Biz asetaminofen (APAP) bağırsak ve karaciğer organoidleri ile bir mikrofizyolojik sistem (MPS) maruz. Bu makalede, MPS'de organoid üretim yöntemleri ve APAP farmakokinetik ve toksikolojik özellik değerlendirmeleri açıklanmaktadır. Ayrıca sonuçları doğrulamak için gerekli doku işlevselliği analizleri açıklar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İlaç Farmakokinetik ve Toksikolojik Değerlendirme için Bir Bağırsak/Karaciğer Mikrofizyolojik Sistemi
Bu makalede
Özet
Özet
Yakın zamanda tanıtılan mikrofizyolojik sistemlerin (MPS) insan organoidlerini yetiştiren, genetik olarak insan oldukları ve dokular arasındaki etkileşimi yeniden özetledikleri için ilaç geliştirme sürecinin klinik öncesi test aşamasında hayvanlardan daha iyi performans göstermesi beklenmektedir. Bu çalışmada, insan bağırsak bariyeri (Caco-2 ve HT-29 hücrelerinin ortak kültürü ile taklit) ve karaciğer eşdeğeri (farklılaştırılmış HepaRG hücreleri ve insan hepatik stellat hücrelerinden oluşan küresel ler tarafından taklit edilmiştir) bazı asetaminofen (APAP) farmakinetik (PK) ve toksik özellikleri değerlendirmek için iki organlı çip (2-OC) mikroakışkan cihaza entegre edilmiştir. MPS üç derlemeleri vardı: Bağırsak sadece 2-OC, Karaciğer sadece 2-OC, ve Bağırsak / Karaciğer 2-OC aynı ortam her iki organoidperile. PK değerlendirmeleri için, apap'ı bağırsak bariyerinin üzerinden (sözlü rotayı taklit) veya medyada (intravenöz rotayı taklit ederek) uyguladıktan sonra, amedia'ya sırasıyla 12 μM ve 2 μM dozladık. Ortam örnekleri ters fazlı yüksek basınçlı sıvı kromatografi (HPLC) ile analiz edildi. Organoidler gen ekspresyonu, TEER değerleri, protein ekspresyonu ve aktivitesi için analiz edildi ve daha sonra toplandı, düzeltildi ve bir dizi morfolojik değerlendirmeye sunuldu. MTT tekniği organoid canlılığı değerlendirmede iyi performans gösterdi, ancak yüksek içerik analizleri (HCA) APAP tedavisine yanıt olarak çok erken toksik olayları tespit edebildi. Medya akışının APAP emilimini önemli ölçüde etkilemediğini, ancak karaciğereşdeğerinin işlevselliğini önemli ölçüde iyileştirdiğini doğruladık. APAP insan bağırsak emilimi ve hepatik metabolizma MPS taklit edilebilir. MPS verileri ile silico modelleme arasındaki ilişki, in vitro yöntemlerin öngörülebilirliğini artırmak ve farmakokinetik ve toksikolojik çalışmalarda hayvan modellerinden daha iyi doğruluk sağlamak için büyük bir potansiyele sahiptir.
Giriş
Genomik ve proteomik farklılıklar nedeniyle, hayvan modelleri çeşitli insan sonuçları için sınırlı tahmin değerine sahiptir. Ayrıca, onlar zaman alıcı, pahalı ve etik şüpheli1. MPS, tahmin gücünü artırmayı ve klinik öncesi testler ile harcanan maliyetleri ve zamanı azaltmayı amaçlayan nispeten yeni bir teknolojidir. Organoid-organoid iletişimi teşvik eden medya akışı altında organoidler (organların yapay mimetik fonksiyonel birimleri) yetiştiren mikroakışkan cihazlardır. İnsan hücrelerinden yapılan organoidler çeviri alakaartış 2,3,4. MPS'nin hayvan te....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. 2-OC'de ekim için doku eşdeğerlerinin üretimi
- İnce bağırsak bariyereşdeğerüretimi
- Bağırsak eşdeğer imasını kullanarak Caco-2 ve HT-29 hücrelerini koruyun: DMEM %10 FBS, %1 penisilin ve streptomisin ve bu el yazmasında "DMEM S" olarak adlandırılan esansiyel olmayan amino asitler ile desteklenmiştir.
