Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Astrositlerde Organeller ve Diğer Kargoların Hücre İçi Taşınmasının Görselleştirilmesi ve Analizi

7.5K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/60230

⸱

28 Ağustos 2019

 ,  , 
1Department of Cell Biology and Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Burada, organellerin hücre içi naklini ve murine astrositlerinde plazma membran proteinlerinin ticaretini görselleştirmek için in vitro canlı görüntüleme yöntemini açıklıyoruz. Bu protokol aynı zamanda kargo taşımacılığı güzergahları ve kinetik belirlemek için bir görüntü analizi metodolojisi sunar.

Özet

Astrositler yetişkin beyninde en bol hücre tipleri arasında yer alır, onlar fonksiyonların çokluğu önemli rol oynarlar. Beyin homeostaz merkezi bir oyuncu olarak, astrositler hayati metabolitleri ve tampon ekstrasellüler su, iyonlar ve glutamat ile nöronkaynağı. "Üçlü" sinapsayrılmaz bir bileşeni olan astrositler, sinapsların oluşumunda, budamasında, bakımında ve modülasyonunda da önemlidir. Bu son derece etkileşimli fonksiyonları etkinleştirmek için, astrositler kendi aralarında ve diğer glial hücreler, nöronlar, beyin vaskülatürü ve hücre dışı çevre ile hücre içeren özel membran proteinleri çok sayıda iletişim yapışma molekülleri, aquaporinler, iyon kanalları, nörotransmitter taşıyıcılar ve boşluk bağlantı molekülleri. Bu dinamik akı desteklemek için, astrositler, nöronlar gibi, sıkı koordine ve verimli hücre içi taşıma güveniyor. Hücre içi ticaretin yaygın olarak açıklandığı nöronların aksine, astrositlerde mikrotübül bazlı ulaşım daha az çalışılmıştır. Bununla birlikte, hücre zarı proteinlerinin ekolog ve endositik ticareti ve hücre içi organel nakli astrositlerin normal biyolojisini düzenler ve bu süreçler genellikle hastalıktan veya yaralanmaya yanıt olarak etkilenir. Burada kültür yüksek kaliteli murine astrositler için basit bir protokol savuruyoruz, floresan astrositik proteinleri ve organelleri ilgi çekici olarak etiketlemek ve zaman atlamalı konfokal mikroskopi kullanarak hücre içi aktarım dinamiklerini kaydetmek için. Ayrıca, mevcut görüntü analiz yazılımlarını (imageJ/FIJI) eklentilerini kullanarak edinilen filmlerden ilgili taşıma parametrelerinin nasıl ayıklanıp ölçültüldünü de gösteriyoruz.

Giriş

Astrositler yetişkin merkezi sinir sisteminde en bol hücrelerdir, onlar benzersiz gelişimsel ve homeostatik fonksiyonları gerçekleştirmeknerede 1. Astrositler, nörotransmitter reseptörleri, taşıyıcılar ve sinaps oluşumunu kolaylaştıran hücre adezyon moleküllerini içeren üçlü sinapsların bir parçası olarak pre-ve postsinaptik terminallerle doğrudan temas yoluyla sinaptik gelişimi modüle eder. ve nöron-astrosit iletişimi2. Buna ek olarak, astrositler sinaptik iletimi aktif olarak kontrol eder ve sinaptik yarıktan çıkarıcı nörotransmitterleri hızla çıkararak nöronal eksitotoksisiteyi önler, nörotransmitterleri geri dönüştürer ve sinaptik budama dakatılır3 , 4.2.2 , 5.000 , 6. Bu son derece etkileşimli fonksiyonları etkinleştirmek için, astrositler kendi aralarında iletişim kurmak, diğer glial hücreleri ile, ve özel membran proteinleri aracılığıyla nöronlar ile, hücre adezyon molekülleri de dahil olmak üzere, aquaporins, iyon kanalları, nörotransmitter taşıyıcılar ve boşluk kavşak molekülleri. Astrositler, hücre içi ve hücre dışı ortamlarındaki dalgalanmalara yanıt olarak buproteinlerin yüzey düzeylerini aktif olarak değiştirirler 7. Ayrıca, astrosit fonksiyonu için gerekli olan mitokondri, lipid damlacıkları ve bozunatif ve geri dönüşüm organellerinin seviyelerinde ve dağılımındaki değişiklikler enerji arzını, metabolit kullanılabilirliğini ve hücresel temizleme süreçlerini modüle eder ve Hayatta kalma.

