Fare Gözüne Biyolojik Teslim için Kapsüllü Hücre Teknolojisi

Hücre temelli tedaviler tıpta yaygın olarak uygulanan devrimci biyolojik teknikleri temsil eder. Son zamanlarda, onlar başarıyla nörodejeneratif hastalıkların tedavisinde uygulanmıştır, göz hastalıkları, ve kanser. Hücre tedavileri hücre protezinden ilaç dağıtımına kadar geniş bir alanı kapsamaktadır ve bu protokol ikincisine odaklanır. Biyobozunur aljinat mikrokapsüller (MC) bir dağıtım sistemi olarak etkinliğini göstermiştir, ve yaygın biyomedikal alanda kullanılmaktadır. Aljinat basit jelleşme işlemi, biyobozunurluk, mükemmel biyouyumluluk ve in vivo koşullar altında stabilite nedeniyle mikrokapsülasyon kullanılmıştır^1,2,3,4.

Elektrosprey yöntemi, mikrokapsülleme tekniği olarak, aljinat (baz polimer) ve poli-l-ornitin (ikincil kaplama polimeri) kullanılarak peptidve proteinleri kapsüllemek için başarıyla kullanılmıştır. Her iki polimerdoğal olarak bulunur ve biyouyumluluk için kullanılır^5,6,7. Ancak, hücre tabanlı tedavilerde ana sorun immünsupresif ilaçların neden olduğu yan etkileri önlemek için konak bağışıklık sisteminin bastırılmasıdır. Aljinat mikrokapsüllerin geçirgenliği hücre kapsülülasyonu için uygun bir özellik olarak kabul edilir, hangi besin difüzyon sağlar, atık, ve hücrelerin içine ve dışında terapötik faktörler in host bağışıklık yanıtı onları maskeleme^8,9,10.

Gözde, kapsüllü hücreler retinitis pigmentosa veya yaşa bağlı makula dejenerasyonu tedavisi için biyolojik (yani, büyüme faktörleri^11,,12 ve büyüme faktörü antagonistleri¹³⁾sürekli teslimat için klinik çalışmalarda kullanılmıştır. Kompleman inhibitörleri¹⁴ gibi diğer hedefler de şu anda klinik öncesi ortamlarda araştırılmaktadır.

Tüm deneyler, Göz Ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımına İlişkin ARVO Bildirimi uyarınca gerçekleştirildi ve Güney Carolina Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi Tarafından 00399 protokolü altında onaylandı.

1. Hücre Kültürü

1. İnsan retinapigment epitel hücreleri oluşturmak (ARPE-19) hücre hattı stably yayınlanan protokollere göre tercih edilen geni ifade^14,15.
2. Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta (DMEM)%10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenen hücreleri koruyun.
3. Hücreleri 37 °C ve %5 CO_2'dekuluçkaya yatırın.
4. Orta yı 2-3 günde bir değiştirin.
5. Standart doku kültürü prosedürleri kullanılarak %70-%80 biraraya geldikten sonra hücreleri geçiş.

