Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İlaç Farmakokinetik ve Toksikolojik Değerlendirme için Bir Bağırsak/Karaciğer Mikrofizyolojik Sistemi

7.7K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/60184

⸱

3 Aralık 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Brazilian Biosciences National Laboratory (LNBio), Brazilian Center for Research in Energy and Materials (CNPEM), 2Brazilian Synchrotron Light Laboratory (LNLS), Brazilian Center for Research in Energy and Materials (CNPEM), 3Grupo Boticário, 4Institute of Biology, University of Campinas

Bu makalede

Özet

Biz asetaminofen (APAP) bağırsak ve karaciğer organoidleri ile bir mikrofizyolojik sistem (MPS) maruz. Bu makalede, MPS'de organoid üretim yöntemleri ve APAP farmakokinetik ve toksikolojik özellik değerlendirmeleri açıklanmaktadır. Ayrıca sonuçları doğrulamak için gerekli doku işlevselliği analizleri açıklar.

Özet

Yakın zamanda tanıtılan mikrofizyolojik sistemlerin (MPS) insan organoidlerini yetiştiren, genetik olarak insan oldukları ve dokular arasındaki etkileşimi yeniden özetledikleri için ilaç geliştirme sürecinin klinik öncesi test aşamasında hayvanlardan daha iyi performans göstermesi beklenmektedir. Bu çalışmada, insan bağırsak bariyeri (Caco-2 ve HT-29 hücrelerinin ortak kültürü ile taklit) ve karaciğer eşdeğeri (farklılaştırılmış HepaRG hücreleri ve insan hepatik stellat hücrelerinden oluşan küresel ler tarafından taklit edilmiştir) bazı asetaminofen (APAP) farmakinetik (PK) ve toksik özellikleri değerlendirmek için iki organlı çip (2-OC) mikroakışkan cihaza entegre edilmiştir. MPS üç derlemeleri vardı: Bağırsak sadece 2-OC, Karaciğer sadece 2-OC, ve Bağırsak / Karaciğer 2-OC aynı ortam her iki organoidperile. PK değerlendirmeleri için, apap'ı bağırsak bariyerinin üzerinden (sözlü rotayı taklit) veya medyada (intravenöz rotayı taklit ederek) uyguladıktan sonra, amedia'ya sırasıyla 12 μM ve 2 μM dozladık. Ortam örnekleri ters fazlı yüksek basınçlı sıvı kromatografi (HPLC) ile analiz edildi. Organoidler gen ekspresyonu, TEER değerleri, protein ekspresyonu ve aktivitesi için analiz edildi ve daha sonra toplandı, düzeltildi ve bir dizi morfolojik değerlendirmeye sunuldu. MTT tekniği organoid canlılığı değerlendirmede iyi performans gösterdi, ancak yüksek içerik analizleri (HCA) APAP tedavisine yanıt olarak çok erken toksik olayları tespit edebildi. Medya akışının APAP emilimini önemli ölçüde etkilemediğini, ancak karaciğereşdeğerinin işlevselliğini önemli ölçüde iyileştirdiğini doğruladık. APAP insan bağırsak emilimi ve hepatik metabolizma MPS taklit edilebilir. MPS verileri ile silico modelleme arasındaki ilişki, in vitro yöntemlerin öngörülebilirliğini artırmak ve farmakokinetik ve toksikolojik çalışmalarda hayvan modellerinden daha iyi doğruluk sağlamak için büyük bir potansiyele sahiptir.

Giriş

Genomik ve proteomik farklılıklar nedeniyle, hayvan modelleri çeşitli insan sonuçları için sınırlı tahmin değerine sahiptir. Ayrıca, onlar zaman alıcı, pahalı ve etik şüpheli1. MPS, tahmin gücünü artırmayı ve klinik öncesi testler ile harcanan maliyetleri ve zamanı azaltmayı amaçlayan nispeten yeni bir teknolojidir. Organoid-organoid iletişimi teşvik eden medya akışı altında organoidler (organların yapay mimetik fonksiyonel birimleri) yetiştiren mikroakışkan cihazlardır. İnsan hücrelerinden yapılan organoidler çeviri alakaartış 2,3,4. MPS'nin hayvan testlerinden daha iyi performans göstermesi beklenmektedir çünkü genetik olarak insandırlar ve dokular arasındaki etkileşimi özetlerler. Tam olarak işlevsel olduğunda, MPS daha anlamlı sonuçlar sağlayacaktır, daha yüksek hızda ve daha düşük maliyetler ve riskler4. Birçok grup çeşitli amaçlar için MPS geliştiriyor, özellikle hastalığın etkinliğini test etmek için hastalık modelleri.

Maruz kalma düzeyi ilaç etkinliği ve toksisite değerlendirmek için en kritik parametrelerden biridir5,6,7,8,9,10,11,12. MPS sistemik maruziyet taklit organoid entegrasyonu sağlar ve geleneksel 2D insan doku kültüründen daha iyi performans bekleniyor. Bu teknoloji önemli ölçüde bileşik bağırsak emilimi ve karaciğer metabolizması tahmin artırabilir4.

Bağırsak ve karaciğer insan eşdeğer modeli entegre bir MPS iyi bir başlangıç noktasıdır, ilaç biyoyararlanım ve sistemik maruz kalma bu iki organın merkezi rolü göz önüne alındığında13,14,15. APAP onun metaboliti karaciğer tarafından ağırlıklı olarak yapılır çünkü bir MPS okumak için cazip bir ilaçtır16,17.

2-OC iki farklı insan eşdeğer doku / organoidler mikrokanallar16ile birbirine kültür için uygun iki odalı mikroakışkan cihazdır. Bir ilacın in vitro insan oral/intravenöz yönetimini taklit etmek ve bağırsak ve karaciğer eşdeğerleri arasındaki çapraz konuşmanın APAP farmakokinetiği üzerine etkilerini değerlendirmek için, organoidlerin işlevselliği ve canlılığının yanı sıra, üç farklı MPS derlemesi gerçekleştirildi: (1) 2-OC cihazına entegre edilmiş Caco-2 + HT-29 hücre koculture içeren bir kültür eklemesine dayalı bir bağırsak eşdeğerinden oluşan bir "Bağırsak 2-OC MPS"; (2) 2-OC cihazına entegre edilmiş HepaRG + HHSteC (İnsan Hepatik Stellat Hücreleri) içeren karaciğer küresellerinden oluşan bir "Karaciğer 2-OC MPS"; ve (3) bir cihaz bölmesinde bağırsak eşdeğeri oluşan bir "Bağırsak / Karaciğer 2-OC MPS" mikroakışkan kanallar aracılığıyla medya akışı ile diğer karaciğer eşdeğeri ile iletişim.