Membran protein ve organel ticareti ve astrositlerde konumlandırma dinamik değişiklikler motor proteinlerve adaptörlerin uyumlu fonksiyonu ile kolaylaştırılır kargo hareketliliği teşvik8,9. Benzer şekilde, membran proteinlerinin yüzey seviyeleri içselleştirme ve geri dönüşüm olayları ile modüle edilir10. Bu kargolar aktin, mikrotübüller ve muhtemelen ara filamentler parça karmaşık bir ağ üzerinden taşınır8. Büyüyen mikrotübül artı uçlarında biriken son bağlayıcı protein 1'in (EB1) immünororesans boyamasını temel alan çalışmalar, mikrotübüllerin astrosit demetlerinde perinükleustan dışarı yayılarak artı uçlarını çevre11. Ancak, canlı hücre görüntüleme kullanarak mikrotübüller ve diğer sitoskeletal elementlerin organizasyon ve polarite kapsamlı bir inceleme hala eksiktir. Organellerin ve membran proteinlerinin dinamiğinin altında yatan mekanizmaların çoğu nöronlarda ve diğer hücre tiplerinde kapsamlı bir şekilde incelenmekle birlikte, astrositlerde kargo hareketliliği daha az anlaşılmaktadır. Astrositlerde protein ve organel dağılımındaki değişiklikler hakkındaki mevcut bilgilerimizin çoğu, kargo dinamiklerinin hassas mekansal ve zamansal incelemesini engelleyen sabit preparatın geleneksel antikor bazlı etiketlemesini temel alıyor7, 12. Yıl.

Burada, yüksek saflıkta birincil fare astrosit kültürlerinde canlı görüntüleme için membran proteinleri ve organelleri etiketlemek için bir yöntem açıklıyoruz. Bu protokolü kullanarak, transfekte astrositlerde yeşil floresan proteinin (GFP) etiketli membran proteinlerinin dinamik lokalizasyonunu izlediğimiz, gap kavşak proteinconnexin 43 (Cx43-GFP) ve uyarıcı amino asit dahil olmak üzere örnekler salıyoruz. taşıyıcı 1 (EAAT1-GFP). Ayrıca asidik organelleri görselleştirmek ve canlı astrositlerde insan ticareti dinamiklerini takip etmek için floresan asiotropik prob kullanımını da tanımlıyoruz. Son olarak, tek tek kargolar için taşıma parametrelerini ayıklamak ve değerlendirmek için hızlandırılmış verilerin nasıl analiz edilebildiğini gösteriyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri Chapel Hill Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) Kuzey Carolina Üniversitesi onayı ile yapıldı.

1. Beyin diseksiyonu ve birincil fare astrositkültürü

NOT: Aşağıdaki protokol, McCarthy ve deVellis13,14,15tarafından geliştirilen orijinal prosedürü takip eden yayınlanmış yöntemlerden uyarlanmıştır. McCarthy/deVellis (MD) astrositlerinin karışık hücre kültürleri doğum sonrası 2−4 (P2−P4) fare kortekslerinden hazırlanır, anti-mitotik faktörle tedavi edilir ve nihai zenginleştirilmiş astrosit kültürünü ortaya çıkarmak için saflaştırılır. Her iki cinsten fare yavrularından dört korteks bir T75 doku kültürü şişesi kültürü oluşturmak için yeterlidir.