2. Hücre Kapsülleme

1. Sodyum aljinat %2 w/v'lik son konsantrasyon için deiyonize (DI) su ile karıştırın ve 0,2 m steril şırınga filtresi ile filtrasyon ile arındırın.
2. Hücreleri aljinat çözeltisi ile karıştırılarak 10 mM HEPES tamponlu salin çözeltisi (pH = 7.4) ile inceleyerek, santrifüj ederek ve yıkayarak hazırlayın. Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve aljinat çözeltisinde son hücre konsantrasyonu 1 x 10^6'ya ayarlayın.
   NOT: Kapsülleme işlemi steril bir başlık içinde çalıştırılmalıdır.
3. 3 mL şırınga içine aljinat ve hücre karışımı ~ 300 μL aliquots yük ve bir şırınga pompası takın. Çözelti, 30 G künt uçlu iğneile steril jelling banyosuna pompalanır ve 7 mm'de şırınga ucunun altında steril 50 mL kabına yerleştirilir.
4. Jelleme banyosu 100 mM kalsiyum klorür (CaCl₂₎ve %0,5 w/v poli-L-ornit (FKÖ) içeren 10 mM HEPES tamponlu salin hacmi40 mL içerir. FKÖ, araştırmacının ihtiyaçlarına göre atlanabilen veya değiştirilebilen ikincil bir polimer kaplamadır.
5. Gerilimi ve akış hızını ayarlayın ve kapsülleme işlemi sırasında her ikisini de 60 mm/h akış hızında ve 6,0 kV başlangıç voltajında sabit tutun ve ~150 μm mikrokapsül boyutunda üretin.
6. Yüksek voltajlı jeneratör iğne ucunun anodu telinin (kırmızı) klibini iğneye bağlayın ve zemin klibini (siyah) jelle banyosuna yarı yarıya batırılmış bakır kabloya bağlayın. Aljinat + hücre karışımı (1 mL) bir toplu kapsüllü hücreleri (yaklaşık 25.000 mikrokapsül) hazırlamak için yaklaşık 30 dakika sürer.
7. Hücreleri içeren mikrokapsülleri yıkama solüsyonuyla yıkayın (10 mM HEPES tamponlu tuzlu içeren 1.5 mM CaCl₂, pH = 7.4) iki kez. Yıkama için PBS kullanmayın.
8. Kapsüllü hücreleri %10 FBS destekli DMEM media ile 37 °C ve %5 CO_2'denemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın.
   NOT: Kapsülleme proses aletleri Şekil 1'degösterilmiştir.

3. Kapsüllemenin Hücre Canlılığını Etkilemediğinin Teyidi

1. Kapsüllü hücreleri 24 saat boyunca ortama kattıktan sonra, boyama için 500 μL (~30 mikrokapsül) küçük bir örnek hazırlayın.
2. Mikrokapsülleri yıkama solüsyonu (10 mM HEPES tamponlu tuzlu 1,5 mM CaCl₂₎kullanarak yıkayın ve canlı/ölü bir asay kiti kullanarak canlı ölü canlılığı için lekeleyin.
3. Calcein (asetoksimetil) ve ethidyum homodimer-1'in boyanma karışımını sırasıyla 2 μM ve 4 ΜM'lik son konsantrasyonlarda hazırlayın.
4. Kapsüllü hücrelere 2 mL boyama karışımı ekleyin ve oda sıcaklığında karanlıkta 30-45 dakika kuluçka (RT).
5. Dikkatli aspirasyon ile, boyama çözeltisi aspire ve yıkama çözeltisi ile mikrokapsül 2x yıkayın. Kapsüllenmiş hücreleri gözlemlemek ve görüntülemek için floresan mikroskop sistemi kullanın.
   NOT: Kapsülleme dokümantasyonu Şekil 2'degösterilmiştir.

4. Kapsüllerin Biyolojik Teslim ve Teslim için Uygun Boyut olduğunun teyidi

1. Fare gözündeki intravitreal enjeksiyonlar genellikle 2,5 μL Hamilton şırıngayA bağlı 27 G künt uçlu iğne (iç çap 210 μm) ile yapılır.
2. 100 ila 200 μm arasında değişen kapsüller oluşturun, serumsuz ortamda seyreltin ve dikkatlice Hamilton şırınga içine çekin. PBS uygun bir araç değildir, aljinit kapsüller PBS çözünür gibi.
3. Kapsül içeren 1μL damlaları mikroskop slaytına yavaşça çıkarve dik parlak alan mikroskobu kullanarak bütünlüklerini belirleyin.
4. Voltajı ve akış hızını buna göre ayarlayarak kapsül boyutunu (bkz. adım 2.3) ayarlayın. Daha küçük mikrokapsüller gerilimi artırarak ve akış hızını biraz azaltarak doğrusal olmayan bir şekilde üretilmektedir^8. Elimizde 150 m çapında kapsüllerin en uygun olduğu kanıtlanmıştır. Kapsül boyutunun ayarlanı da diğer parametreleri değiştirirken aljinat konsantrasyonu sabit tutmaya bağlıdır.
5. İstenilen biyolojik salgı miktarını belirlemek için serumiçermeyen ortamda uygun boyutta kapsüllerde ayrı bir hücre kümesi saklayın. Supernatant biyolojik konsantrasyonu belirlemek için hassas ELISA veya batı lekeleme kullanın.
6. Terapötik bilinen PK/PD'ye (farmakokinetik/farmakodinamik) dayanarak enjekte edilmesi gereken kapsülmiktarını belirleyin. Elimizde, fare gözü başına 10 kapsül en etkili olduğu kanıtlanmıştır.