Tüm tahliller statik altında yapıldı (hiçbir akış) ve dinamik (akış ile) mekanik uyaranların etkisi nedeniyle (sıkıştırma, germe, ve kesme) hücre canlılığı ve işlevleri18,19,20. Bu makalede, insan bağırsağı ve karaciğer eşdeğeri modelleri içeren 2-OC MPS'de APAP oral/intravenöz uygulama öykünme protokolü ve ilgili emilim/metabolizma ve toksikolojik analizler açıklanmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. 2-OC'de ekim için doku eşdeğerlerinin üretimi

  1. İnce bağırsak bariyereşdeğerüretimi
    1. Bağırsak eşdeğer imasını kullanarak Caco-2 ve HT-29 hücrelerini koruyun: DMEM %10 FBS, %1 penisilin ve streptomisin ve bu el yazmasında "DMEM S" olarak adlandırılan esansiyel olmayan amino asitler ile desteklenmiştir.
    2. Ortayı çıkarın, 1x DPBS ile iki kez yıkayın ve hücre kültürü şişelerinde yetiştirilen Caco-2 hücrelerini ayırmak için %0,25 Tripsin/EDTA'dan 8 mL ekleyin (175 cm2). 37 °C'de 5 dakika kuluçkaya yatırın ve en az çift hacimli tripsin inhibitörü ekleyerek reaksiyonu durdurun. HT-29 hücreleri için aynı işlemi uygulayın, bu hücrelerin daha küçük bir miktar gerekli olduğundan ve daha küçük şişelerde muhafaza edildiğiiçin reaktif hacimlerini ayarlayın (75 cm2).
    3. 5 dk için 250 x g santrifüj, her iki tüpten supernatant çıkarın ve DMEM S. Count hücrelerinin 10 mL hücre pelet leri yeniden askıya, bir hücre canlılığı% 80'den daha yüksek güvence. Daha önce basolateral tarafta (insan kan dolaşımını temsil eden) kuyu başına 400 μL DMEM S ile doldurulmuş 24 kuyulu bir plakaya hücre kültürünü entegre edin.
    4. Co-9:121oranında Caco-2 ve HT-29 hücreleri yetiştirmek . 2.25 x 105 Caco-2 ve 2.5 x 104 HT-29 hücrelerini dmem S.'nin 200 μL'lik son hacminde her bağırsağa eşdeğer kullanın. Dikkatlice karıştırın.
    5. Pipet 200 μL hücre çözeltisi her kesici tarafına (insan bağırsak lümeni tarafını temsil eder), kesici uç başına 250.000 hücre tohumlama. Üç hafta22için ekler hücreleri yetiştirmek . Orta yı haftada en az üç kez değiştirin, steril pasteur pipetiyle hem apikal hem de bazolateral kenarlardan aspire edin, bozulmamış hücre bariyerine zarar vermemeye özen.
      NOT: Hücre bariyerine dokunmamak için aspirasyona devam edin (hücre ucunun plastik kenarındaki Pasteur pipetini destekleyerek aspire edin).
    6. Üreticinin talimatlarına göre, her üç günde bir23voltmetre kullanarak TEER (transepitelyal elektrik direnci) ölçerek sıkı monolayer oluşumunu kontrol edin.
      1. Hücre olmadan, aynı hücre ortası ve aynı hücre plakası ile bir hücre kültürü eklemek boyunca direncini ölçerek, boş gerçekleştirin.
      2. Doku eşdeğeri dirençboş direnci çıkararak doku direncini hesaplayın ve filtre membranının etkili yüzey alanı (0.6 cm2)ile çarpın. İyi bir bağırsak bariyerdirenci 150 ila 400 Ω cm2arasındadır.
        NOT: 21 gün sonra hücreler tam olarak ayırt edilmeli ve bağırsak bariyeri oluşmalıdır, böylece bağırsak eşdeğerleri MPS'ye entegre edilmeye hazırdır.
  2. Karaciğer eşdeğerleri üretimi
    1. William'ın Orta E%10 fetal sığır serumu, 2 mM L-glutamin, 100 adet/mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin, 5 g/mL insan insülini ve 5 x 10-5 M hidrokortizon ile desteklenen ve bu el yazmasında "Williams E S" olarak adlandırılan karaciğer eşdeğer imasını kullanan HepaRG hücrelerini koruyun. HepaRG ortamını 2-3 günde bir yenileyin ve hepatosit ve kolanjiyositlerde farklılaşmayı başlatmak için iki hafta hücre kültürünü koruyun.
    2. İlk iki hafta sonra, hücre farklılaşması24,25tamamlamak için ek bir iki hafta boyunca HepaRG orta% 2 DMSO ekleyin. Stellate Cell Media 'da (SteC CM) POLI-L-lizin kaplı hücre kültürü şişelerini kullanarak, her iki veya üç günde bir ortam değiştirerek HHSTeC'i büyütün.
    3. Hücre kültürü şişelerinde yetişen HepaRG hücrelerini ayrıştırmak için ortayı çıkarın, 1x DPBS ile iki kez yıkayın ve 8 mL %0,05 Tripsin/EDTA ekleyin (175 cm2). 37 °C'de 5 ila 10 dakika kuluçkaya yatırın ve tripsin inhibitörü hacminin en az iki katını ekleyerek reaksiyonu durdurun. Bu hücrelerin daha küçük bir miktar gerekli ve daha küçük şişelerde muhafaza edilebilir beri reaktif hacmi adapte, HHSTeC için aynı gerçekleştirin (75 cm2).
    4. 5 dk için 250 x g hem santrifüj, supernatant kaldırmak ve Williams E S orta hücre pelet resuspend. Hücreleri sayarak hücrenin canlılığını %80'in üzerinde sağlar.
    5. HepaRG ve HHSTeC hücrelerini 24:1 oranında birleştiren karaciğer küresellerini sırasıyla Williams E S orta16'daüretin. 4.8 x 104 diferansiye HepaRG ve 0.2 x 104 HHSTeC ekleyin, 50.000 hücreden oluşan her karaciğer küreseloidini 80°L hacimde oluşturun. Dikkatlice karıştırın.
    6. Çok kanallı bir pipet kullanarak, yuvarlak dip geometrisine sahip 384 küresel mikroplakanın her kuyununda kombine hücre havuzunun 80 μL'sini dağıtın.
      NOT: Dört gün sonra yaklaşık 300 μm'lik küresel ler oluşur.
    7. Geniş delikli ipuçları kullanarak, gerekli "bire bir" sayma sağlayan ultra-düşük bağlı 6 iyi plakalar, karaciğer sferoidleri aktarın.

