Yöntem makalesi

Lucifer Sarı İontoforez kullanarak Astrosit Morfolojisini Görselleştirme

DOI:

10.3791/60225

⸱

14 Eylül 2019

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles, 2Department of Neurobiology, David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Astrositler morfolojik olarak karmaşık hücrelerdir, çoklu süreçleri ve gür bölgeleri ile örneklenirler. Ayrıntılı morfolojilerini analiz etmek için, hafifçe sabit dokuda hücre içi Lucifer sarı iontoforezi gerçekleştirmek için güvenilir bir protokol salıyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Astrositler nöral devrelerin temel bileşenleridir. Onlar tüm merkezi sinir sistemi döşeme (CNS) ve nörotransmitter temizliği, iyon regülasyonu, sinaptik modülasyon, nöronlar için metabolik destek ve kan akımı düzenleme dahil fonksiyonları, çeşitli katılır. Astrositler bir soma olan karmaşık hücrelerdir, birkaç ana dalları, ve nöropil içinde çeşitli hücresel elementlertemas çok sayıda ince süreçler. Astrositlerin morfolojisini değerlendirmek için yapılarını görselleştirmek için güvenilir ve tekrarlanabilir bir yönteme sahip olmak gerekir. Erişkin farelerden hafifçe sabitlenmiş beyin dokusunda floresan Lucifer sarısı (LY) boya kullanarak astrositlerin hücre içi iyontoforezini gerçekleştirmek için güvenilir bir protokol sıyoruz. Bu yöntem, astrosit morfolojisi karakterize etmek için yararlı olan çeşitli özelliklere sahiptir. Bu, yapılarının farklı yönleri üzerinde morfolojik analizler yapmak için yararlı olan bireysel astrositlerin üç boyutlu yeniden yapılandırılmasına olanak sağlar. Ly iyontoforezi ile birlikte immünohistokimya, astrositlerin sinir sisteminin farklı bileşenleriyle etkileşimini anlamak ve etiketli astrositler içindeki proteinlerin ekspresyonunu değerlendirmek için de kullanılabilir. Bu protokol, ışık mikroskobu ile astrosit morfolojisini titizlikle incelemek için CNS bozukluklarının çeşitli fare modellerinde uygulanabilir. LY iontoforezi, astrosit yapısını değerlendirmek için deneysel bir yaklaşım sağlar, özellikle bu hücrelerin önemli morfolojik değişikliklere uğraması önerildiği yaralanma veya hastalık bağlamında.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Astrositler merkezi sinir sistemindeki en bol glial hücrelerdir (CNS). Onlar iyon homeostazı rol oynamak, kan akımı düzenleme, sinaps oluşumu yanı sıra eleme, ve nörotransmitter alımı1. Astrosit fonksiyonlarıgeniş bir yelpazede karmaşık morfolojik yapısı2yansıtılır ,3. Astrositler, sinapslar, dendritler, akslar, kan damarları ve diğer glial hücrelerle doğrudan etkileşime giren binlerce ince dal ve broşüre ayrılan birkaç birincil ve ikincil dal içerir. Astrosit morfolojisi farklı beyin bölgeleri arasında değişir, hangi nöronal devrelerde farklı işlevlerini gerçekleştirmek için yeteneklerini ipucu olabilir4. Ayrıca, astrositler gelişim sırasında morfolojisini değiştirmek için bilinen, fizyolojik koşullar sırasında, ve birden fazla hastalık devletlerde 3,5,6.