5. Fare Vitreus içine Kapsül Teslim

1. Bir diseksiyon mikroskop kullanarak intravitreal enjeksiyonları gerçekleştirin. Ameliyat sırasında kullanılan cerrahi kurulum ve malzemeler için Şekil 3'e bakınız. İntravitreous enjeksiyonlar için ayrıntılı bir protokol başka bir yerde bulunabilir¹⁶.
2. Ksilazin ve ketamin intraperitoneal enjeksiyon (20 mg/kg ve 80 mg/kg) veya özel kurumun Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan diğer tercih edilen anestezikler ile fareleri anestezik. Bir parmak tutam¹⁷kullanarak anestezi uygun derinliği ni sağlamak.
3. Fare gözbebeklerini fenilefrin HCL (%2.5) ile dilate ve atropin sülfat (%1) vitreus odasının iyi görünürlüğü için izin vermek ve işlem sırasında onları sulu tutmak için gözlere bir yağlayıcı göz jeli uygulamak.
4. Kılavuz deliği olarak 26 G iğne ile limbustaki sklerayı delin, 1) iğnenin göz ve masa ile 45° açıda olduğundan emin olun ve 2) eğimli uç, merceğin delinmesini önlemek için yukarı doğru işaret edin.
5. Kapsülleri, görsel inceleme altında 45° açıyla Hamilton şırıngasına bağlı 27 G künt uçlu iğne kullanarak dikkatlice enjekte edin ve iğneyle merceğe dokunmaktan kaçının. Lensin yaralanması katarakt oluşumuna yol açacaktır. Kapsüller, kesişme mikroskobu kullanılarak vitreusta görülmelidir(Şekil 4A).
6. İğnenin geri çekilmesinden sonra, deksametazon oftalmik antibiyotik merhemine ek olarak enjeksiyon bölgesini neomisin ve polimiksin B sülfatları ile tedavi edin.
7. Goniotaire hypromellose demulcent oftalmik solüsyon (%2.5) uygulayın her iki göze korneaların iyileşme döneminde kurumasını önlemek için.
8. Fareyi 37°C'de tutulan bir ısıtma yastığına yerleştirin ve tamamen uyanana kadar izleyin.
9. Kapsüllü ARPE-19 hücrelerinin başarılı bir enjeksiyon optik koherence tomografi veya diğer yöntemlerle göz görüntüleme enkaz sadece küçük miktarlarda farenin vitreus odasında bozulmamış kapsül varlığını ortaya çıkarmalıdır(Şekil 4B).
10. Enjekte edilen fare gözü, ameliyat nedeniyle birkaç gün sonra, şimdi eldeki deneysel paradigma için hazırdır.
    NOT: Gözdeki kapsüllerin cerrahi kurulumu ve dokümantasyonu sırasıyla Şekil 3 ve Şekil 4'tegösterilmiştir.

ARPE-19 hücreleri kapsüllerin göze yerleştirilmesi üzerine kapsülleme ve uzun süreli sağkalım için uygun olduğu gösterilmiştir bir spontan ölümsüzleştirilmiş insan RPE hücre hattı vardır. Aljinat kapsülleme araçları Şekil 1'degösterilmiştir. Bu çalışmada aljinat kapsüllerinin kapsüllenmesi üzerine aljinit kapsüllü hücrelerin parlak alan görüntüleme ile doğrulanmış olduğu gösterilmiştir(Şekil 2A

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları beyan.