2. Bağırsak ve karaciğer eşdeğerlerinin 2-OC MPS ile entegrasyonu

  1. Emilim için bağırsak 2-OC MPS montajı
    1. Pipet 500 μL DMEM S 2-OC ve 300 μL daha büyük bölmesi içine küçük bir. 24 kuyu plakasında ki her bağırsak bariyerinin eşdeğeri olan bazolateral ve apikal ortamı aspire edin. Steril çöçler kullanarak, 2-OC devrebaşına bir kesici uç, özellikle büyük bölmeye entegre edin. Apical tarafında bağırsak orta 200 μL uygulayın.
      NOT: Organoidleri MPS'ye entegre ederken kabarcıkoluşumundan kaçının.
    2. MPS'yi basınçlı hava beslemesine bağlanması gereken kontrol ünitesine bağlayın. Parametreleri ayarlayın: yaklaşık 300 bar ± basınç ve 0,3 Hz bir pompalama frekansı. Test maddesi yönetiminden önce akışı 24 saat başlatın. Ertesi gün, APAP tedavisini gerçekleştirin.
  2. Metabolizma teşrisi için karaciğer 2-OC MPS montajı
    1. Pipet 650 μL Williams E S büyük bölme içine ve 350 μL küçük bölmeiçine, hangi küresel alacak. Ultra-düşük eki 6 kuyu plakalarında, geniş delikli ipuçları kullanarak küreselleri sayın. Her karaciğer eşdeğeri yirmi spheroidsoluşur 26. Sadece organoidlerin 2-OC'nin daha küçük bölmesine aktarılmasına izin veren geniş uçlu ipuçları nı kullanarak devre başına yirmi karaciğer eşdeğerini entegre edin.
    2. MPS'yi basınçlı hava beslemesine bağlanması gereken kontrol ünitesine bağlayın. Parametreleri ayarlayın: yaklaşık 300 bar ± basınç ve 0,3 Hz bir pompalama frekansı. Test maddesi yönetiminden önce akışı 24 saat başlatın. Ertesi gün, APAP tedavisini gerçekleştirin.
  3. Emilim ve metabolizma teşrisi için bağırsak/Karaciğer 2-OC MPS montajı
    1. İki media (bağırsak ve karaciğer) 1:4 oranında birleştirin, bu da bağırsak apical tarafında 200 μL DMEM S ve bazolateral tarafta Williams E S 800 μL anlamına gelir. Bağırsak ve karaciğer eşdeğerlerini aynı anda 2-OC'ye entegre edin.
    2. MPS'yi basınçlı hava beslemesine bağlanması gereken kontrol ünitesine bağlayın. Parametreleri ayarlayın: yaklaşık 300 bar ± basınç ve 0,3 Hz bir pompalama frekansı. Test maddesi yönetiminden önce akışı 24 saat başlatın. Ertesi gün, APAP tedavisini gerçekleştirin.
      NOT: Tüm deneylerde, üç ayrı 2-OC devresi (yani, 1 ve 1/2 2-OC cihazlar) anlamına gelen triplicate'de her zaman noktasını gerçekleştirin. Her 2-OC devrenin toplam hacmi 1 mL'dir.

3. Asetaminofen (APAP) hazırlık

  1. APAP stok çözeltisini hazırlayın, APAP'ı mutlak etanolde eritin. Deney günü, apap'ı ilgili ortamda (APAP çözeltisi) seyreltin, "oral uygulama" için 12 μM ve "intravenöz uygulama" için 2 m konsantrasyona kadar seyreltin.
  2. Araç kontrol ve tedavi çözeltisindeki son etanol konsantrasyonunun her iki yönetim için de %0,5 olduğundan emin olun. Pozitif kontrol için (100 mM APAP), etanol konsantrasyonu %2'dir.

4. Madde yönetimi ve ortam örneklemetest

  1. APAP "sözlü" yönetimi ve medya örneklemesi
    1. 2-OC. Pipet 500 μL'lik uygun kültür ortamının her bağırsak bariyerindeki basolateral ve apikal ortamı organoid bazolateral taraftaki büyük bölmeye ve 300°L'lik küçük bölmeye aspire edin.
    2. Kabarcıklar için kontrol edin ve oral uygulama taklit, apikal tarafında test maddesi ile bağırsak bariyereşdeğer tedavi ile devam edin. Bağırsak kültürü eklerin apikal tarafına 12 μM APAP çözeltisinin 200 μL'lik kısmını ekleyerek APAP "oral" yönetimini taklit edin (Şekil 1B). MPS'yi kontrol ünitesine bağlayın.
    3. Aşağıdaki zaman noktalarında apikal ve bazolateral kenarlardan toplam hacmi toplamak: 0 h, 5 dk, 15 dk, 30 dk, 1 h, 3 h, 6 h, 12 h, ve 24 h15,27. Tüm deneyleri, statik ve dinamik koşullarda triplicate olarak gerçekleştirin ve her üç katının her örneğini ayrı bir mikrotüpte toplayın. Örnekleri HPLC/UV kullanarak analiz edin.
      NOT: Ayrı apikal ve bazolateral örnekler.
  2. APAP "intravenöz" yönetimi ve medya örneklemesi
    1. 2 μM APAP çözeltisini doğrudan karaciğer bölmesi içine vererek "intravenöz" rotayı taklit edin. Tüm 2-OC orta içeriği aspire. Pipet 650 μL Williams E S büyük bölme içine test maddesi içeren ve 20 küresel içeren küçük bölme içine aynı ortam 350 μL. Aşağıdaki zaman noktalarında tüm hacimleri toplayın: 0 h, 30 dk, 1 saat, 2 saat, 3 saat, 6 h, 12 saat ve 24 h27,28.
    2. Tüm deneyleri üç katı, statik ve dinamik koşullarda gerçekleştirin. Her bir örnek, her üçkif, ayrı bir mikrotüp içinde toplayın. Örnekleri HPLC/UV kullanarak analiz edin.

