Lampalizumab for Geographic Atrophy Due to Age-Related Macular Degeneration: Chroma and Spectri Phase 3 Randomized Clinical Trials. JAMA Ophthalmology. 136 (6), 666-677 (2018).
- Kassa, E., Ciulla, T. A., Hussain, R. M., Dugel, P. U. Complement inhibition as a therapeutic strategy in retinal disorders. Expert Opinion in Biological Therapy. 19 (4), 335-342 (2019).
- Cashman, S. M., Ramo, K., Kumar-Singh, R. A Non Membrane-Targeted Human Soluble CD59 Attenuates Choroidal Neovascularization in a Model of Age Related Macular Degeneration. PLoS ONE. 6 (4), e19078(2011).
- Vincent, L., et al. Generation of combination PDGF / VEGF-antagonist ECT devices. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54, 3290(2013).
- Zhang, K., et al. Ciliary neurotrophic factor delivered by encapsulated cell intraocular implants for treatment of geographic atrophy in age-related macular degeneration. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (15), 6241-6245 (2011).
- Chew, E. Y., et al. Ciliary neurotrophic factor for macular telangiectasia type 2: results from a phase 1 safety trial. American Journal of Ophthalmology. 159 (4), 659-666 (2015).
- Birch, D. G., et al. Randomized trial of ciliary neurotrophic factor delivered by encapsulated cell intraocular implants for retinitis pigmentosa. American Journal of Ophthalmology. 156 (2), 283-292 (2013).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
