Yöntem makalesi

Taze Dondurulmuş Fare Kemiklerinden Yüksek Kaliteli RNA Veren Lazer Yakalama Mikrodisksiyon Protokolü

DOI:

10.3791/60197

⸱

16 Eylül 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Research, University of Veterinary Medicine Vienna

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kemik hücrelerinde gen ekspresyonu analizi için yeterli miktarda yüksek kaliteli RNA elde etmek için lazer yakalama mikrodisseksi (LCM) protokolü geliştirilmiştir. Mevcut çalışma fare uyluk bölümleri üzerinde duruluyor. Ancak, burada bildirilen LCM protokolü herhangi bir sert doku hücrelerinde gen ekspresyonu çalışmak için kullanılabilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA verimi ve bütünlüğü RNA analizi için belirleyicidir. Ancak, tüm lazer yakalama mikrodisesi (LCM) prosedürü boyunca RNA bütünlüğünü korumak genellikle teknik olarak zordur. LCM çalışmaları düşük miktarda malzeme ile çalıştığı için, sınırlı RNA verimleri ile ilgili endişeler de önemlidir. Bu nedenle kemik hücrelerinde gen ekspresyonu analizi için yeterli miktarda yüksek kaliteli RNA elde etmek için bir LCM protokolü geliştirilmiştir. Boyama protokolünün etkisi, kriyokesit kalınlığı, mikrodiskoplu doku miktarı, RNA ekstraksiyon kiti ve Mikrodissected kemik hücrelerinden elde edilen RNA verimi ve bütünlüğü üzerine kullanılan LCM sistemi değerlendirildi. Sekiz μm kalınlığında dondurulmuş kemik bölümleri yapışkan film kullanılarak yapılmış ve ticari bir LCM lekesi için hızlı bir protokol kullanılarak boyanmış. Örnek polietilen tereftalat (PET) membran ve yapışkan film arasında sıkışmış oldu. Yeterli verimde yüksek kaliteli RNA'lar elde etmek için numune toplama için yerçekimi ni kullanan bir LCM sistemi ve kolon tabanlı RNA çıkarma yöntemi kullanılmıştır. Mevcut çalışma fare uyluk bölümleri üzerinde duruluyor. Ancak, burada bildirilen LCM protokolü hem fizyolojik koşullarda hem de hastalık süreçlerinde herhangi bir sert doku hücrelerinde yerinde gen ekspresyonunda çalışmak için kullanılabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dokular heterojen ve uzamsal olarak dağılmış hücre tiplerinden oluşur. Belirli bir dokudaki farklı hücre tipleri aynı sinyale farklı yanıt verebilir. Bu nedenle, fizyolojik ve patolojik koşullarda farklı hücre tiplerinin rolünün değerlendirilmesi için belirli hücre popülasyonlarını izole edebilmek esastır. Lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) karmaşık dokulardan belirtilen hücreleri izole etmek ve kaldırmak için nispeten hızlı ve hassas bir yöntem sunar1. LCM sistemleri, enzimatik işleme veya kültür de büyüme gerek kalmadan histolojik doku bölümlerinden ilgi hücreleri ayırmak için bir lazer ışını nın gücünü kullanın. Bu, hücrelerin doğal doku habitatlarında olduğu ve farklı hücreler arasındaki mekansal ilişkiyi de içeren doku mimarisinin korundiğı anlamına gelir. Hem yakalanan hücrelerin hem de artık dokunun morfolojisi iyi korunmuştur ve aynı slayttan birkaç doku bileşeni sırayla örneklenebilir. İzole hücreler daha sonra RNA, DNA, protein veya metabolit içeriği nin sonraki analizi için kullanılabilir2,3.