5. Enstrümantasyon ve kromatografik koşullar

  1. HPLC analizi
    1. HPLC analizi için ilgili tüm parametreleri Tablo 1'egöre ayarlayın.
    2. Mobil fazı vakum altında 0,45 μm membran filtreden filtreleyin. Numuneleri 0,22 m gözenek boyutunda PVDF şırınga filtresinden (çap 13 mm) filtreleyin ve bir şişede saklayın. Ölçümü başlatın.
  2. Stok çözümleri, kalibrasyon standartları ve kalite kontrol (QC) numuneleri
    1. 0,25 ile 100,00 μM arasında değişen çalışma çözümlerini elde etmek için amonyum asetat tamponu (100 mM, pH 6.8) ve Amonyum asetat tamponu (1:1, v/v) ile seyreltilmiş DMEM S ve Williams E S hücre kültürü ortamı ile 10 mM APAP stok çözeltisi hazırlayın.
    2. Üç aylık kalibrasyon örneklerinin yanı sıra üç aylık dört seviyedeki kalite kontrol örneklerini de dahil edin. Seri seyreltme ile bu standartları hazırlayın.
    3. APAP tepe alanlarının kalibrasyon eğrilerini APAP nominal standart konsantrasyonlarına karşı oluşturun. Her kalibrasyon eğrisi için doğrusal regresyon uygun belirleyin. Çeşitli kalibrasyon modellerinin uygunluk larını görsel muayene, korelasyon katsayısı, çalışma içi ve inter-run doğruluk ve hassas değerlerle değerlendirin.
    4. DMEM S ve Williams E S ortam amonyum asetat tampon (1:1, v / v) sextuplicate seyreltilmiş boş örnekleri enjekte. 0,50 (LOQ), 4.50, 45.00 ve 90.00 μM APAP konsantrasyonları için amonyum asetat tamponu (1:1, v/v) ile seyreltilmiş DMEM S ve Williams E S ortamlarında kalite kontrol örneklerinin triplicates hazırlayın.
    5. Kalite kontrol örneklerinin standart bir eğri oluşturmak için kullanılandan farklı olarak yeni bir stok çözeltisinden hazırlandığından emin olun. Çalışma içi ve iç-çalışma varyasyonlarını araştırmak için kalite kontrol örneklerini kullanın.
  3. Doğrulama yordamları
    1. Daha önce bildirilen yordamları29,30aşağıdaki biyoanalitik yöntem doğrulama gerçekleştirin. Williams E S ve DMEM S hücre kültürü ortamı nı göz önünde bulundurarak, beş ya da altı ayrı olayda kromatografik koşuları gerçekleştirin.
    2. Amonyum asetat arabelleği (1:1, v/v) ile seyreltilmiş DMEM S veya Williams E S hücre kültürü ortamlarında 0,25 ile 100,00 μM arasında değişen kalibrasyon noktalarının, ilgili nominal konsantrasyonlara (x ekseni) karşı APAP'ın (eksen y) tepe alanlarına göre çizilmesini sağlayın. Bu standart kalibrasyon eğrilerinin eğimlerini amonyum asetat tamponu içinde hazırlanan kalibrasyon eğrisi eğimleri ile karşılaştırın. Tüm kalibrasyon eğrilerinin en az 0,998 korelasyon değerine sahip olduğundan emin olun.
    3. Beş veya altı farklı günde lloq, düşük, orta ve yüksek kalite de çoğaltıcılar kullanarak vekil matris analiziçin kesinlik ve doğruluk (intra ve inter-run) belirleyin. 0.50, 4.50, 45.00 ve 90.00 μM APAP konsantrasyonları (n= 3) içeren amonyum asetat tamponu (1:1, v/v) seyreltilmiş DMEM S veya Williams E S hücre kültür ortamlarında aynı gün intra-run hassas ve doğruluk ölçümleri yapın.
    4. Yakın zamanda elde edilen kalibrasyon eğrilerinden APAP konsantrasyonlarını içeren her kalite kontrol numunesini değerlendirin. Tahlillerin seçiciliğini, bileşenlerin karışması sonucu oluşan ilgi bileşiğinin ve olası diğer kromatografik zirvelerin ayrılması derecesine göre test edin.
  4. Alt ölçüleme sınırı (LLOQ) ve algılama sınırı (LOD)
    1. Yanıtın standart sapmasını ve eğim yaklaşımını temel alan alt nicelik sınırını (LLOQ) belirleyin. α y-intercept standart sapma ve S kalibrasyon eğrileri29,30çizerek elde edilen düz çizgi eğimi olan formül 10α/S kullanarak hesaplayın. Kalibrasyon eğrisi29,30eğimi ile bölünmüş, boş standart sapma 3,3 kez dikkate alarak algılama sınırı (LOD) tahmin.