Astrosit morfolojisinin karmaşıklığını doğru bir şekilde çözmek için tutarlı, tekrarlanabilir bir yöntem gereklidir. Geleneksel olarak, immünohistokimya astrosit spesifik veya astrosit zenginleştirilmiş protein belirteçleri kullanımı ile astrosit görselleştirmek için kullanılmıştır. Ancak bu yöntemler astrositin yapısından çok protein ekspresyonunun paternini ortaya koymaktadır. Glial fibrillary asidik protein (GFAP) ve S100 kalsiyum bağlayıcı protein β (S100β) gibi yaygın olarak kullanılan belirteçler tüm hücre hacminde ifade etmez ve böylece tam morfolojiyi çözemez7. Floresan proteinleri astrositlerde (viral enjeksiyonlar veya transgenik fare muhabiri çizgileri) her yerde ifade etmek için genetik yaklaşımlar ince dalları ve genel bölgeyi belirleyebilir. Ancak, bireysel astrositleri ayırt etmek zordur ve analizler özel organizatör8tarafından hedeflenen astrosit popülasyonu tarafından önyargılı olabilir. Seri kesit elektron mikroskobu sinapslar ile astrosit süreçlerin etkileşimleri ayrıntılı bir resim ortaya çıkarmak için kullanılmıştır. Sinapslarla temas eden binlerce astrosit süreci nedeniyle, şu anda bu teknik9ile tüm hücreyi yeniden yapılandırmak mümkün değildir , ancak bu veri analizi için makine öğrenme yaklaşımlarının kullanımı ile değişmesi beklenmektedir.

Bu raporda, fare astrositlerini Lucifer sarısı (LY) boya ile hücre içi iyontoforez kullanarak, CA1 stratum radiatum'u örnek olarak kullanarak karakterize eden bir prosedüre odaklanıyoruz. Yöntem Eric Bushong ve Mark Ellisman10,11tarafından öncü geçmiş çalışmaları dayanmaktadır. Hafifçe sabitlenmiş beyin dilimlerinden gelen astrositler kendine özgü soma şekilleri ile tanımlanır ve LY ile doldurulur. Hücreler daha sonra konfokal mikroskopi ile görüntülenir. LY iyontoforezinin tek tek astrositleri yeniden yapılandırmak ve süreçlerinin ve bölgelerinin ayrıntılı morfolojik analizlerini yapmak için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz. Ayrıca, bu yöntem astrositler ve nöronlar, diğer glial hücreler ve beyin vaskülatür arasındaki mekansal ilişkileri ve etkileşimleri belirlemek için immünohistokimya ile birlikte uygulanabilir. LY iyontoforezinin farklı beyin bölgelerinde morfolojiyi ve sağlıklı veya hastalık lı hastalık lı fare modellerini analiz etmek için çok uygun bir araç olduğunu düşünüyoruz7,12,13.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada hayvan deneyleri, Ulusal Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Için Sağlık Enstitüsü Kılavuzu'na uygun olarak gerçekleştirildi ve Los Angeles California Üniversitesi'ndeki Rektör Hayvan Araştırma Komitesi tarafından onaylandı. Tüm deneylerde karışık cinsiyetli yetişkin fareler (6−8 haftalık) kullanılmıştır.

1. Çözüm Hazırlama

  1. Yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) çözeltisi
    1. Her deneyden önce taze ACSF çözeltisi (135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 14,7 mM NaHCO3, 11 mM D-glikoz, 1,25 mM Na2HPO4ve 2 mM CaCl2)hazırlayın. Son adımda MgCl2 ve CaCl2'yi ekleyin. Bileşenleri yüksek kaliteli deiyonize suda çözün.
    2. ACSF çözeltisini 35 °C'de bir su banyosunda ve köpükle %95 O2/ %5 CO2'yi deneyden önce en az 30 dakika kuluçkaya yatırın.
    3. ACSF'de (100 mL) %0.02'lik son konsantrasyona ulaşmak için %2 lidokain hidroklorür ekleyin.
  2. Fiksatif çözüm
    1. Tamponlu fosfatın %10 formalinkullanın.
  3. LY boya çözeltisi
    1. 5 mM KCl. Girdap'ta LY CH dilithium tuzu veya LY CH dipotasyum tuzu eriterek %1,5 LY boya çözeltisi hazırlayın. 1 mL'lik bir hacim çeşitli deneyler için yeterlidir.
    2. 16.800 x g10 dk için santrifüj . Daha sonra, 0,2 μm şırınga filtresi ile yeni bir tüp içine supernatant filtre. Aliquots 3 aya kadar 4 °C'de tutulabilir.
      NOT: Boya parçacıklarının toplanmasını önlemek için boya çözeltisini santrifüj etmek ve filtrelemek çok önemlidir, bu da elektrotu tıkayabilir.