Farklı hücre popülasyonlarında veya farklı tedavilerden sonra gen ekspresyonunu analiz etmek için, sonraki analiz için yeterli kalite ve nicelikte mRNA'lar elde etmek gerekir4,5. DNA'nın aksine, RNA'lar fiksasyona karşı daha duyarlıdır ve amaç RNA'yı incelemek olduğunda dondurulmuş doku kullanımı önerilir. MRNA'lar her yerde bulunan ribonükleazlar (RNase) tarafından hızla bozulduğu için, numune işleme ve hazırlama sırasında sıkı RNase içermeyen koşullar ve numunelerin oda sıcaklığında depolanmasından kaçınmak gereklidir. Buna ek olarak, herhangi bir uzun sulu faz adımları olmadan hızlı teknikler RNA bozulmasını önlemek için çok önemlidir6. RNA verimi ve bütünlüğü de LCM işlemi ve Kullanılan LCM sistemi etkilenebilir7,8. Şu anda, farklı çalışma prensipleri ile dört LCM sistemleri mevcuttur2. Farklı RNA izolasyon kitleri RNA miktarı ve kalite7,8önemli farklılıklar ile test edilmiştir beri RNA ekstraksiyon yöntemi de önemli olabilir.

Herhangi bir doku hazırlama yöntemi iyi morfolojik kontrast elde etmek ve daha fazla analiz için RNA bütünlüğünü korumak arasında bir denge bulma gerektirir. Kemikten dondurulmuş kesitler hazırlamak için, bir yapıştırıcı film geliştirilmiş ve sürekligeliştirilmiş 9. Kemik bölümleri kesilir ve doğrudan yapışkan film üzerine boyanmaktadır. Bu yapışkan film boyama birçok türleri için geçerlidir, ve LCMkullanarakkemik kriyokesitlerden ilgi hücreleri izole etmek için istihdam edilebilir 9,10,11,12,13, 14. Cerrahi çıkarma, gömme, dondurma, kesme ve boyama dahil tüm adımlar bir saatten kısa sürede tamamlanabilir. Daha da önemlisi, osteoblastlar, kemik astar hücreleri ve osteoklastlar gibi hücreler açıkça9,10,11,12,13,14olarak tanımlanabilir. Bu yöntem hızlı ve basit olma avantajına sahiptir. Kemik kriyokesitleri oluşturmak için alternatif bir yöntem bant transfer sistemi15kullanmaktır. Ancak, ikinci teknik daha zaman alıcıdır ve ek enstrümantasyon gerektirir, çünkü bölümler yapışkan banttan ultraviyole (UV) çapraz bağlama ile önceden kaplanmış membran slaytlara aktarılması gerekir. Bant aktarım sistemi başarıyla LCM16,17,18,19ile birleştiğinde olmasına rağmen, çapraz bağlı kaplama bir arka plan deseni oluşturabilirsiniz unutulmamalıdır hücre tipi tanımlama20ile müdahale edebilir.

Tipik olarak, mikrodiskoplu hücrelerden sadece küçük miktarda RNA çıkarılır ve RNA kalitesi ve miktarı genellikle mikro-kılcal elektroforez21ile değerlendirilir. Bir bilgisayar programı RNA bütünlük numarası (RIN) olarak adlandırılan RNA özleri kalite dizini atamak için kullanılır. 1.0'lık RIN değeri tamamen bozulmuş RNA'yı gösterirken, 10,0 değeri RNA'nın tamamen sağlam olduğunu gösterir22. Genellikle, 5 üzerinde indeksler RNA çalışmaları için yeterli olarak kabul edilir. RIN değeri 5.0−10.0 olan örneklerdeki gen ekspresyonu desenlerinin birbiriyle iyi ilişkili olduğubildirilmiştir 23. Bu yöntemin duyarlılığı yüksek olmasına rağmen, toplam RNA'nın 50 pg/μL'si kadar az tespit edilebildiği için, numunedeki RNA konsantrasyonu çok düşükse kalite değerlendirmesi elde etmek çok zor olabilir. Bu nedenle, RNA kalitesini değerlendirmek için, LCM'den sonra kalan doku bölümü genellikle24numaralı slayta tampon ıslatarak RNA'yı ayıklamak için kullanılır.