6. Doku eşdeğerleri canlılık/işlevsellik

  1. Mtt
    1. MPS tayininin tüm zaman noktalarında organoid canlılığı değerlendirmek için bir MTT tayini yapın. Negatif kontrol olarak, hücre ortamı artı araç kullanın. Pozitif kontrol olarak organoidleri 100 mM APAP ve hücre ortasında seyreltilmiş %1 NaOH ile tedavi edin.
    2. 96 kuyu plakasında ki her bir kuyunun 20 küresel ini aktarımı ve bağırsak eşdeğerlerini içeren hücre kültürü, kuyu başına bir bağırsak eşdeğeri yerleştirerek 24 kuyu hücresi plakasına yerleştirin. Doku eşdeğerlerini 1x DPBS ile üç kez yıkayın.
    3. 1 mg/mL MTT çözeltisinin 300 μL'sini ekleyin, her kuyu başına ilgili hücre ortasında seyreltilir. Standart hücre kültürü koşullarında plakaları 3 saat kuluçkaya yatırın.
    4. Borular üzerinde mtt çözeltisini dikkatlice her kuyudan çıkarın. 4 °C'de bir gecede her kuyuda 200 μL isopropanol kullanarak bağırsak ve karaciğer eşdeğerlerinden MTT formazan ayıklayın.
      NOT: Buharlaşmayı önlemek için kapağı kapatın.
    5. Her bir süpernatantın 200 μL'sini 96 kuyulu mikro test plakasında önceden tanımlanmış olana aktarın. Boş olarak isopropanol kullanın.
    6. 570 nm bir plaka okuyucu formazan absorban okuyun. MTT azaltmak için hücrelerin göreli yeteneğini hesaplamak (%) her zaman noktasının ortalama optik yoğunluğunu kullanarak, negatif kontrol ile karşılaştırıldığında, 100% hücre canlılığı olarak kabul.
  2. Sitokimya/Histoloji
    1. 0,1 M fosfat-salin tamponunda %4 (w/v) paraformaldehit kullanarak, oda sıcaklığında 25 dakika boyunca bağırsak ve karaciğer eşdeğerlerini düzeltin, pH 7.4. Organoidleri her seferinde 10 dakika PBS tamponunda 5 kez yıkayın. Leke tetramethylrhodamine izotiyoyanat-phalloidin veya Alexa Fluor 647 phalloidin, PBS311:50 ile bağırsak ve karaciğer eşdeğerleri .
    2. Tam donma kadar sıvı nitrojen onları transfer etmeden önce RT de alışmak için birkaç dakika için OCT dondurma ortamına aktarın. Bir kriyostat kullanarak, yaklaşık 10-12 μm kalınlığında karaciğer sferoidler kriyokesitgerçekleştirin.
    3. DAPI ile montaj orta dokubölümleri monte. Konfokal floresan mikroskopi ile inceleyin.
    4. Belirlenen protokollere göre hematoksilin ve eozin boyama gerçekleştirmek için fiksasyon sonrası organoidleri dondurun. Yukarıda açıklandığı gibi doku dilimleme sonra montaj ortamı ile slaytlar monte ve optik mikroskop kullanarak histolojik görüntüler almak.
  3. Yüksek içerik analizi
    1. Hücrelerin mitokondriyal ve nükleer boyama
      1. 1 mM mitokondriyal boyama stoğu çözeltisi (örneğin, MitoTracker Deep Red FM) yapmak için DMSO'daki lyophilized tozunu yeniden oluşturun. Aliquoted stok çözeltisi ışıktan korunan -20 °C'de saklayın. 1 mM mitokondriyal boyama stoğunu, önceden ısıtılmış (37 °C) doku kültürü ortamında serumsuz son konsantrasyona (200 nM) seyreltin.
      2. Hücre kültürü ortamını kaldırın. Mitokondriyal boyama çözeltisini ilave ederek numuneyi tamamen kaplayacak ve %5 CO2ile nemlendirilmiş bir atmosferde 37 °C'de 15-45 dakika boyunca inkübhücreleri ekleyin.
      3. Mitokondriyal boyama çalışma çözeltisini dikkatlice çıkarın ve oda sıcaklığında 15 dakika pbs'de %2-4 paraformaldehit fiksatif ile değiştirin.
      4. Sabit hücreleri PBS ile 5 dakika hafifçe durulayın. Yıkama işlemini iki kez tekrarlayın.
      5. 10 mg/mL (16.23 M) nükleik asit boyama çözeltisi hazırlayın ve 10 mL ultra saf suda 100 mg Hoechst 33342 boyaer.
        NOT: Stok çözeltisi -20 °C'de ışıktan korunmalıdır.
      6. PBS'de 0.2-2.0 μg/mL nükleik asit boyama çalışma çözeltisi hazırlayın ve sabitlenmiş hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca nükleik asit boyama çözeltisi ile inkübe edin.
      7. Nükleik asit boyama çalışma çözeltisini çıkarın ve hücreleri PBS ile 5 dakika üç kez hafifçe durulayın. Hücreler PBS'de 4 °C'de tutulmalı ve ışıktan korunmalıdır.
    2. Mitokondriyal ve nükleer boyama analizi
      1. Hücreleri nükleik asit lekesi (λEx/ λEm: 361/497 nm) ve mitokondriyal leke (λEx/ λEm: 644/665 nm) için uygun filtre setleri ile floresan mikroskobu kullanarak analiz edin. Nükleik asit pozitif boyama ile hücreleri bulmak ve hücre sayısını ölçmek. Mitokondride mitokondriyal leke floresan yoğunluğunu ölçün.
  4. ImageJ'de morfometrik ölçümler (küresel hesaplamalar)
    1. Columbus yazılımından *.flex dosyaları olarak Yüksek İçerik Analizi (HCA) görüntülerini dışa aktarın. Bio-Formats eklentisi32kullanarak ImageJ'de gri tonlama olarak .flex dosyalarını alma : Dosya > İçe Aktar > Bio-Formatlar.
    2. İçe Alma Seçenekleri penceresinde, Hyperstack görüntülemeyi seçin ve Split altındaki Split kanallarını ayrı pencerelere bölmeyi etkinleştirin. Bu seçenek, belirli bir kanaldaki tüm dosyalara (örneğin, DAPI, mitotracker, vb.) erişim sağlar. Bellek yönetimi altında sanal yığını kullan'ı seçmeyin.
      NOT: UV dalga boyunda (örneğin 405 nm) kültür ortamı azaldıkça görüntülerde DAPI kanalının "toz" olarak kullanılması tercih edilir.
    3. .flex dosyasındaki katıştırılmış değerlere göre yüklenmediyse piksel boyutunu(Analyze > Set Scale)ayarlayın. Gürültü fazlalarını gidermek ve şekil konturundaki düzensizlikleri önlemek için Gaussian Blur filtresi uygulayın. İşlem > Filtreler > Gaussian Bulanıklığı. Sigma (yarıçapı) 2,0 ve 3,0 arasında yüksek bir değer çoğu durumda için idealdir. Yığının birden çok görüntüsü varsa, hepsine uygulayın (İşlem Yığını penceresinde Evet'i seçin).
    4. Bir eşik kullanarak arka plan ve organoidleri (nesneleri) ayırmak için ikili bir görüntü oluşturun. Resim > Ayarla > Eşik' itıklatın. Kırmızı maskeyi kullanarak görüntüyü yoğunluğuna göre değerleri ayarlayın, organoid şekle uyacak şekilde morfolojiyi sağlam tutarak kullanın. Görüntünün beyaz bir arka planı varsa Koyu arka planı devre dışı edin. Uygula'yıtıklatın.
    5. Yığın'ı İkili pencereye dönüştür ünde Eşik yöntemini seçin. Genellikle, Varsayılan veya Üçgen görüntü işleme bu tür tercih edilir. Arka Planı KaranlıkOlarak Tutun. Yığında birden fazla resim varsa, her görüntü için Hesapla eşleği'ni seçin.