2. Fare Transkardiyal Perfüzyon ve Beyin Diseksiyonu

  1. Transkardiyal perfüzyon için ekipman ve fare hazırlanması
    NOT:     Her iki cinsin C57/BL6 fareleri kullanılabilir. Yöntemin güvenilir bir şekilde çalışabilmek için farelerin 3 aydan daha yaşlı olmamasının önemli olduğu deneysel olarak gözlenmiştir (6−8 haftalık idealdir). Perfüzyon protokolü aşağıda açıklanmıştır. Ek bir başvuru daha fazla bilgi için sağlanır14.
    1. Hattaki hava kabarcıklarını temizlemek için ACSF çözeltisi ile perfüzyon borularını temizleyin. Kullanım sırasına göre cerrahi aletler (cımbız, kavisli, künt makas, iris makas) ayarlayın.
    2. Odaya 2−3 mL izofluran ekledikten sonra fareyi bir izofluran indüksiyon odasına koyarak derinden anestezi edin. Anestezinin etkili olması için 1−2 dk bekleyin. Nefes almanın durmadığından emin olun.
    3. Ayak sıkışmarefleksi için test edin. Fare ağrı uyarıcıya yanıt vermiyorsa ve refleks olmadığında devam edin. Oksijen ve bacaklarda% 5 izofluran kaynağı ile nefes koni yerleştirilen kafa ile supine pozisyonda hayvan güvenli ve kuyruk kimyasal bir duman başlık içinde bantlanmış.
  2. Transkardiyal perfüzyon
    1. Cımbız kullanarak, göğüs kafesi altında deri kaldırın. Karın boşluğuortaya çıkarmak için deri yoluyla kavisli, künt makas ile 5−6 cm'lik bir kesi yapın. Karaciğer ve diyafram görünür olana kadar karın duvarından yukarı doğru kesin.
    2. Karaciğeri yavaşça diyagramdan uzaklaştırın. Iris makas ile diyaframda 3−4 cm lateral kesi yapın.
    3. Göğüs boşluğu ortaya çıkarmak için vücudun her iki tarafı boyunca göğüs kafesi ile kesin. Kalbe zarar vermemeye ve akciğerlerden uzak durmaya dikkat edin. Kalbi ortaya çıkarmak için göğüs kafesini kaldır.
    4. Kalp görünür olduğunda, bir antikoagülan olarak sol ventrikül içine 0.05 mL heparin sodyum çözeltisi (mL başına 1.000 USP) enjekte. Daha sonra perfüzyon iğnesini dikkatlice sol ventriküle takın. İğnenin ventrikülde kaldığından ve diğer kalp odalarına delmediğinden emin olun. Iris makas ile sağ atriyumda küçük bir kesi yapın.
    5. Acsf çözeltisi ile vücut mevcut sıvı kantemizlenir kadar yaklaşık 10 mL /dk oranında perfuse (1−2 dk).
    6. Herhangi bir hava kabarcığı sunmadan ACSF çözümünden fiksatif çözüme geçin. 10−20 mL/dk'da 10 dakika boyunca fiksatif solüsyon ile perfuse.
      DİkKAT: Burundan fiksatif bir çözüm süzülmüş olduğuna dikkat edin. Bu iğne sağ ventrikül ulaştı ve fiksatif yerine vücudun geri kalanına sistemik devre yoluyla akciğerlere seyahat olduğunu gösterir.
  3. Beynin diseksiyonu
    1. Makasla farenin başını çıkarın ve farebeynini kafatasından dikkatlice inceleyin. Kısa bir fiksasyon sonrası süre için oda sıcaklığında 1,5 saat için fiksatif çözelti yerleştirin.
      NOT: Başarılı LY iyontoforezi için iyi bir perfüzyon gereklidir. Beyin beyaz renkli olmalı ve beyin vaskülatürde kan yok. Vücut ve uzuvlar sert görünmelidir.