- Ortayı çıkarın, 1x DPBS ile iki kez yıkayın ve hücre kültürü şişelerinde yetiştirilen Caco-2 hücrelerini ayırmak için %0,25 Tripsin/EDTA'dan 8 mL ekleyin (175 cm2). 37 °C'de 5 dakika kuluçkaya yatırın ve en az çift hacimli tripsin inhibitörü ekleyerek reaksiyonu durdurun. HT-29 hücreleri için aynı işlemi uygulayın, bu hücrelerin da....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
2-OC MPS PK APAP testleri gerçekleştirmek için, ilk adım insan bağırsağı ve karaciğer eşdeğerleri (organoidler) üretmektir. PK APAP tkalasına başlamadan önce 2-OC mikroakışkan cihaza(Şekil 1A) 24 saat entegre edilmiştir. Ertesi gün ortam değiştirilir ve model APAP'a maruz kalır. Şekil 1, 2-OC cihazının içine yerleştirilen bağırsak ve karaciğer eşdeğerlerini(Şekil 1B)ve APAP PK deney zaman dilimini(Şekil 1C)
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Araştırmacı yeni ilaçların farmakolojik özelliklerinin doğru ve güvenilir bir şekilde değerlendirilmesi, aşağıdaki geliştirme adımlarında riski azaltmak için kritik öneme sahiptir. MPS, tahmin gücünü artırmayı ve klinik öncesi testlerle harcanan maliyetleri ve zamanı azaltmayı amaçlayan nispeten yeni bir teknolojidir. Grubumuz çoğunlukla kurşun optimizasyonu için gerekli olan farmakokinetik ve toksikolojik özelliklerin değerlendirilmesinde ilerlemektedir. İki odası olan ve iki organoidin entegrasyonuna olanak sağlayan 2-.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Dr. Christie Guguen-Guillouzo, Unit 522 INSERM'den Dr. Philippe Gripon ve Ünite 271 INSERM'den Dr. Christian Trepo'ya Biyolojik Materyalin (Hepa RG hücreleri) kullanımı ve akademik araştırmayapmak için bize sunulması için teşekkür ederiz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1x DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14190235 | Kalsiyum yok, magnezyum yok |
| 2-OC | TissUse GmbH | İki organlı çip | |
| 384 kuyulu Küresel Mikroplaka | Corning | 3830 | Siyah/Şeffaf, Yuvarlak Altlı, Ultra Düşük Ataşman |
| %4 Paraformaldehit | Asetaminofen hücresini sabitlemek için kullanın | ||
| Sigma Aldrich | A7085 | MPS tahlilleri için kullanın | |
| Asetonitril | Tedia | HPLC | |
| Alexa Fluor 647 phalloidin | Thermo Fisher Bilimsel | konfokal deney | |
| Amonyum asetat | Sigma Aldrich | HPLC gerçekleştirmek için kullanılır | |
| Caco-2 hücreleri | Sigma Aldrich | 86010202 | |
| Kakodilat tamponu | |||
| Hücre kültürü şişeleri | Sarstedt | ||
| Konfokal Floresan mikroskobu | Leica | DMI6000 | |
| Kriyostat | Leica | CM1950 | |
| DMEM yüksek glikoz | Thermo Fisher Scientific | 12800017 | Takviyeleri ekleyin:% 10 fetal sığır serumu, mL penisilin başına 100 birim, 100 ve mikro; g/mL streptomisin ve %1 esansiyel olmayan amino asitler |
| DMSO | Sigma Aldrich | D4540 | HepaRG ortamına %2 ekleyin |
| Etanol | Sentezi Fetal | ||
| Sığır Serumu | Thermo Fisher Bilimsel | 12657029 | |