LCM farklı dondurulmuş dokularda yaygın olarak kullanılmış olmasına rağmen, çıkarılan RNA'ların RIN değerleri nadiren rapor edilir. Ayrıca, fare kemiklerinde RNA'yı incelemek için en uygun yöntemi açıklığa kavuşturmak için karşılaştırmalı bir çalışma bulunmamaktadır. Bu çalışmada, yüksek kaliteli RNA elde etmek için numune hazırlama, LCM protokolü ve RNA ekstraksiyonu optimize etmek için yetişkin fare uyluk kemiğinden dondurulmuş kesitler kullanılmıştır. Bu protokol özellikle numune toplama için yerçekimi kullanan LCM sistemi için optimize edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Farelerden alınan kemik dokusu, hayvan bakımı için geçerli kurallara uygun olarak sıkı bir şekilde kullanılmış ve hayvanların acı çekmesini en aza indirmek için tüm çabalar gösterülmüştür.

1. Hayvanlar ve Donma Katıştırma

  1. Ev hayvanları sürekli oda sıcaklığı (RT; 24 °C) ve 12 saat açık/12 saat karanlık döngü ve yiyecek ve suya ücretsiz erişim sağlar.
    NOT: Bu çalışmada kemik dokuları 3 aylık erkek yabani tip C57BL/6 farelerinden elde edildi.
  2. Nekropside, genel anestezi altında abdominal vena kavadan eksanguinate fareler (ketamin/ksilazin, 100/6 mg/kg intraperitoneal).
    NOT: RNA bozulmasını önlemek için, RNase içermeyen aletler ve malzemeler kullanın, eldiven giyin ve tüm deney boyunca NUMUNELerin RT'de depolanmasını önlemek için hızlı bir şekilde çalışın.
  3. Hızla tüm uyluk çıkarın, neşter ve kağıt havlu kullanarak çevreleyen yumuşak dokuların onları temizleyin. Katıştırma kalıbına optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşiği dökün ve femuru gömme kalıbının dibine koyun. Numuneleri sıvı nitrojenle dondurun. OCT, RT'de saydam ve dondurulduğunda beyazdır.
  4. Tamamen dondurulduktan sonra, numuneleri folyoya sarın ve kuru buzda -80 °C'ye aktarın. Numuneleri ilave işleme ye kadar -80 °C'de saklayın.
    NOT: Protokol burada duraklatılmış olabilir.

2. Bölüm Hazırlığı

  1. Kriyostattaki sıcaklığı -19 °C'ye, blok tutucunun sıcaklığını ise -17 °C'ye ayarlayın. % 70 etanol kullanarak kriyostat iç silin. Sert dokular, cam slaytlar ve dondurucu içine bir montaj aracı için tek kullanımlık bıçak yerleştirin. Kesit süresince kriyostat içinde tutun.
  2. Kuru buz daki donmuş doku bloğunu kriyostat'a aktarın ve en az 10 dakika boyunca dengede durmasını bekleyin.
    NOT: Kriyoseksiyon için -80 °C'den -19 °C'ye kadar bir bloğun tekrar tekrar erimesinden ve sık sık bisiklete binmekten kaçının.
  3. OCT bloğunu kalıbın dışına itmek için gömme kalıbının altına basın. Blok sahibine, bloğu ona yapıştıracak kadar OCT ortamı uygulayın. OCT ortamı tamamen donana kadar bekleyin.
  4. Blok tutucuyu nesne tutucuya yerleştirin ve yerine sıkın. Bıçağın konumunu ayarlayın ve numuneyi kaplayan OCT'yi kaldırmak için 15 μm kesme artışlarını kullanarak bloğu kırpın. Örnek daha erken kesilmişse ve yüzeye maruz kalmışsa, ilk 2−3 doku kesitini bloktan atın.
  5. Kriyostat'ı 8 μm kesit oluşturacak şekilde ayarlayın ve atılacak 2−3 kriyokesiti kesin (ilk birkaçı genellikle 8 μm'den daha kalın olacaktır). Yapışkan filmi bloğun üzerine yerleştirin ve filmi blota yapıştırmak için uygun bir alet kullanın. Film tarafından bölüm tutarak yavaş ve sabit bir hızda kesme olun.
  6. Örneğin erimesini önlemek için filmi (örnek yukarı bakacak şekilde) hemen önceden soğutulmuş bir cam kaydırağa (kriyostat içindeki kriyobar üzerine) yerleştirin. Daha kolay boyama için filmi cam slayta sabitlemek için bant kullanın. Boyama protokolü ile hemen devam edin.