3. Dilim Hazırlama

  1. Hipokampal dilimlerin hazırlanması
    1. 5 dakika oda sıcaklığında 0,1 M fosfat tamponlu salin (PBS) ile beyni yıkayın. Sonra, filtre kağıdı ile beyin kuru ve koku ampul ve beyincik keskin bir jilet ile çıkarın.
    2. Beyni cyanoakrilat tutkal kullanarak vibratom tepsisine monte edin ve tepsiyi oda sıcaklığında PBS ile doldurun. 110 μm kalınlığında hipokampal koronal kesitler kesin.
      NOT: Dilimlerin aynı kalınlığa ve eşit yüzeye sahip olduğundan emin olmak için vibratomun ayarını ayarlayın. Bu deney için, cihazüzerinde rasgele ayarlar olan 4,5 hız ayarı ve 8 frekans ayarı kullanılmıştır(Malzeme Tablosu). Kullanıcıların diğer aygıtlarda ayarları denemeleri gerekebilir.
    3. Tepsiden bölümleri toplayın ve buz üzerinde PBS bir çanak yerleştirin.

4. Elektrot Hazırlama

  1. Uygun direnç ile keskin bir elektrot hazırlayın.
    1. Filamentli borosilikat cam tek namlulu elektrot kullanın (O.D. 1.0 mm, I.D. 0.58 mm). Bir mikropipet çekmece(Malzeme Tablosu)üzerinde bir elektrot çekin. 5 mM KCl'de %1,5 LY ile doldurulmuş ideal elektrotlar, PBS banyosuna yerleştirildiğinde 200 MΩ direnç olmalıdır.
      NOT: Çekmece ayarı cihaza (kullanılan makine nin tipi ve çekmece filamenti) bağlı olarak değişir. Daha yüksek bir ısı ayarı genellikle daha uzun ve ince ipuçları verir. Bu deneyde kullanılan mikropipet çekmecesi için ayarlar: ısı: 317, çekme: 90, hız: 70 ve gecikme: 70. Yalak tipi bir filament kullanıldı.
    2. Tozun uca girmesini önlemek için elektrotları kapalı bir kapta saklayın. Ucun kırılmasını önlemek için elektrotları kutunun altından yüksek tutun.
  2. Elektrotly boya çözeltisi ile doldurun.
    1. Ucu aşağıya bakacak şekilde bir elektrotu dikey konuma getirin. Pipet 1−2 μL LY çözeltisi elektrotun arkasına ve çözeltinin kılcal hareket le ucuna taşınması için 5−10 dk bekleyin.
    2. Bir manipülatöre bağlı elektrot tutucudaki dolu elektrotun yerini yavaşça sabitle.
      NOT: Elektrot tutucunun gümüş telinin elektrot içindeki LY ile temas etmesi gerekir. Tel uzunluğuna bağlı olarak gerekirse LY çözeltisinin hacmini ayarlayın.