| Donma ortamı OCT | Tissue-Tek | Doku-Tek® O.C.T. &ticaret; Bileşik, suda çözünür glikoller ve reçinelerin bir formülasyonudur ve -10 ° C sıcaklıklarda kriyostat kesitleme için uygun bir numune matrisi sağlar; C ve altı. | |
| Hematoksilen & Eosin | |||
| HepaRG hücreleri | Biopredic International | HPR101 | Farklılaşmamış hücreler |
| HHSTeC | ScienCell Araştırma Laboratuvarları | 5300 | Hücreler ve tüm kültür takviyeleri |
| Hoechst 33342 | HCA deneyleri | ||
| HT-29 hücreleri | Sigma Aldrich | 85061109 | |
| İnsan İnsülini | İnvitrojeni - Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Hidrokortizon | Sigma Aldrich | H0888 | |
| İzopropanol | Merck | 278475 | |
| Karnovsky' s fiksatif | |||
| L-glutamin | Thermo Fisher Scientific | A2916801 | |
| Luna C18 koruma sütunu SS | Phenomenex | HPLC | |
| Mikroskobu | Leica | DMi4000 | |
| Mikrotom | Leica | RM2245 | |
| Millicell 0.4 & mikro; m gözenek boyutu ekler | Merck | PIHP01250 | |
| Millicell ERS-2 metre | Merck | MERS00002 | TEER ölçümü için kullanılır |
| MitoTracker Deep Red | HCA deneyleri | ||
| MTT | Thermo Fisher Scientific | M6494 | |
| MX3000P sistemi | Agilent Technologies | ||
| Neubauer odası | Hücre sayma | ||
| Operetta Yüksek İçerikli Görüntüleme Sistemi | Perkin Elmer | ||
| Luciferin-IPA Promega Cat ile HCA P450-Glo CYP3A4 Testi | .# V9001 | ||
| Penisilin / Streptomisin | Thermo Fisher Bilimsel | 15070063 | Hücre kültürü |
| Permount | Thermo Fisher Bilimsel | Histoloji | |
| Primerleri | RT-qPCR | ||
| PVDF membran | BioRad | ||
| PVDF Şırınga filtresi | 0.22 μ m gözenek boyutu | ||
| Ters fazlı Luna C18 sütunu | Phenomenex | HPLC | |
| Çalkalayıcı (IKA VXR Basic Vibrax) | kullanılırIKA Works GmbH & Co | 2819000 | MTT testini iyileştirmek için sferoidler için kullanılır |
| Yıldız Hücre Ortamı (STeC CM) | ScienCell | 5301 | STeC CM takviyeleri ekleyin |
| SuperScriptIITM Ters Transkriptaz | Thermo Fisher Scientific | ||
| SYBR Yeşil PCR Master Karışımı | Thermo Fisher Scientific | ||
| TRizol TM reaktifi | Thermo Fisher Scientific | Trizol, fenol ve guanidin izotiyosiyanatın monofazik bir çözeltisidir. | |
| Tripsin / EDTA çözeltisi | Thermo Fisher Scientific | R001100 | |
| Ultra düşük bağlantılı plakalar | Corning | CLS3471-24EA | 6 kuyulu |
| Vectashield plus DAPI montaj ortamı | |||
| Beyaz Opak 96 kuyulu Mikroplaka | PerkinHelmer | ||
| Geniş delikli uçlar | |||
| Williams E | Pan Biotech | P04-29510 | Takviye ekleyin:% 10 fetal sığır serumu, 2 mM L-glutamin, ml penisilin başına 100 birim, 100 ve mikro; g / mL streptomisin ve 5 &mikro; g/mL insan insülini |
Kaynaklar
- Zhang, D., Luo, G., Ding, X., Lu, C. Preclinical experimental models of drug metabolism and disposition in drug discovery and development. Acta Pharmaceutica Sinica B. 2 (6), 549-561 (2012).
- Hynds, R. E., Giangreco, A.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