    6. İşlem > İkili > Boşlukları doldurun' useçin. İsteğe bağlı olarak, arka plandaki delikleri kaldırın. İşlem > İkili > Seçeneks'de Siyah arka planı seçin ve Boşlukları Yeniden Doldurun'u çalıştırın. Bir sonraki adıma geçmeden önce Siyah arka plan seçeneğini devre dışı kaltın.
    7. Ayrı nesneler. Organoidler için havza yöntemi iyi bir seçimdir. İşlem > İkili > Havza'yıtıklatın. Şekil çözümlemesi yürütmek.
      1. Analiz Et > Ölçümleri Ayarla'yıseçin. Çeşitli seçenekler mevcuttur (ayrıntılar https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html). Organoidler için Alan, Ortalama gri değeri, Min & max gri değeri ve Şekil tanımlayıcılarıseçin. İsteğe bağlı olarak, görüntüdeki nesneleri ve Bilimsel gösterimitanımlamak için Görüntü etiketini seçin. Tamam'ıtıklatın.
      2. Analiz > Parçacıkları Analiz Et'iseçin. Boyut ve Döngü sınırlarını seçin. Görüntüdeki tüm nesneleri ölçmek için sırasıyla 0-sonsuzve 0,00-1,00'i tutun. Göster'de,nesnelerin tanımlanması için Anahatlar'ı seçin. Sonuçları çıktıya Görüntülemeyi etkinleştirin; Kenarlıklara dokunan nesneleri hariç tutmak için kenarlarda hariç tutma; Nesnelerde nihai iç delikler ana şeklin bir parçası olarak kabul edilir böylece delikleri ekleyin.
    8. Her görüntü yığını için Şekil Çözümlemesi'ni tekrarlayın ve sonuçlar tek bir tabloya eklenir. Dosya > Virgülle Ayrılmış Değerler (.csv) dosyasında sonuç tablosunu Kaydet... olarak dışa aktar.
  5. Gerçek Zamanlı PCR
    1. Üreticinin talimatlarına uyarak fenol ve guanidin izotiyosiyanatmonohasic çözeltisi kullanarak doku eşdeğerlerinden RNA ayıklayın.
    2. Toplam RNA'nın 1 - 2 μg'lik ters transkripsiyonu ile cDNA sentezini gerçekleştirin.
    3. Gerçek zamanlı nicel PCR gerçekleştirmek için genözel astarlar(Tablo 5)kullanarak tüm hedefleri yükseltin. Her qRT-PCR 30 ng ters transkripsiyonu RNA ve her astar 100 nM içerir.
    4. PCR koşullarını takip edin: 50 °C 3 dakika (1 döngü); 95 °C 5 dakika (1 döngü); 30 saniye için 95 °C, 45 saniye için 59 °C ve 45 saniye (35 - 40 devir) için 72 °C.
  6. CYP tsur
    1. Karaciğer 2-OC montajı için bölüm 2.2'yi takip edin. Deney grupları hücre dışı kontrol, 12 saat, 24 saat için APAP 2 μM tedaviler ve araç kontrolütür. APAP 2 μM hazırlama ve tedavisi için 3.3 ve 4.2 bölümlerini takip edin.
      NOT: Tüm numunelerin CYP teşrisi için aynı anda hazır olmasını sağlamak için, 24 saatlik tedaviye başladıktan 12 saat sonra 12 saatlik tedaviye başlayın. CYP aktivitesinin hücresiz kontrolünü %0,5 etanol çözeltisi ile ve araç kontrolüyle tedavi edin.
    2. Oda sıcaklığında 3 mM luminojenik substrat stok çözeltisi çözülür ve William'ın E S.'sinde 1:1000 seyreltme yapın ışıktan koruyun.
    3. Küresel leri toplayın ve her deney grubunu 96 kuyuluk bir kuyuya aktarın. Ortayı çıkarın, 100 μL 1x DPBS ile iki kez yıkayın ve kuyu başına 80 μL 3 m substrat çözeltisi ekleyin. William'ın E S ortasında ki hücre siz kontrolü tutun. Bir arka plan kontrolü için küresel veya substrat çözeltisi olmadan bir kuyu kaydedin. 37 °C'de %5 CO2ile 30-60 dk inkübasyon, ışıktan korunur.
    4. Östrojen ile Reconstitution Tampon kullanarak liyophilized Luciferin Algılama Reaktifi (LDR) dengeleyin. Girdap veya ters çevirerek karıştırın. Uygun hacimdeki hacmi bir sonraki adıma kadar oda sıcaklığında saklayın.
      NOT: Yeniden oluşturulan LDR oda sıcaklığında 24 saat veya 4 °C'de 1 hafta aktivite kaybı olmadan saklanabilir. Uzun süreli depolama için –20 °C'de saklayın.
    5. Kuluçkadan sonra beyaz opak 96-kuyu mikroplakasının üç farklı kuyusunda bozulmamış küresel sferoidlerin süpernatantının 25 μL'sini aktarın. Kuyu başına 25 l LL ekleyin ve homojenize edin.
    6. Beyaz tabağı oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatırın. Bir luminometre üzerinde parlaklık okuyun. Florometre kullanmayın.
    7. Test bileşik işlenmiş ve işlenmemiş (araç kontrolü) değerlerinden arka plan parlaklık değerlerini (hücre kontrolü yok) çıkararak net sinyalleri hesaplayın. CYP3A4 aktivitesinin yüzde değişimini, net işlem görmüş değerleri net işlenmemiş değerlere bölerek ve 100 ile çarparak hesaplayın.
  7. Batı lekeleme
    1. Karaciğer küresellerini tanımlanmış 1,5 mL mikrotüpe aktarın. Ortayı çıkarın ve 1x DPBS'nin 100 μL'si ile iki kez yıkayın.
    2. 20 dakika boyunca 4 °C'de 100 μL hücreli RIPA tamponunda karaciğer küreseloidlerini incele. 15 dakika, 4 °C ve 11000 rpm için santrifüj. Supernatant'ı başka bir tanımlanan 1,5 mL mikrotüpe aktarın.
    3. Bradford yöntemi ile elde edilen protein miktarını ölçün. Bir degrade poliakrilamid jelin in de başına ölçülen hücre lisatından 10 ila 50 μg arasında protein yükleyin ve bir SDS-PAGE gerçekleştirin.
    4. Yüklü proteini jelden yarı kuru sistem ekipmanı aracılığıyla 0,22 μm PVDF membrana aktarın. 50 mM Tris-HCl ve 192 mM glisin aktarım çözeltisi kullanın. Ekipman parametrelerini aktarılacak jel sayısına göre ayarlayın (bir seferde 1-2).
    5. TBS-T tamponunda %3-5 yağsız süt çözeltisi ile PVDF membranındaki spesifik olmayan etkileşimleri engelleyin: Tris-Tamponlu Salin (50 mM Tris pH 7.6, 150 mM sodyum klorür) Tween 20'nin %0.1'i ile desteklenmiştir. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca hafifçe sürekli sallayarak membran altında tutun.
    6. Oda sıcaklığında 3-5 dakika boyunca hafifçe sürekli sallayarak altında TBS-T ile yıkayın. Bu yıkama adımLarını iki kez tekrarlayın.
    7. TBS-T'de sırasıyla 1:1000 ve 1:2000'e kadar seyreltik albumin ve vinkülin primer antikorları. Membranı bir gecede 4 °C'de, hafifçe sürekli titreme altında birincil antikorlarla kuluçkaya yatırın.
      NOT: Her zaman antikorları seyreltmek için üreticinin talimatlarına uyun.
    8. Primer antikor ve yıkama zarını 3 kez çıkarın (adım 6.7.6). Seyreltik ECL anti-fare IgG ikincil antikor 1:5000 TBS-T. Oda sıcaklığında 2 saat boyunca hafifçe sürekli sallayarak altında ikincil bir antikor ile membran kuluçka.
    9. Sekonder antikor çıkarın ve membranyı yıkayın (adım 6.7.6). ECL Western Blotting Substrat kullanarak protein algılama gerçekleştirin. 30 s- 30 dk otoradyografik filmleri ortaya çıkar. Triplicate immünoblot algılama gerçekleştirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