5. Astrositleri İontoforez ile Doldurmak

  1. Elektrot testi yapın.
    1. Oda sıcaklığında 0,1 M PBS ile dolu cam bir alt çanak içine yavaşça bir beyin dilimi yerleştirin. Naylon dizeleri ile platin bir arp ile yerinde dilim tutun.
    2. Elektrotun bir voltaj kaynağına bağlı olduğundan emin olun ve zemin elektrodu beyin dilimini içeren banyoya yerleştirin.
    3. Hedefi ilgi nin beyin bölgesine taşıyın.
    4. Elektrot çözeltiye indirin. Parlak alanın altında, görüş alanının merkezine taşıyın ve net ve enkaz veya kabarcıklar olmadan görünmesini sağlamak için 40x su daldırma lens ile dikkatle inceleyin. Elektrot ucunu tıkayan bir şey varsa, yenisiyle değiştirin.
      NOT: Tıkanma 200 MΩ elektrot için bir endişe kaynağıdır. Her deneyden önce boya çözeltisinin santrifüj ve filtrasyonu ile bu sık karşılaşılan bir sorun olmamalıdır. Ancak, elektrotucu küçük olduğundan, doku bazen açılışsıkışmış olabilir. Yazarlar bunu önlemek için bir yol bulamadık, ama kolayca sadece yeni bir elektrot kullanarak ele alınabilir.
    5. 488 nm lazer ile confocal lazer tarama mikroskobu altında elektrot ucu gözlemleyin. Daha sonra, 12 V.'de uyarıcıyı açarak boya çıkarma test edin. Voltaj stimülasyonu üzerine hiçbir veya az boya çıkarılırsa elektrot değiştirin.
    6. Parlak alanın altında, elektrodu yavaşça yüzeyin hemen üzerinde duran dilime doğru indirin.
  2. Astrositi iyontoforezle doldurun.
    1. İnfra-kırmızı diferansiyel girişim kontrastı (IR-DIC) ile dilim yüzeyinin 40−50 m altında astrositleri tanımlayın. Çapı yaklaşık 10 μm uzamış, oval şekilli somata ile hücreleri arayın. Bir astrosit seçildikten sonra, görüş alanının merkezine taşıyın.
      NOT: İontoforez için iyi bir hücrenin etrafında açık ve tanımlanmış sınırlar vardır. Tamamen doldurulamadıkları için dilimin yüzeyine çok yakın hücreleri seçmeyin. Bu rutin boya dolgu için astrositler belirlemek edebilmek için birkaç gün içinde bazı uygulama alır. Deney için kullanılan beyin bölgesine bağlı olarak, astrosit lerin sayısı değişebilir. Bu, doldurmadan önce bir astrositi tanımlamak için gereken zamanı etkileyebilir.
    2. Hücre gövdesi ile aynı düzlemde olana kadar, yavaşça doku da gezinme, dilim içine elektrot ucu indirin.
      NOT: Dokuzarar önlemek için yavaş yavaş elektrot hareket ettirin.
    3. Bir kez astrosit hücre gövdesi açıkça görünür ve özetlenen, yavaş yavaş ve yavaşça ileri elektrot ilerlemek. Ucu hücrenin soma impales kadar elektrot taşıyın. Elektrot soma içinde olup olmadığını not etmek için objektif odak yavaş yavaş yukarı ve aşağı hareket ettirin.
      NOT: Elektrot ucu hücre gövdesiiçinde olmalı ve soma üzerinde küçük bir girintinasyon gözlenmelidir. İpucunun hücreden geçmesinden kaçınmak için elektrotun daha fazla hareket ettirin.
    4. Elektrot ucu hücrenin içine girdikten sonra , ~0,5−1 V'deki uyarıcıyı açın ve sürekli olarak hücreye akım fırlatın. Konfokal mikroskobu kullanarak hücrenin dolmasını izleyin. Hücrenin ayrıntılarını görmek için dijital yakınlaştırmayı artırın ve elektrotun ucunun hücre içinde görünür olduğundan emin olun.
      NOT: Boyanın hücreden sızdığı veya çevredeki diğer hücreleri doldurduğu görülürse voltajı düşürün. Eğer boya hala hücreden dışarı sızıyor gibi görünüyorsa, elektrot yavaş yavaş dışarı çekin ve başka bir hücre bulmak. Boyanın son görüntüde yüksek sinyal/arka plan oranına sahip olması için sızdırmaması önemlidir.
    5. İnce dallar ve süreçler tanımlı görünene kadar yaklaşık 15 dakika bekleyin, voltajı kapatın ve elektrot ucunu hücreden yavaşça çekin.
  3. Dolu hücreyi görüntüle.
    NOT:     Görüntüleme, immünohistokimya ile boyandıktan hemen sonra veya sonra yapılabilir. Daha yüksek sayısal diyafram açıklığına (NA) sahip bir hedef daha iyi çözünürlük sağlar.
    1. 40x hedefiyle görüntülemeden önce hücrenin orijinal forma dönmesini bekleyin (15−20 dk). Hücreyi görüntülemek için, daha ince dalların ve işlemlerin tanımlı göründüğünden emin olmak için konfokal üzerindeki ayarı ayarlayın.
    2. Adım boyutu 0,3 μm olan bir z yığını ayarlayın. Görüntüleme sırasında, hücreden sinyal gelene kadar hedefi hareket ettirin ve bunu üst olarak ayarlayın. Daha sonra, hiçbir sinyal olana kadar (hücre üzerinden odaklanarak) aşağı objektif taşıyın, alt olarak ayarlayın.
    3. Görüntüleme tamamlandıktan sonra, boya ejeksiyonu için elektrot kontrol edin. Büyük bir boyama bulutu görünürse, bir sonraki dilim için kullanılabilir. Aksi takdirde, yeni bir elektrot ile değiştirin.
      NOT: Tek bir astrosit ve görüntüleme nin boya dolgusu yaklaşık 45 dakika ile 1 saat arasında sürer. Bu özel deney için fare başına yaklaşık 3−6 hücre elde etmek mümkündür. Gerekirse, birden çok hücre aynı dilimüzerinde etiketlenebilir. Ancak, bireysel astrositleri ayırt etmek için, hücreler arasında yaklaşık 200 μm mesafe tutmak emin olun.