3. Hızlı Boyama Protokolü

  1. 50 mL tüplerde aşağıdaki çözeltilerden 40 mL hazırlayın ve buza koyun: %95 etanol, RNase içermeyen su, %100 etanol, %100 etanol ve %100 ksilen. Buz (boyama hariç) tüm adımları gerçekleştirin. Her deneysel gün için, rnase içermeyen su ile taze tüm sulu reaktifler hazırlayın.
    DİkKAT: Ksilen tarafından zehirlenme önlemek için kaputta çalışın.
  2. % 95 etanol 30 s için kuluçka bölümleri, daha sonra cm ve downstream uygulamaları ile müdahale edebilir tamamen EKIM kaldırmak için RNase içermeyen su 30 s daldırma.
  3. 50 μL'lik ticari LCM dondurulmuş kesit lekesi(Malzeme Tablosu)bölümün üzerine dağıtın, RT'de 10 s'lik kuluçkaya yatırın ve slaytın kenarını emici mendil kağıdına yerleştirerek süzün. % 100 etanol 30 s durulama tarafından aşırı leke kaldırın.
  4. Kemik kesitlerini 30 s için %100 etanol içeren ikinci bir tüpe batırın ve 30 s için %100 ksilene aktarın.
  5. Destek olarak kuru cam kaydırağa yapıştırıcı film (örnek yukarı bakacak şekilde) koyun. Filmin etkilenmemesi ve mümkün olduğunca düz yerleştirilmemesin. Numunenin tamamen kurumasını izin vermeyin.
  6. Üzerine pet membran çerçeve slayt yerleştirin. Kısa bir süre filme takmak için zara eldivenli bir parmak basın. Örnek daha sonra membran ve yapışkan film arasında sıkışmış. Yapışkan film katlanmış veya kırışık olmamalı ve film ve membran arasında hiçbir hava kabarcıkları olmalıdır. LCM ile hemen devam edin.

4. Lazer Yakalama Mikrodisseksi

  1. Yüzey dekontaminantı(Malzeme Tablosu)kullanarak sahne ve kapak tutucuyu RNase'den temizleyin. Slaytı ve kapakları sırasıyla slayt tutucuya ve kapak tutucuya yükleyin.
  2. Odağı ayarlayın ve 1,25x hedefiyle slayta genel bakış elde edin. 40x hedefine değiştirin ve odağı ayarlayın. Slayta genel bakışı kullanarak ilgi alanını seçin. Lazer parametrelerini aşağıdaki gibi ayarlayın: diyafram, 7; lazer gücü, 60; hız, 5; darbe frekansı, 201; numune dengesi, 20. Bu parametreleri her amaç için optimize edin.
  3. Lazer örneği kesmezse, lazer gücünü artırın. Alternatif olarak, lazer birden fazla kez uygulanabilir. Buna ek olarak, hedefi eksik kesik noktaları olup olup yok olup yok olup yok olup, Taşı ve kesme seçeneğini kullanarak bu noktalardaki çizgiyi yeniden çizin. Sonraki slaytların diseksiyonu için lazer ayarlarını kaydedin.
  4. Morfolojik kriterlere göre distal femoral cancellous veya kortikal kemik osteoblastlar, osteositler ve kemik astar hücreleri seçin. UV lazer tarafından hasarı en aza indirmek için hedef hücrelerden daha uzak lazer yolu için bir çizgi çizin. Boyama dan sonra 1 saatten daha kısa sürede tüm mikrodisbölümleri gerçekleştirin.
  5. Her hücre türünü 0,5 mL'lik ayrı bir tüp üniçinde toplayın.
    NOT: Sıvı geri kazanımı yerine kuru yakalama RNA bozulmasını önleyebilir. Buna ek olarak, mikrocentrifuge tüp kapağı nda bulunan tampon çok küçük hacimli ya buharlaşır veya kristalize olabilir (bileşimine bağlı olarak) LCM sırasında.
  6. Mümkün olan durumlarda LCM'den sonra toplama tüpü kapağını gözlemleyerek yakalama başarısını onaylayın. RNA çıkarma ile hemen devam edin.