  1. T75 şişelerinin alt kısmını (%100 açılı boyun erişimi, 0,22 m hidrofobik havalandırmalı filtre kapağı) poli-D-lizin (0,1 M Tris tamponunda 1 mg/mL, pH 8,5) ve diseksiyon başlamadan önce 24 saat için 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
  2. Diseksiyon işlemine başlamadan önce, 37 °C'de usturit kültür medyasının (Dulbecco modifiye Eagle'S medium [DMEM] yüksek glikozu, %10 ısı-inaktive fetal sığır serumu, %1 penisilin/streptomisin) 37 °C'de sıcak 30 mL aliquot'u buzüzerinde %2,5 tripsin eritmesi. Ca2+ veya Mg2+olmadan Hank'in dengeli tuz çözeltisinin (HBSS) 6 mL'si ile dolu buz üzerinde iki kesme yemeği (60 mm çapında) hazırlayın.
  3. Her diseksiyonöncesinde ve arasında %70 etanolde tüm cerrahi aletleri (ince uçlu cımbız, makas diseksiyon, Vannas makas düz, Graefe kavisli uçlu) %70 etanol de dezenfekte edin.
  4. P2−P4 fare yavrularının baş ve boyunlarını %70 etanol ile püskürtün ve cerrahi makasla kafa larını keserek hızla ötenazi edin. Kafatası ortaya çıkarmak için kafa derisi boyunca ön orta hat kesi için bir posterior gerçekleştirin. Kafatasını boynundan buruna kadar dikkatlice kesin.
  5. Gözlere göre iki ek lateral kesi yapın. Ince uçlu cımbız kullanarak kafatası kapaklarını hafifçe yana çevirin. Beyni çıkarın ve Ca2+ veya Mg2+olmadan buz gibi HBSS ile dolu ilk kesişen tabağa yerleştirin. Çanak buz üzerinde tutun ve beyin geri kalanı hasat devam edin.
    NOT: Diseksiyon işleminin geri kalanını bir diseksiyon kapsamı altında gerçekleştirin.
  6. Vannas makas veya ince cımbız kullanarak koku ampulleri çıkarın (Şekil1Ai). Enine ve interhemisferik fissürlerin kesiştiği noktada ki kavisli uç forceps ile, nazikçe korteks ve diensefalon arasında kavisli uç forceps ikinci bir çift takın, yavaş yavaş geri kalanından serebral hemisfer ayırmak için çerseps açılması beyin (Şekil 1Aii,Aiii). İstenmeyen dokuyu çıkarın (Şekil 1Aiv).
  7. Her kortikal yarımküre için, dikkatle ince ucu cımbız ile menenjler kaldırın. İsteğe bağlı olarak, kortekslerden hipokampus kaldırın. İncelenmiş fare kortekslerini Ca2+ veya Mg2+ olmadan buz gibi HBSS ile dolu ikinci bir tabağa aktarın ve kalan beyinleri parçalarken buzüzerinde tutun.
    NOT: Sonraki adımları aseptik koşullar altında laminar akış kaputunda gerçekleştirin.
  8. İncelenmiş kortikleri steril keskin cerrahi makas veya neşter kullanarak küçük parçalara (yaklaşık 2−4 mm) kesin. İncelenen dokuyu enzim solüsyonu içeren 50 mL konik tüpe transfer edin (Ca2+ veya Mg2+olmadan 22,5 mL HBSS , 2,5 mL %2,5 tripsin). 37 °C'de 30 dk'da her 10 dakikada bir hafif inversiyon ile kuluçkaya yatırın.
  9. 5 dk için 300 x g santrifüj ile sindirilmiş doku toplamak ve dekantasyon (vakum aspiratör kullanmayın) ile enzim çözeltisi kaldırmak. 10 mL astrosit kültür ortamı ekleyin ve 10 mL serolojik pipet kullanarak çözeltiyi 20−30x pipetleyerek dokuyu tek hücrelere ayırın.
  10. Hücre kümelerini ve sindirilmemiş dokuyu en aza indirmek için hücre süspansiyonuna 70 μm'lik bir süzgeçten süzün. Temiz bir 50 mL konik tüp içinde filtrat toplamak ve astrosit kültür medya ile 20 mL toplam hacmi ayarlayın. Bu noktada, 10 μL'lik hücre süspansiyonunu 10 μL trypan mavisi ile karıştırarak kortikal dissosinasyonun etkinliğini değerlendirin ve hücreleri hemositometre ile sayın.
    NOT: Dört P2−P4 fare korteksinden bir preparat 10−15 x 106 tek hücre verir.
  11. T75 kültür şişelerinden poli-D-lizin kaplama çözeltisini aspire edin ve steril suyla iki kez yıkayın. Plaka 20 mL hücre süspansiyon ve inkübat 37 °C ve 5% CO2.

2. Astrosit kültürlerinin arıtMa ve sürdürülmesi

NOT: 37 °C'ye ısıtılan steril filtreli (0,22 μm filtre membranı) astrosit ortamı kullanarak laminar akış kaputunda aseptik koşullar altında tüm ortam değişikliklerini gerçekleştirin.