6. İmmünohistokimya ile Boyama (İsteğe Bağlı)

  1. Görüntüleme yapıldıktan sonra, hemen immünohistokimya için korumak için buz üzerinde% 10 formalin dilim yerleştirin. Beyin dilimlerini karanlıkta tutun ve gece boyunca 4 °C'de saklayın.
  2. 0,1 M PBS'de beyin kesitlerini %0,5 noniyonik yüzey aktif maddeyle (yani Triton X 100) 5 dakika boyunca yıkayın. Daha sonra 0.1 M PBS'lik bir bloklama çözeltisinde %0.5 noniyonik yüzey aktif madde ve %10 normal keçi serumu (NGS) ile oda sıcaklığında hafif ajitasyon la 1 saat kuluçkaya yatırın.
  3. 0,1 M PBS'de seyreltilmiş primer antikorlarda ajitasyon içeren kesitleri %0,5 noniyonik yüzey aktif madde ve %5 NGS ile 4 °C'de 2 gün boyunca kuluçkaya yatırın.
    NOT: Beyin dilimlerinin kalınlığı nedeniyle, primer antikorların kuluçka süresinin daha iyi penetrasyon için uzatılması ve antikor konsantrasyonunun arttırılması gerekir. Bu deneyde anti GFAP antikoriçin 1:500 seyreltme, anti aquaporin-4 antikor için 1:500 seyreltme kullanılmıştır.
  4. Bölümleri 0,1 M PBS'de 10'ar dakika boyunca %0,5 niyonik yüzey aktif madde ile yıkayın ve 0,1 M PBS'de seyreltilmiş ikincil antikorlar ile %0,5 noniyonik yüzey aktif madde ve oda sıcaklığında 6 saat için %10 NGS ile kuluçkaya yatırın.
    NOT: LY boyasını görselleştirmek için kullanılan dalga boyu olan 488 nm ile heyecanlanan ikincil bir antikor seçmeyin. Bu deneyde, 1:1.000 seyreltme Alexa Fluor 546 keçi anti-tavuk IgG (H +L) ve Alexa Fluor 647 keçi anti-tavşan IgG (H +L) için kullanılmıştır.
  5. Her biri 10 dakika boyunca 0,1 M PBS'de 3x kesitleri durulayın. Daha sonra bölümleri floresan için uygun montaj ortamlarında cam mikroskop slaytlarına monte edin. Slaytları mühürleyin. 0,3 μm adım boyutundaki görüntü hücreleri.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada bildirilen veriler her deneyde 4 fareden 7−12 hücreden elde edilebistir. Ortalama veriler, uygun olduğu durumlarda şekil panellerinde raporlanır.