5. RNA Çıkarma

  1. Toplama tüpünün kapağına β-mercaptoetanol içeren lysis tamponunun 50 μL'sini verin ve 1 dk. kapakta yukarı ve aşağı boru lar atarak numuneyi lyse. Birkaç kapak biraraya gelecekse, toplam arabellek hacminin RNA ekstraksiyon kiti(Tablo Malzemeler)için tavsiye edildiği gibi olduğuna dikkat edin.
    DİkKAT: β-mercaptoetanol, RNA'yı bozulmadan korumak için eklenmelidir, ancak toksik olarak kabul edilir. Koruyucu giysiler ve eldiven giyin ve kaputta çalışın.
  2. Buna ek olarak, her slayt için β-mercaptoetanol içeren lysis tampon 350 μL ile etiketli 1.5 mL mikrosantrifüj tüp hazırlayın. RNA ayıklamak için LCM'den sonra kalan bölümleri kullanın. Filmi membrandan dikkatlice ayırın ve lysis tamponunu birkaç kez yavaşça keserek numuneyi inceleyerek inceleyin.
    NOT: Toplam lysis tamponu miktarı 350 μL olmalıdır. Slayttan akacağı için hepsini aynı anda sindirim için kullanmayın.
  3. Lysate örneklerini kuru buzüzerine koyun ve -80 °C'de saklayın.
    NOT:     Protokol burada duraklatılabilir.
  4. RT.LCM tarafından hasat edilen hücrelerden toplama tüplerinden 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Numuneyi hasat etmek için birden fazla kapak kullanılmışsa, havuz birkaç lysates.
  5. Üreticinin talimatlarına göre RNA ayıklayın. Genomik DNA'yı çıkarmak için kolonları DNase I ile tedavi edin. 14 μL RNa içermeyen su ile elute RNA, 12 μL eluat ile sonuçlanır. RNA'yı -80 °C'de saklayın.
    NOT: Protokol burada duraklatılmış olabilir.

6. RNA Verim ve Bütünlüğünün Ölçülmesi

  1. Islince buzda RNA'yı eritin. Mikro kapiller elektroforez kullanarak izole RNA'nın verimini ve bütünlüğünü ölçün. Üreticinin talimatlarına göre toplam RNA'yı (numune başına 1°L) bir yongaya(Malzeme Tablosu)yükleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fare uyluk kemiğinde gen ekspresyonu analizi için yeterli miktarda yüksek kaliteli RNA elde etmek için LCM protokolü geliştirilmiştir. Optimize edilmiş protokolde, 8 μm kalınlığında dondurulmuş kemik kesitleri bir yapışkan film üzerinde kesildi ve ticari bir LCM dondurulmuş kesit lekesi için hızlı bir protokol kullanılarak boyandı. Örnek PET membran ve yapışkan film arasında sıkışmış oldu. Fare kemik hücreleri örnek toplama için yerçekimi kullanan bir LCM sistemi kullanılarak mikrodiskopedildi. Yeterli verimyüksek kalite...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hem RNA kalitesi hem de miktarı doku manipülasyonu, LCM prosesi ve RNA ekstraksiyonu gibi numune hazırlamanın tüm aşamalarında olumsuz etkilenebilir. Bu nedenle, sonraki gen ekspresyonu analizi için yeterli miktarda yüksek kaliteli RNA elde etmek için bir LCM protokolü geliştirilmiştir.