  1. Kaplamadan sonra hücre ortamını 48 saat değiştirin (gün in vitro 2, DIV2).
  2. DIV5'te, medyayı 10 μM sitozin arabinoside (AraC) ile desteklenen taze astrosit kültür ortamıile değiştirin.
    NOT: Bu adım, fibroblastlar ve diğer glial hücreler de dahil olmak üzere kirletici hücrelerin uzaklaştırılmasını kolaylaştırır. Daha uzun kuluçka süreleri astrosit canlılığını azaltacaktır.
  3. DIV7'de, arac olmadan astrosit kültür medyasını değiştirin ve kültür birleşimini her gün kontrol etmeye başlayın. Hücreler %80 birleştiğinde, her saflaştırılmış astrosit kültür şişesi için poli-D-lizin ve inkübat 37 °C'de en az 8 saat ila bir gecede iki-T75 şişekat.
  4. Ertesi gün, 37 °C orbital sallayarak inkübatör 30 dakika için 180 rpm kültür şişeleri sallayarak astrosit arınma başlar. Ortamı çıkarın ve taze astrosit kültür ortamı ile değiştirin. 37 °C orbital sallayarak inkübatör 6 saat için 240 rpm hücreleri çalkalayın. Prewarm 1x fosfat tamponlu salin (PBS), astrosit kültür ortamı ve %0.25 tripsin-EDTA için 37 °C 20−30 dk sallayarak dönemin bitiminden önce.
    NOT: Co2kuluçka sıkışma adımları sırasındagerekli değildir. İstenirse, 30-dk ve 6-h sallayarak adımlar sonra toplanan medya kültür microglia ve oligodendrocytes için kullanılabilir, sırasıyla. Karışık kültürün AraC tedavisi, ancak, diğer glial hücrelerin bolluğunu azaltacaktır.
  5. Kültür şişelerini çalkalayıcıdan çıkarın ve ortamı şişe başına 10 mL sıcak 1x PBS ile hemen değiştirin. PBS'yi çıkarın ve şişe başına %0,25 tripsin-EDTA 3 mL ekleyin. 37 °C ve %5 CO2'de kuluçkaya yatırın, her 5 dakikada bir müfreze için kontrol edin.
  6. Hücreler şişeden ayrıldıktan sonra, 10 mL astrosit kültür ortamı ekleyerek tripsinizasyonu durdurun. Müstakil astrositleri 5 00 mL konik tüp ve pelet hücrelerine 5 dk. Aspire süpernatant için 300 x g santrifüj ile aktarın ve astrosit kültür medyasının 40 mL'lik hücrelerini yeniden askıya alın.
  7. Poli-D-lizin kaplı T75 şişelerini steril su ve saflaştırılmış astrosit süspansiyonun 20 mL plakası ile iki kez yıkayın. 37 °C ve %5 CO2 kuluçka makinesine geri dönün. Astrositler olgunlanına kadar 10 gün boyunca her iki günde bir astrosit kültür medyasını değiştirin.
    NOT: Saflaştırılmış astrositlerin her T75 şişesi kaplama da 3 x 105 hücreleri ile 2 yeni T75 şişeleri üretmek için yeterli olmalıdır.
  8. Sonraki geçişler için veya mikroskopi için plaka astrositleri için 2.5−2.7 adımlarını tekrarlayın.
    NOT: AraC eklenmesi nden sonra astrosit kültürlerin saflığı ve arınma takibi brightfield mikroskobu ile niteliksel olarak veya glial fibrillary asit proteini (GFAP)-pozitif yüzdesi ölçülerek daha doğrusu değerlendirilebilir floresan görüntülerde görüş alanı başına hücreler (Şekil1B,C).

3. Floresan etiketli plazmidlerin transfeksiyonu

  1. Transfeksiyon veya etiketlemeden bir gün önce, 24−48 saat post-transfection görüntüleme için istenilen yoğunlukta tohum astrositleri. 24 kuyulu plakalar veya 14 mm cam alt kuyular için önerilen yoğunluk 2 x 104 hücre/kuyudur.
    NOT: Bu protokol, 12 mm cam kapaklı 12 mm cam kapaklı astrositlerin 24 kuyulu plakalar veya 14 mm cam alt kuyularda lipofection tabanlı bir yöntem kullanılarak transfeksiyonu için optimize edilebiyiz. Reaktifler astrositlerin yetiştikleri kültür yemeğinin büyüklüğüne bağlı olarak ölçeklendirilmelidir.
  2. Azaltılmış serum lu ortamda (MalzemeTablosu) lipofection reaktifini seyreltin. Lipofection reaktifinin DNA'ya oranını optimize etmek için, bir dizi yeterli seyreltme testi yapın. Örneğin, bu protokolde kullanılan reaktifikullanıyorsanız (Malzeme Tablosu), 50 μL azaltılmış serum lu ortamda lipofection reaktifinin 2, 3, 4 ve 5'li l'lerini seyreltin.
  3. Azaltılmış serum lu ortam250 μL'de 5 μg yüksek saflıkta DNA seyreltin. 5 μL lipofection arttırıcı reaktif (MalzemeTablosu)ekleyin. Lipofection reaktifini içeren tüpü DNA-lipofection arttırıcı karışımının eşit hacmiyle birleştirin. 15 dakika oda sıcaklığında (RT) pipetleme ve kuluçka ile karıştırın.
  4. Astrosit kültür ortamını kaldırın ve hücrelere transfeksiyon karışımı (adım 3.3) ekleyin. 37 °C ve %5 CO 2'de6 saatlik kuluçkadan sonra transfeksiyon kompleksini uygun bir astrosit kültür ortamı hacmiyle (14 mm cam alt tabaklar için 2 mL) değiştirin. Görüntü edinimi devam etmeden önce ek bir 24−72 saat için kuluçka. Protein ekspresyonu ve hücre canlılığı arasında en iyi dengeyi sağlamak için kuluçka adımının süresini yakından izleyin.