2-OC MPS PK APAP testleri gerçekleştirmek için, ilk adım insan bağırsağı ve karaciğer eşdeğerleri (organoidler) üretmektir. PK APAP tkalasına başlamadan önce 2-OC mikroakışkan cihaza(Şekil 1A) 24 saat entegre edilmiştir. Ertesi gün ortam değiştirilir ve model APAP'a maruz kalır. Şekil 1, 2-OC cihazının içine yerleştirilen bağırsak ve karaciğer eşdeğerlerini(Şekil 1B)ve APAP PK deney zaman dilimini(Şekil 1C)

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Araştırmacı yeni ilaçların farmakolojik özelliklerinin doğru ve güvenilir bir şekilde değerlendirilmesi, aşağıdaki geliştirme adımlarında riski azaltmak için kritik öneme sahiptir. MPS, tahmin gücünü artırmayı ve klinik öncesi testlerle harcanan maliyetleri ve zamanı azaltmayı amaçlayan nispeten yeni bir teknolojidir. Grubumuz çoğunlukla kurşun optimizasyonu için gerekli olan farmakokinetik ve toksikolojik özelliklerin değerlendirilmesinde ilerlemektedir. İki odası olan ve iki organoidin entegrasyonuna olanak sağlayan 2-...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Dr. Christie Guguen-Guillouzo, Unit 522 INSERM'den Dr. Philippe Gripon ve Ünite 271 INSERM'den Dr. Christian Trepo'ya Biyolojik Materyalin (Hepa RG hücreleri) kullanımı ve akademik araştırmayapmak için bize sunulması için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1x DPBSThermo Fisher Scientific14190235Kalsiyum yok, magnezyum yok
2-OCTissUse GmbHİki organlı çip
384 kuyulu Küresel MikroplakaCorning3830Siyah/Şeffaf, Yuvarlak Altlı, Ultra Düşük Ataşman
%4 ParaformaldehitAsetaminofen hücresini sabitlemek için kullanın
Sigma AldrichA7085MPS tahlilleri için kullanın
AsetonitrilTediaHPLC
Alexa Fluor 647 phalloidinThermo Fisher Bilimselkonfokal deney
Amonyum asetatSigma AldrichHPLC gerçekleştirmek için kullanılır
Caco-2 hücreleriSigma Aldrich86010202
Kakodilat tamponu
Hücre kültürü şişeleriSarstedt
Konfokal Floresan mikroskobuLeicaDMI6000
KriyostatLeicaCM1950
DMEM yüksek glikozThermo Fisher Scientific12800017Takviyeleri ekleyin:% 10 fetal sığır serumu, mL penisilin başına 100 birim, 100 ve mikro; g/mL streptomisin ve %1 esansiyel olmayan amino asitler
DMSOSigma AldrichD4540HepaRG ortamına %2 ekleyin
EtanolSentezi Fetal
Sığır SerumuThermo Fisher Bilimsel12657029
Donma ortamı OCTTissue-TekDoku-Tek® O.C.T. &ticaret; Bileşik, suda çözünür glikoller ve reçinelerin bir formülasyonudur ve -10 ° C sıcaklıklarda kriyostat kesitleme için uygun bir numune matrisi sağlar; C ve altı.
Hematoksilen & Eosin
HepaRG hücreleriBiopredic InternationalHPR101Farklılaşmamış hücreler
HHSTeCScienCell Araştırma Laboratuvarları5300Hücreler ve tüm kültür takviyeleri
Hoechst 33342HCA deneyleri
HT-29 hücreleriSigma Aldrich85061109
İnsan İnsüliniİnvitrojeni - Thermo Fisher Scientific12585014
HidrokortizonSigma AldrichH0888
İzopropanolMerck278475
Karnovsky' s fiksatif
L-glutaminThermo Fisher ScientificA2916801
Luna C18 koruma sütunu SSPhenomenexHPLC
MikroskobuLeicaDMi4000
MikrotomLeicaRM2245
Millicell 0.4 & mikro; m gözenek boyutu eklerMerckPIHP01250
Millicell ERS-2 metreMerckMERS00002TEER ölçümü için kullanılır
MitoTracker Deep RedHCA deneyleri
MTTThermo Fisher ScientificM6494
MX3000P sistemiAgilent Technologies
Neubauer odasıHücre sayma
Operetta Yüksek İçerikli Görüntüleme SistemiPerkin Elmer
Luciferin-IPA Promega Cat ile HCA P450-Glo CYP3A4 Testi.# V9001
Penisilin / StreptomisinThermo Fisher Bilimsel15070063Hücre kültürü
PermountThermo Fisher BilimselHistoloji
PrimerleriRT-qPCR
PVDF membranBioRad
PVDF Şırınga filtresi0.22 μ m gözenek boyutu
Ters fazlı Luna C18 sütunuPhenomenexHPLC
Çalkalayıcı (IKA VXR Basic Vibrax)kullanılırIKA Works GmbH & Co2819000MTT testini iyileştirmek için sferoidler için kullanılır
Yıldız Hücre Ortamı (STeC CM)ScienCell5301STeC CM takviyeleri ekleyin
SuperScriptIITM Ters TranskriptazThermo Fisher Scientific
SYBR Yeşil PCR Master KarışımıThermo Fisher Scientific
TRizol TM reaktifiThermo Fisher ScientificTrizol, fenol ve guanidin izotiyosiyanatın monofazik bir çözeltisidir.
Tripsin / EDTA çözeltisiThermo Fisher ScientificR001100
Ultra düşük bağlantılı plakalarCorningCLS3471-24EA6 kuyulu
Vectashield plus DAPI montaj ortamı
Beyaz Opak 96 kuyulu MikroplakaPerkinHelmer
Geniş delikli uçlar
Williams EPan BiotechP04-29510Takviye ekleyin:% 10 fetal sığır serumu, 2 mM L-glutamin, ml penisilin başına 100 birim, 100 ve mikro; g / mL streptomisin ve 5 &mikro; g/mL insan insülini
gerçekleştirmek için kullanılır gerçekleştirmek için kullanılır yapmak için kullanılır gerçekleştirmek için