LCM için çoğu laboratuvar 7−8 μm kalınlığında2. Kalın kesitler daha fazla malzemenin hasat edilmesine olanak sağlayacaktır. Ancak, çok kalın ise, bu mikroskobik çözünürlüğü azaltabilir ve lazer ile k...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ute Zeitz ve Nikole Ginner onların mükemmel teknik yardım yanı sıra destek için Vetcore ve hayvan bakım personeli için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2-MerkaptoetanolSigma63689-25ML-F
Mutlak etanol EMPLURAMerck Millipore8,18,76,01,000
Yapışkan film (LMD filmi)Section-LabC-FL001
Agilent 2100 Biyoanalizör SistemiAgilent Technologies
Agilent RNA 6000 Pico Çip KitiAgilent Technologies5067-1513
Arcturus HistoGene Boyama ÇözeltisiUygulamalı Biyosistemler12241-05
Kriyofilm takma aletiBölüm-LabC-FT000
Kriyostat Leica CM 1950Leica Biosystems
Cam mikroskop slaytları, kesim rengi buzlu turuncuVWR Yaşam Bilimleri631-1559
Histoloji doku kalıpları PVCMEDITE48-6302-00
LMD7  Lazer  Mikrodissektion  SistemLeica Microsystems
Düşük profilli Mikrotom Bıçakları Leica DB80 XLLeica Biosystems14035843496
Nükleaz içermeyen suVWR Yaşam BilimleriE476-500ML
PET membran slaytlar 1.4 & mu; mMoleküler Makineler & Industries GmbH50102
RNase Away yüzey dekontaminantMoleküler BiyoÜrün7002
RNeasy Mikro KitQiagen74004
Tissue-Tek optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşiğiSakura Finetek4583
KsilenVWR Yaşam Bilimleri2,89,73,363