4. Floresan problar kullanılarak geç endozomların/lyzozomların etiketlemi

NOT: Bazı kargolar floresan boyalar kullanılarak etiketlenebilir ve kargoya özgü proteinlere karşı yüksek afiyetlidir. Aşağıdaki örnek, geç endozomların/lyzozomların floresan asidozotropik probu ile etiketlenmesine izin verir.

  1. Astrosit kültür medyasının 200μL'lik lysosomal etiketleme sondasını (Malzeme Tablosu) 1 μM'lik bir çalışma konsantrasyonuna seyreltin ve 2 x 104 hücre/kuyu yoğunluğunda 3.1'den itibaren astrositlere uygulayın. 37 °C'de 30 dk kuluçka.
  2. Hücreleri sıcak astrosit kültür ortamıyla bir kezyıkayın ve görüntüleme ortamı (Tablo Malzemeler) ile değiştirin. Hemen canlı görüntülemeye geçin.

5. Hızlandırılmış görüntüleme sistemi kullanarak görüntü edinimi

NOT: Hızlandırılmış canlı görüntüleme, yüksek hızlı kamera, kesin odaklama, kuluçka odası ve yüksek sayısal diyafram açıklığına sahip 40x yağ hedefi (örneğin, Plan-Apochromat 1.4NA) ile donatılmış floresan mikroskobu kullanılarak yapılmalıdır. Hızlandırılmış görüntüleme için çeşitli satın alma yazılımları mevcuttur. Mikroskopi sistemi ve satın alma yazılımının seçimi, belirli bir çalışmanın amaçlarına uygunluk ve kullanılabilirlik lerine dayanmalıdır. Bazı genel yönergeler aşağıda verilmiştir.

  1. Kültür odasını veya kabını mikroskop aşamasında uygun adaptöre yerleştirin. Epifloresan ışığını kullanarak, floresan proteinleri ifade eden hücre(ler)'i veya kaydetmek için sondayı seçin. Dijital kamerayı kullanarak seçili hücreyi görselleştirmek için floresan örnek aydınlatmayı ayarlayın. Fotobeyaztasyon ve fototoksisiteye neden olabilecek yüksek aydınlatma kullanmaktan kaçının. Odak ve yakınlaştırmayı ayarlayın.
  2. Zum ve kesin odaklama işlevlerini kullanarak 300 s ile 500 s arasında değişen zaman aralıkları için her 2 s'de 1 karelik bir frekansta tek z-stack zaman atlamalı seri elde edin.
    NOT: Kaçakçılık dinamiği (hız, hareket sıklığı, vb.) ilginin proteinine bağlı olarak değişir, bu nedenle edinme süresi nin ayarlanması gerekebilir. Örneğin, mitokondri lizozomlar daha az hareketli ve sık duraklamalar sergilemek. Bu durumda, edinme parametrelerini 800 s için her 5 s'de 1 kare olarak ayarlamak daha uygundur.
  3. Hızlandırılmış görüntüleri kaydedin ve bunları AVI veya TIFF yığın dosyaları olarak dışa aktarın.

6. Görüntü analizi

NOT: ImageJ/Fiji16için KymoToolBox eklentisi kullanılarak görüntü analizi yapıldı. Ayrıntılı adım adım yazılı talimatlar online17mevcuttur. Aşağıdaki kısaltılmış adımlar kymographs oluşturmak ve parçacık taşıma parametrelerini ayıklamak için yeterli olmalıdır.