Kaynaklar

  1. Zhang, D., Luo, G., Ding, X., Lu, C. Preclinical experimental models of drug metabolism and disposition in drug discovery and development. Acta Pharmaceutica Sinica B. 2 (6), 549-561 (2012).
  2. Hynds, R. E., Giangreco, A. The relevance of human stem cell-derived organoid models for epithelial translational medicine. Stem Cells. 31 (3), 417-422 (2013).
  3. Sivaraman, A., et al. A Microscale In vitro Physiological Model of the Liver: Predictive Screens for Drug Metabolism and Enzyme Induction. Current Drug Metabolism. 6 (6), 569-591 (2005).
  4. Dehne, E. M., Hasenberg, T., Marx, U. The ascendance of microphysiological systems to solve the drug testing dilemma. Future Science OA. 3 (2), 185(2017).
  5. Oleaga, C., et al. Multi-Organ toxicity demonstration in a functional human in vitro system composed of four organs. Scientific Reports. 6, 20030(2016).
  6. Maschmeyer, I., et al. A four-organ-chip for interconnected long-term co-culture of human intestine, liver, skin and kidney equivalents. Lab Chip. 15 (12), 2688-2699 (2015).
  7. Esch, M. B., Mahler, G. J., Stokol, T., Shuler, M. L. Body-on-a-chip simulation with gastrointestinal tract and liver tissues suggests that ingested nanoparticles have the potential to cause liver injury. Lab Chip. 14 (16), 3081-3092 (2014).
  8. Materne, E. M., et al. The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture. Journal of Visualized Experiments. , e52526(2015).
  9. Esch, M. B., Ueno, H., Applegate, D. R., Shuler, M. L. Modular, pumpless body-on-a-chip platform for the co-culture of GI tract epithelium and 3D primary liver tissue. Lab Chip. 16 (14), 2719-2729 (2016).
  10. Sung, J. H., Kam, C., Shuler, M. L. A microfluidic device for a pharmacokinetic–pharmacodynamic (PK-PD) model on a chip. Lab on a Chip. 10 (4), 446-455 (2010).
  11. Viravaidya, K., Sin, A., Shuler, M. L. Development of a Microscale Cell Culture Analog to Probe Naphthalene Toxicity. Biotechnology Progress. 20 (1), 316-323 (2004).
  12. Sin, A., Chin, K. C., Jamil, M. F., Kostov, Y., Rao, G., Shuler, M. L. The Design and Fabrication of Three-Chamber Microscale Cell Culture Analog Devices with Integrated Dissolved Oxygen Sensors. Biotechnology Progress. 20 (1), 338-345 (2004).
  13. Tsamandouras, N., et al. Integrated Gut and Liver Microphysiological Systems for Quantitative In vitro Pharmacokinetic Studies. The AAPS Journal. 19 (5), 1499-1512 (2017).
  14. Graham, G. G., Davies, M. J., Day, R. O., Mohamudally, A., Scott, K. F. The modern pharmacology of paracetamol: Therapeutic actions, mechanism of action, metabolism, toxicity and recent pharmacological findings. Inflammopharmacology. 21 (3), 201-232 (2013).
  15. Hodgman, M. J., Garrard, A. R. A Review of Acetaminophen Poisoning. Critical Care Clinics. 28 (4), 499-516 (2012).
  16. Maschmeyer, I., et al. Chip-based human liver-intestine and liver-skin co-cultures - A first step toward systemic repeated dose substance testing in vitro. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 95, 77-87 (2015).
  17. Bessems, J. G. M., Vermeulen, N. P. E. Paracetamol (acetaminophen)-induced toxicity: Molecular and biochemical mechanisms, analogues and protective approaches. Critical Reviews in Toxicology. 31 (1), 55-138 (2001).
  18. Hirt, M. N., et al. Increased afterload induces pathological cardiac hypertrophy: A new in vitro model. Basic Research in Cardiology. 107 (6), 307(2012).
  19. Fink, C., et al. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. The FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 14 (5), 669-679 (2000).
  20. Zhang, B., Peticone, C., Murthy, S. K., Radisic, M. A standalone perfusion platform for drug testing and target validation in micro-vessel networks. Biomicrofluidics. 7 (4), 044125(2013).
  21. Araújo, F., Sarmento, B. Towards the characterization of an in vitro triple co-culture intestine cell model for permeability studies. International Journal of Pharmaceutics. 458 (1), 128-134 (2013).
  22. Cadena-Herrera, D., et al. Validation of three viable-cell counting methods: Manual, semi-automated, and automated. Biotechnology Reports. 7, 9-16 (2015).
  23. User Guide Millicell® ERS-2 Electrical Resistance System. Millipore. , Available from: http://www.merckmillipore.com/BR/pt/life-sciencee-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5 6-10 (2016).
  24. Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15655-15660 (2002).
  25. Guillouzo, A., et al. The human hepatoma HepaRG cells: A highly differentiated model for studies of liver metabolism and toxicity of xenobiotics. Chemico-Biological Interactions. 168 (1), 66-73 (2007).
  26. Wagner, I., et al. A dynamic multi-organ-chip for long-term cultivation and substance testing proven by 3D human liver and skin tissue co-culture. Lab on a Chip. 13 (18), 3538-3547 (2013).
  27. Forrest, J. A. H., Clements, J. A., Prescott, L. F. Clinical Pharmacokinetics of Paracetamol. Clinical Pharmacokinetics. 7 (2), 93-107 (1982).
  28. Dollery, C. Therapeutic Drugs. , Churchill Livingstone. London. (1999).
  29. Food and Drug Administration Guidance for Industry: Bioanalytical method validation. U.S. Department of Health and Human Services. , Available from: http://www.labcompliance.de/documents/FDA/FDA-Others/Laboratory/f-507-bioanalytical-4252fnl.pdf (2013).
  30. Shah, V. P., et al. Bioanalytical method validation-a revisit with a decade of progress. Pharmaceutical research. 17 (12), 1551-1557 (2000).
  31. Marin, T. M., et al. Shp2 negatively regulates growth in cardiomyocytes by controlling focal adhesion kinase/src and mTOR pathways. Circulation Research. 103 (8), 813-824 (2008).
  32. Linkert, M., et al. Metadata matters: Access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
  33. OECD. OECD TG 491 - Short Time Exposure In vitro Test Method for Identifying i) Chemicals Inducing Serious Eye Damage and ii) Chemicals Not Requiring Classification for Eye Irritation or Serious Eye Damage. OECD. 14, OECD guidelines for the testing of chemicals (2018).
  34. Fernandes, M. B., Gonçalves, J. E., Tavares, L. C., Storpirtis, S. Caco-2 cells permeability evaluation of nifuroxazide derivatives with potential activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Drug Development and Industrial Pharmacy. 41 (7), 1066-1072 (2015).
  35. OECD. OECD TG 492 - Reconstructed human Cornea-like Epithelium (RhCE) test method for identifying chemicals not requiring classification and labelling for eye irritation or serious eye damage. OECD. 35, OECD guidelines for the testing of chemicals (2018).
  36. OECD, O. E. C. D. OECD. OECD TG 431 - In vitro skin corrosion: reconstructed human epidermis (RHE) test method. OECD. 8, OECD guidelines for the testing of chemicals (2016).
  37. OECD. OECD TG 439 - In vitro Skin Irritation: Reconstructed Human Epidermis Test Method. OECD. 21, OECD guidelines for the testing of chemicals (2015).
  38. Marin, T. M., et al. Acetaminophen absorption and metabolism in an intestine/liver microphysiological system. Chemico-Biological Interactions. 299, 59-76 (2019).
  39. Maass, C., Stokes, C. L., Griffith, L. G., Cirit, M. Multi-functional scaling methodology for translational pharmacokinetic and pharmacodynamic applications using integrated microphysiological systems (MPS). Integrative Biology (United Kingdom). 9 (4), 290-302 (2017).
  40. Sung, J. H., Wang, Y., Shuler, M. L. Strategies for using mathematical modeling approaches to design and interpret multi-organ microphysiological systems (MPS). APL Bioengineering. 3 (2), 021501(2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Bağırsak Karaciğer ÇipiAsetaminofen FarmakokinetiğiHPLC AnaliziMTT Canlılık AnaliziKonfokal MikroskopiOrganoid Gen EkspresyonuTEER ÖlçümüHepatik Stellat HücrelerCaco-2 HT-29 Ko-kültürü
İlaç Farmakokinetik ve Toksikolojik Değerlendirme için Bir Bağırsak/Karaciğer Mikrofizyolojik Sistemi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.