Astrosit morfolojisini değerlendirmek için, Şekil 1'deözetlenen CA1 stratum radyatumdaki astrositleri doldurmak için LY boyası kullanarak hücre içi iyontoforez uyguladık. Şekil 2 temsili bir astrositi ve ayrıntılı morfolojik yapısını betimlemektedir. Hücre 488 nm lazer hattı (adım boyutu 0.3...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yazıda özetlenen yöntem, hafifçe sabitlenmiş beyin dilimlerinde LY boyasının hücre içi iontoforezini kullanarak astrosit morfolojisini görselleştirmenin bir yolunu açıklamaktadır. Bu protokolde vurgulanan ve başarılı LY iyontoforezine ve hücrelerin morfolojik rekonstrüksiyonuna katkıda bulunan birçok kritik faktör bulunmaktadır. Bir faktör kalitesi ve büyük ölçüde farenin yaşı ve perfüzyon sonucu tarafından belirlenir görüntülerin çoğaltılabilirlik vardır. Bu çalışmada 6−8 haftalık C57/BL6N fare kullandık. Başarılı bi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar rehberlik yanı sıra metin üzerinde yorum için Bayan Soto, Dr Yu ve Dr Octeau teşekkür ederiz. Bu çalışma NS060677 tarafından desteklenir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 10 Tamponlu Formalin FosfatFisherSF 100-20Aynı alternatif kullanılabilir
Supor Membranlı Akrodisk Şırınga FiltreleriPall4692alternatif Ag
/ AgCl öğütülmüş peletWPIEP2Benzer bir alternatif kullanılabilir
Alexa Fluor 546 keçi tavuğu önleyici IgG (H + L)Thermo ScientificA-11040Benzer bir alternatif kullanılabilir:
Alexa Fluor 647 keçi tavşan önleyici IgG (H + L)Thermo ScientificA27040Benzer bir alternatif kullanılabilir:
Anti Aquaporin-4 antikoruNovus BiologicalsNBP1-87679Benzer bir alternatif kullanılabilir
Anti GFAP antikoruAbcamab4674Benzer bir alternatif kullanılabilir
Filamentliborosilikat cam pipetlerDünya hassas aletleri1B150F-4
C57BL/6NTac farelerTaconic StockB6Benzer bir alternatif kullanılabilir
Kalsiyum KlorürSigma21108Aynı alternatif kullanılabilir
Konfokal lazer tarama mikroskobuOlympusFV1000MPEBenzer bir alternatif kullanılabilir
D-glikozSigmaG7528Aynı alternatif kullanılabilir
Disodyum FosfatSigma255793Aynı alternatif kullanılabilir
Elektrot çektirme- Model P-97SutterP-97Benzer bir alternatif kullanılabilir
Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01Aynı alternatif kullanılabilir
Heparin sodyum enjeksiyonu (mL başına 1.000 USP)Sagent Pharmaceuticals400-10Aynı alternatif
Imaris yazılımı (Sürüm 7.6.5)Bitplane Inc. kullanılabilir.Benzer bir alternatif kullanılabilir:
İzofloranHenry Schein Hayvan Sağlığı29404Aynı alternatif kullanılabilir
Lidokain Hidroklorür Enjekte Edilebilir (% 2)Clipper1050035Aynı alternatif kullanılabilir
Lucifer Sarı CH dilityum tuzuSigmaL0259
Lucifer Sarı CH dipotasyum tuzuSigmaL0144
Magnezyum KlorürSigmaM8266Aynı alternatif kullanılabilir
Mikroskop Kapak CamıThermo Scientific24X60-1Aynı alternatif kullanılabilir
Mikroskop SlaytlarıFisher12-544-2Aynı alternatif kullanılabilir
Normal Keçi SerumuVektör LaboratuvarlarıS-1000Aynı alternatif kullanılabilir
Objektif objektif (40x)OlympusLUMPLFLN 40XWBenzer bir alternatif kullanılabilir
Objektif lens (60x)OlympusPlanAPO 60XBenzer bir alternatif
PBS tabletleri, 100 mLVWRVWRVE404kullanılabilir Aynı alternatif kullanılabilir
Pipet mikromanipülatörü - Model ROE-200SutterMP-285 / ROE-200 / MPC-200Benzer bir alternatif olabilir kullanılan
Potasyum KlorürSigmaP3911Aynı alternatif kullanılabilir
Sodyum BikarbonatSigmaS5761Aynı alternatif kullanılabilir
Sodyum KlorürSigmaS5886Aynı alternatif kullanılabilir
Stimülatör - Model Omnical 2010Dünya hassas aletleriOmnical 2010Benzer bir alternatif kullanılabilir
Triton X 100SigmaT8787Aynı alternatif kullanılabilir
Vibratom- Model #3000Pelco100-SBenzer bir alternatif kullanılabilir
Aynı kullanılabilir