  1. ImageJ/Fiji yazılımında hızlandırılmış görüntü dizisini açın. Dosya menüsünden görüntüleri AVI veya TIFF yığın dosyaları olarak aktarın. Resim menüsünden Tür aracını kullanarak bu görüntü türlerinden birini seçerek görüntüleri 8 bit veya 16-bit'e dönüştürün. RGB dosyalarıyla çalışıyorsanız, Görüntü menüsündeki Renk özelliği nin altında bulunan Split Channel aracını kullanarak kanalları bölün.
  2. Bir kymograph (parçacık yörüngelerinin konumu ve zamanı temsili) oluşturmak için, parçacıklar segmentli çizgi aracını kullanarak parçacıkların yörüngeleri boyunca bir çizgi izleyerek hareket eden her parça çizin. Hareketin yönünü doğru bir şekilde atamak için, incelenen tüm hücrelerde ve tüm hücrelerde polaritenin tutarlı olması için tüm filmler için aynı istenilen yön kuralını kullanarak poliline çizin. Örneğin, hücrenin merkezinden çevreye doğru poliline çizin veya tam tersi. Çizgi aracını çift tıklatarak çizgi genişliğini parçanın kalınlığıyla eşleşecek şekilde ayarlayın.
  3. 10 çizgi genişliği kullanarak KymoToolBox eklentisinin Draw Kymo makroçalıştırın. Görüntüyü zaman (kare sayısı, kare hızı) ve boşluk (x,y çözünürlüğü) olarak kalibre etmek isteyen bir istem görüntülenir. Kalibre edildikten sonra, kymographs oluşturulur ve veri sunumu veya daha fazla parçacık analizi için TIFF dosyaları olarak kaydedilebilir.
  4. Kazanım boyunca segmentli çizgi aracını kullanarak kymograph'taki her parçacığı el ile izleyerek parçacık yörüngelerini atayın. Çözümleme/Araçlar menüsünde bulunan YG yöneticisi aracını kullanarak her parçacık yörüngesini ilgi alanı (YG) olarak kaydedin. Daha fazla analiz için her hızlandırılmış video başına tüm ROI'ları kaydedin.
    NOT: Taşıma parametrelerinin en doğru hesaplanmasını sağlamak için mimografüzerindeki tek tek parçacıklar için doğru yörüngenin ataması çok önemlidir.
    1. KymoToolBox eklentisinin Analiz Kymo makroçalıştırın. Açılan menüden parçacık hareketinin "dışa doğru" yönünü (soldan sağa veya tam tersi) tanımlamak isteyen bir pencere açılır. Bu seçim, 6.2 adımda belirtildiği gibi, çekirdek veya hücre çevresine göre görüntülenen floresan kargoların konumuna bağlıdır. Örneğin, çekirdek kargoların soluna yerleştirilmişse ve 6.2.
    2. Analiz Kymo penceresinde limit hızını (bir kargonun hareketli olarak kabul edildiği minimum hız) tanımlayın. Hızlı hücre içi taşıma hızlarında hareket eden kargolar için 0,1 m/saniye uygun bir seçimdir. Yazılımın ilgi çeken her kargoya karşı hassasiyetini ayarlamak için bu değeri değiştirin. Çizgi genişliğini her parçacık yörüngesinin kalınlığıyla eşleşecek şekilde ayarlayın.
    3. Tüm verileri Günlüğe kaydedin ve Kymo'yu Analiz Et penceresinde ekstrapolated koordinat seçeneklerini kaydedin. Bu, ortalama hız, içe doğru hız, dışa doğru hız, seyahat edilen kümülatif mesafe, içe veya dışa doğru seyahat edilen mesafe, her parçacık için anahtar sayısı, zaman yüzdesi dahil olmak üzere çeşitli kargo taşıma parametrelerini hesaplar her yönde hareket eden veya duraklatılmış, vb. Tek tek parçalar için hesaplanan veriler daha sonra kymograph başına biraraya gelir ve her görüntüye özgü metin dosyalarına kaydedilir.
      NOT: Analyze Kymo makro'nun Renkli Kymo göster seçeneği, orijinal kymograph üzerinde yolun renk kodlu bir bindirmesini oluşturur. Dışa doğru hareket eden parçacıklar yeşil, içe doğru kırmızı ve sabit parçacıklar mavi renkterendir. Analiz Kymo makrosunorijinal Yığın da Rapor Koordinatları, tahmin edilen nesnenin orijinal hızlandırılmış video ve kymograph üzerindeki konumunun renk kodlu bir bindirmesini oluşturur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Yukarıda özetlenen birincil fare MD astrositleri oluşturmak için protokol tekrarlanabilir, yüksek kaliteli kültürler vermelidir. Kültürler başlangıçta astrositler, fibroblastlar ve mikroglia ve oligodendrositler (Şekil1Bi,Biv; kırmızı ok başları) dahil olmak üzere diğer glial hücrelerin bir karışımını içermesine rağmen, ARAC'nin DIV5-DIV7 arasındaki karışık kültüre eklenmesi en aza indirgenmiştir. bu kirletici hücrelerin çoğalması. Kombine AraC tedavi ve sallayarak tabanlı a...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada, yüksek saflıkta birincil fare kortikal MD astrositlerinde hızlandırılmış video mikroskobu kullanarak floresan etiketli organelleri ve membran proteinlerini ifade etmek, görselleştirmek ve izlemek için deneysel bir yaklaşımı tanımlıyoruz. Ayrıca parçacık dinamiklerini ölçmek için bir metodoloji anahat. Birincil astrositlerde protein ve organel dinamiğinin doğrudan görselleştirilmesi, bu hücrelerde hücre içi taşımanın düzenlenmesini in vitro olarak incelemek için güçlü bir araç sağlar.