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
  2. Legres, L. G., Janin, A., Masselon, C., Bertheau, P. Beyond laser microdissection technology: follow the yellow brick road for cancer research. American journal of Cancer Research. 4 (1), 1-28 (2014).
  3. Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
  4. Kerman, I. A., Buck, B. J., Evans, S. J., Akil, H., Watson, S. J. Combining laser capture microdissection with quantitative real-time PCR: effects of tissue manipulation on RNA quality and gene expression. Journal of Neuroscience Methods. 153 (1), 71-85 (2006).
  5. Adiconis, X., et al. Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples. Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).
  6. Golubeva, Y. G., Warner, A. C. Laser Microdissection Workflow for Isolating Nucleic Acids from Fixed and Frozen Tissue Samples. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1723, 33-93 (2018).
  7. Farris, S., Wang, Y., Ward, J. M., Dudek, S. M. Optimized Method for Robust Transcriptome Profiling of Minute Tissues Using Laser Capture Microdissection and Low-Input RNA-Seq. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 185(2017).
  8. Garrido-Gil, P., Fernandez-Rodríguez, P., Rodríguez-Pallares, J., Labandeira-Garcia, J. L. Laser capture microdissection protocol for gene expression analysis in the brain. Histochemistry and Cell Biology. 148 (3), 299-311 (2017).
  9. Kawamoto, T., Kawamoto, K. Preparation of thin frozen sections from nonfixed and undecalcified hard tissues using Kawamot's film method. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1130, 149-164 (2014).
  10. Streicher, C., et al. Estrogen Regulates Bone Turnover by Targeting RANKL Expression in Bone Lining Cells. Scientific Reports. 7 (1), 6460(2017).
  11. Vaidya, M., et al. Osteoblast-specific overexpression of amphiregulin leads to transient increase in femoral cancellous bone mass in mice. Bone. 81, 36-46 (2015).
  12. Jay, F. F., et al. Amphiregulin lacks an essential role for the bone anabolic action of parathyroid hormone. Molecular and Cellular Endocrinology. 417, 158-165 (2015).
  13. Murali, S. K., Andrukhova, O., Clinkenbeard, E. L., White, K. E., Erben, R. G. Excessive Osteocytic Fgf23 Secretion Contributes to Pyrophosphate Accumulation and Mineralization Defect in Hyp Mice. PLoS Biology. 14 (4), e1002427(2016).
  14. Andrukhova, O., Schüler, C., Bergow, C., Petric, A., Erben, R. G. Augmented Fibroblast Growth Factor-23 Secretion in Bone Locally Contributes to Impaired Bone Mineralization in Chronic Kidney Disease in Mice. Frontiers in Endocrinology. 9, 311(2018).
  15. Golubeva, Y. G., Smith, R. M., Sternberg, L. R. Optimizing Frozen Sample Preparation for Laser Microdissection: Assessment of CryoJane Tape-Transfer System®. PLoS ONE. 8 (6), e66854(2013).
  16. Pacheco, E., Hu, R., Taylor, S. Laser Capture Microdissection and Transcriptional Analysis of Sub-Populations of the Osteoblast Lineage from Undecalcified Bone. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1723, 191-202 (2018).
  17. Nioi, P., et al. Transcriptional Profiling of Laser Capture Microdissected Subpopulations of the Osteoblast Lineage Provides Insight Into the Early Response to Sclerostin Antibody in Rats. Journal of Bone and Mineral Research. 30 (8), 1457-1467 (2015).
  18. Taylor, S., et al. Differential time-dependent transcriptional changes in the osteoblast lineage in cortical bone associated with sclerostin antibody treatment in ovariectomized rats. Bone Reports. 8, 95-103 (2018).
  19. Taylor, S., et al. Time-dependent cellular and transcriptional changes in the osteoblast lineage associated with sclerostin antibody treatment in ovariectomized rats. Bone. 84, 148-159 (2016).
  20. Martin, L. B. B., et al. Laser microdissection of tomato fruit cell and tissue types for transcriptome profiling. Nature Protocols. 11 (12), 2376-2388 (2016).
  21. Imbeaud, S., et al. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Research. 33 (6), e56(2005).
  22. Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3(2006).
  23. Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12, 42(2014).
  24. Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection. BMC Cell Biology. 11, 95(2010).
  25. Mahalingam, M. Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications. Laser Capture Microdissection: Methods and Protocols. Murray, G. I. , Humana Press. New York, NY. 1-17 (2018).
  26. Burgemeister, R., Gangnus, R., Haar, B., Schütze, K., Sauer, U. High quality RNA retrieved from samples obtained by using LMPC (laser microdissection and pressure catapulting) technology. Pathology, Research and Practice. 199 (6), 431-436 (2003).
  27. Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
  28. Clément-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
  29. Kölble, K. The LEICA microdissection system: design and applications. Journal of Molecular Medicine. 78 (7), B24-B25 (2000).
  30. Böhm, M., Wieland, I., Schütze, K., Rübben, H. Microbeam MOMeNT: non-contact laser microdissection of membrane-mounted native tissue. The American Journal of Pathology. 151 (1), 63-67 (1997).
  31. Micke, P., et al. A fluid cover medium provides superior morphology and preserves RNA integrity in tissue sections for laser microdissection and pressure catapulting. The Journal of Pathology. 202 (1), 130-138 (2004).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Laser Capture MicrodissectionRNA ExtractionMouse Bone SectionsCryosection PreparationStaining ProtocolGravity based LCM SystemColumn based RNA ExtractionMicrocapillary ElectrophoresisRIN Value AnalysisBone Cell Isolation

İlgili makaleler