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Khakh, B. S., Sofroniew, M. V. Diversity of astrocyte functions and phenotypes in neural circuits. Nature Neuroscience. 18 (7), 942-952 (2015).
  2. Ben Haim, L., Rowitch, D. H. Functional diversity of astrocytes in neural circuit regulation. Nature Reviews Neuroscience. 18 (1), 31-41 (2017).
  3. Schiweck, J., Eickholt, B. J., Murk, K. Important Shapeshifter: Mechanisms Allowing Astrocytes to Respond to the Changing Nervous System During Development, Injury and Disease. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 261(2018).
  4. Chai, H., et al. Neural Circuit-Specialized Astrocytes: Transcriptomic, Proteomic, Morphological, and Functional Evidence. Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).
  5. Sun, D., Jakobs, T. C. Structural remodeling of astrocytes in the injured CNS. Neuroscientist. 18 (6), 567-588 (2012).
  6. Naskar, S., Chattarji, S. Stress Elicits Contrasting Effects on the Structure and Number of Astrocytes in the Amygdala versus Hippocampus. eNeuro. 6 (1), (2019).
  7. Sun, D., Lye-Barthel, M., Masland, R. H., Jakobs, T. C. The morphology and spatial arrangement of astrocytes in the optic nerve head of the mouse. Journal of Comparative Neurology. 516 (1), 1-19 (2009).
  8. Grosche, A., et al. Versatile and simple approach to determine astrocyte territories in mouse neocortex and hippocampus. PLoS ONE. 8 (7), 69143(2013).
  9. Kaynig, V., et al. Large-scale automatic reconstruction of neuronal processes from electron microscopy images. Medical Image Analysis. 22 (1), 77-88 (2015).
  10. Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).
  11. Wilhelmsson, U., et al. Redefining the concept of reactive astrocytes as cells that remain within their unique domains upon reaction to injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17513-17518 (2006).
  12. Williams, M. E., et al. Cadherin-9 regulates synapse-specific differentiation in the developing hippocampus. Neuron. 71 (4), 640-655 (2011).
  13. Ogata, K., Kosaka, T. Structural and quantitative analysis of astrocytes in the mouse hippocampus. Neuroscience. 113 (1), 221-233 (2002).
  14. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  15. Hubbard, J. A., Hsu, M. S., Seldin, M. M., Binder, D. K. Expression of the Astrocyte Water Channel Aquaporin-4 in the Mouse Brain. ASN Neuro. 7 (5), (2015).
  16. Benediktsson, A. M., et al. Ballistic labeling and dynamic imaging of astrocytes in organotypic hippocampal slice cultures. Journal of Neuroscience Methods. 141 (1), 41-53 (2005).
  17. Fouquet, C., et al. Improving axial resolution in confocal microscopy with new high refractive index mounting media. PLoS ONE. 10 (3), 0121096(2015).
  18. Luna, G., et al. Astrocyte structural reactivity and plasticity in models of retinal detachment. Experimental Eye Research. 150, 4-21 (2016).
  19. Octeau, J. C., et al. An Optical Neuron-Astrocyte Proximity Assay at Synaptic Distance Scales. Neuron. 98 (1), 49-66 (2018).
  20. Sosunov, A. A., et al. Phenotypic heterogeneity and plasticity of isocortical and hippocampal astrocytes in the human brain. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2285-2298 (2014).
  21. Park, Y. M., et al. Astrocyte Specificity and Coverage of hGFAP-CreERT2 [Tg(GFAP-Cre/ERT2)13Kdmc] Mouse Line in Various Brain Regions. Experimental Neurobiology. 27 (6), 508-525 (2018).
  22. Koeppen, J., et al. Functional Consequences of Synapse Remodeling Following Astrocyte-Specific Regulation of Ephrin-B1 in the Adult Hippocampus. Journal of Neuroscience. 38 (25), 5710-5726 (2018).
  23. Jefferis, G. S., Livet, J. Sparse and combinatorial neuron labelling. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 101-110 (2012).
  24. Lanjakornsiripan, D., et al. Layer-specific morphological and molecular differences in neocortical astrocytes and their dependence on neuronal layers. Nature Communications. 9 (1), 1623(2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Konfokal MikroskopiFloresan Boya EnjeksiyonuBeyin Dokusu KesitiElektrot Haz rlamaBoyutlu Rekonstr ksiyonGlial Fibriler Asidik ProteinHipokampal AstrositlerMorfolojik Analiz

İlgili makaleler