F...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

DNL, Kuzey Carolina Üniversitesi tarafından Chapel Hill (UNC) Tıp Fakültesi'nde Simmons Bursu ile desteklenmiştir. TWR UNC PREP Grant R25 GM089569 tarafından desteklenmiştir. UNC Nörobilim Merkezi Mikroskobu Çekirdek Tesisi'ni kullanan çalışmalar kısmen NIH-NINDS Nörobilim Merkezi Destek Desteği P30 NS045892 ve NIH-NICHD Entelektüel ve Gelişimsel Engelliler Araştırma Merkezi Destek Destek U54 tarafından desteklendi. HD079124.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 2.5 Tripsin (10x)Gibco15090-046
Masaüstü SantrifüjThermo Scientific75-203-637Sorvall ST8 Santrifüj
Hücre Kültürü Sınıfı SuGen Klonu25-511
Hücre Kültürü MikroskobuZeissWSN-AXIOVERT A1Vert.A1 ters çevrilmiş kapsam, Floresan özellikli
ters doku kültürü mikroskobuSitozin ArabinosideSigmaC1768-100MG(AraC) Liyofilize tozu steril hücre kültürü dereceli suda çözün, 10mM stok yapın, uzun süreli depolama için alikot yapın ve dondurun
DAPISigmaD9542-5MGLiyofilize tozu deiyonize suda maksimum 20 mg / ml konsantrasyona kadar çözün, gerektiği gibi ısıtın veya sonikat. Karşı boyama için 300 nM'de kullanın.
Diseksiyon MikroskobuZeissStemi 305
Diseksiyon MakasıFST14558-09
Dulbecco'nun Modifiye Eagle OrtaGen Klonu25-500
Fetal Sığır Serumuİkizler100-106Isıyla İnaktive Edilmiş
FIJI (Fiji Sadece Resim J)NIHSürüm 1.52i
İnce Uçlu CımbızFST11254-20Stil # 5
Floresan ışık kaynağıExcelitas012-63000X-Cite 120Q
GFAP antikoruHücre Sinyali3670SGFAP (GA5) fare monoklonal antikoru
Cam Alt TabaklarMattek şirketiP35G-1.5-14-C35 mm Çanak | No. 1.5 Lamel | 14 mm Cam Çapı | Kaplamasız
Graefe ForsepsFST11054-10Graefe Iris Forseps Kavisli uçlu
Yeşil floresan boya, asidik bölmeleri lekeleyen yeşil floresan boya (geç endozomlar ve lizozomlar)Life TechnologiesL7526LysoTracker Green DND 26. DMSOS içinde 1mM'lik bir stok çözeltisine önceden çözülür. Büyüme ortamındaki veya tercih edilen tampondaki nihai çalışma konsantrasyonuna kadar seyreltin.
Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (10x)Gibco14065-056Magnezyum ve kalsiyum içermez
Görüntüleme OrtamıYaşam TeknolojileriA14291DJCanlı Hücre Görüntüleme
Solüsyonu Ters Konfokal MikroskopZeissLSM 780
KymoToolBoxhttps://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox
Lipofeksiyon Arttırıcı ReaktifYaşam Teknolojileri11514015Plus Reaktif
Lipofeksiyon ReaktifiLife Technologies15338100Lipofektamin LTX reaktifi
Orbital sallama inkübatörüNew Brunswick Scientific8261-30-1008Innova 4230 , sıcaklık ve hız kontrollü orbital sallama inkübatörü
Penisilin / Strepomycin çözeltisi (100x)Gen Clone25-512
Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (10x)Gen Klonu25-507x
Poli-D-Lizin HidrobromürSigmaP7405Tris tamponunda, pH 8.5, 1mg / mL'de çözülür. Uzun süreli depolama için dondurun. Donma ve çözülme döngülerinden kaçının
Azaltılmış serum ortamıGibco31985-062OPTI-MEM
Doku Kültürü ŞişeleriOlympus Plastics25-20975 cm^2. % 100 açılı boyun erişimi, 0.22um hidrofobik havalandırmalı filtre kapağı
Doku kültürü inkübatörüThermo Scientific51030285HERAcell VIOS 160i, sıcaklık, nem ve CO2 kontrollü
doku kültürü inkübatörüTris-BaseSigmaT15038.402 g 4.829 g Tris HCl ile suda bir litreye çözülerek 0.1 M Tris tamponu yapılır, pH 8.5
Tris-HClSigmaT32534.829 g 8.402 g Tris Baz ile suda bir litreye çözülür 0.1 M Tris tamponu, pH 8.5
Tripsin-EDTA (%0.25), fenol kırmızısıGibco25200072
Vakumlu Filtre SistemleriOlympus Plastics25-227500 ml, PES zarı, 0.22 & m
Vannas makas düzRobozRS-5620

Kaynaklar

  1. Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
  2. Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner. Trends in Neurosciences. 22 (5), 208-215 (1999).
  3. Zuchero, J. B., Barres, B. A. Glia in mammalian development and disease. Development. 142 (22), 3805-3809 (2015).
  4. Allaman, I., Bélanger, M., Magistretti, P. J. Astrocyte-neuron metabolic relationships: for better and for worse. Trends in Neurosciences. 34 (2), 76-87 (2011).
  5. Chung, W. S., Barres, B. A. The role of glial cells in synapse elimination. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 438-445 (2012).
  6. Chung, W. S., Allen, N. J., Eroglu, C. Astrocytes Control Synapse Formation, Function, and Elimination. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), 020370(2015).
  7. Shin, J. W., et al. Distribution of glutamate transporter GLAST in membranes of cultured astrocytes in the presence of glutamate transport substrates and ATP. Neurochemistry Research. 34 (10), 1758-1766 (2009).
  8. Potokar, M., et al. Cytoskeleton and vesicle mobility in astrocytes. Traffic. 8 (1), 12-20 (2007).
  9. Potokar, M., et al. Regulation of AQP4 surface expression via vesicle mobility in astrocytes. Glia. 61 (6), 917-928 (2013).
  10. Potokar, M., Lacovich, V., Chowdhury, H. H., Kreft, M., Zorec, R. Rab4 and Rab5 GTPase are required for directional mobility of endocytic vesicles in astrocytes. Glia. 60 (4), 594-604 (2012).
  11. Chiu, C. T., et al. HYS-32-Induced Microtubule Catastrophes in Rat Astrocytes Involves the PI3K-GSK3beta Signaling Pathway. PLoS ONE. 10 (5), 0126217(2015).
  12. Basu, R., Bose, A., Thomas, D., Das Sarma, J. Microtubule-assisted altered trafficking of astrocytic gap junction protein connexin 43 is associated with depletion of connexin 47 during mouse hepatitis virus infection. Journal of Biological Chemistry. 292 (36), 14747-14763 (2017).
  13. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visual Experiments. (71), e50079(2013).
  14. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).
  15. Tedeschi, B., Barrett, J. N., Keane, R. W. Astrocytes produce interferon that enhances the expression of H-2 antigens on a subpopulation of brain cells. The Journal of Cell Biology. 102 (6), 2244-2253 (1986).
  16. Zala, D., et al. Vesicular glycolysis provides on-board energy for fast axonal transport. Cell. 152 (3), 479-491 (2013).
  17. Cordelières, F. P. IJ KymoToolBox. , Available from: https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Astrosit K lt rKonfokal MikroskopiZaman At ml G r nt lemeKimograf AnaliziOrganel TakibiFloresan aretlemeImageJ AnaliziLizozomal ProblarLipofeksiyon Transfeksiyonu
Astrositlerde Organeller ve Diğer Kargoların Hücre İçi Taşınmasının Görselleştirilmesi ve Analizi
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.