Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Mitotik Mil Pertürbasyonları Sonrası Metafaz Zamanlaması ve Hücre KaderiniN Dinamiği Nin Dinamiği Nin Dinamitini Değerlendirmek Için Canlı Hücre Görüntülemesi

8K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/60255

⸱

20 Eylül 2019

 ,  , 
1Department of Biology and Biotechnology, Worcester Polytechnic Institute

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Burada mil oluşumu ve mitotik progresyon dinamiklerini değerlendirmek için bir protokol sıyoruz. Hızlandırılmış görüntüleme uygulamamız, kullanıcının mitozbölünmenin çeşitli aşamalarındaki hücreleri belirlemesini, mitotik defektleri izlemesini ve tanımlamasını ve anti-mitotik ilaçlara maruz kalındığında mil dinamiği ve mitotik hücre kaderini analiz etmesini sağlar.

Özet

Canlı hücre zaman atlamalı görüntüleme, hücre biyolojisinde, sabit hücre analizi yle gözden kaçmış, yanlış anlaşılabilecek veya yanlış yorumlanabilecek hücresel süreçler hakkında bilgi sağlayan önemli bir araçtır. Sabit hücre görüntüleme ve analizi sağlam ve hücresel sabit durumu gözlemlemek için yeterli olmakla birlikte, hücresel düzeyde olayların zamansal bir sıratanımlayan sınırlı olabilir ve dahil olmak üzere dinamik süreçlerin geçici doğasını değerlendirmek için yetersiz donanımlı mitotik ilerleme. Buna karşılık, canlı hücre görüntüleme zaman içinde tek hücre düzeyinde hücresel süreçleri gözlemlemek için kullanılabilir ve aksi takdirde sabit hücre görüntüleme kötü temsil edilecek süreçlerin dinamiklerini yakalamak için kapasiteye sahip anlamlı bir araçtır. Burada, kromatin ve mikrotübüllerin floresan etiketli belirteçlerini taşıyan hücreler ve bunların metafaz kromozom hizasını ve mitotik çıkışı izlemek için canlı hücre görüntüleme yaklaşımlarında kullanılmasına yönelik bir yaklaşım açıklıyoruz. Mitoz bölünmede çeşitli evrelerde hücrelerin tanımlanması, mitotik defektlerin tanımlanması ve izlenmesi, mil dinamiğinin analizi ve mitotik inhibitörleri ile tedavi sonrasında mitotik hücre kaderi.

Giriş

Sabit hücrelerin görüntü tabanlı analizi genellikle çeşitli tedirginliklere yanıt olarak hücre popülasyon düzeyi değişikliklerini değerlendirmek için kullanılır. Hücre senkronizasyonu ile birleştirildiğinde, seri zaman noktalarının toplanması ve görüntülenmesi takip edildiğinde, bu tür yaklaşımlar olayların hücresel bir dizi önermek için kullanılabilir. Bununla birlikte, sabit hücre görüntüleme zamansal ilişkiler bir nüfus için ima ve bireysel hücrelerin düzeyinde gösterilmiştir sınırlıdır. Bu şekilde, sabit hücre görüntüleme ve analizi sağlam fenotipleri ve sabit durum değişikliklerini gözlemlemek için yeterli olmakla birlikte, zaman içinde geçici değişiklikleri algılama ve hücrelerin sadece bir alt popülasyonunu etkileyen değişiklikleri algılama yeteneği kusurludur. Buna karşılık, canlı hücre görüntüleme tek bir hücre içinde hücresel ve hücre altı süreçleri gözlemlemek için kullanılabilecek anlamlı bir araçtır, ya da hücresel nüfus, zaman içinde ve kendilerini hücresel davranışı etkileyebilir senkronizasyon yaklaşımları yardımı olmadan 1.1.2 , 2.000 , 3.2.2 , 4.2.2 , 5.000 , 6 .

Bipolar mitotik mil oluşumu hücre bölünmesi sırasında uygun kromozom ayrımı için gereklidir, iki genetik olarak özdeş kız hücreleri sonuçlanan. Mitotik mil yapısındaki, mitotik progresyonun bozulmasıve kromozom ayrımının doğruluğunu tehlikeye sokan kusurlar, hücre bölünmelerinin azalmasına ve hücre canlılığının azalmasına neden olabilir. Bu nedenle, mil oluşumunu değiştirmek mitotik zehirler kanser hücrelerinin hızlı çoğalmasını sınırlamak için umut verici terapötik ler vardır7,8,9. Bununla birlikte, mitotik zehirlerin eklenmesinden sonra mil yapısının sabit hücre analizi, mil oluşumunun dinamik sürecini değerlendirme yeteneği ile sınırlıdır ve mil yapısında gözlenen değişikliklerin kalıcı olup olmadığını veya bunun yerine geçici ve başarılı hücre bölünmesi izin üstesinden gelebilir.

Bu protokolde, canlı hücre görüntüleme ile mil pertürbasyonlarını takiben mitoz dinamiklerini değerlendirmek için bir yaklaşım açıklıyoruz. Mikrotübülleri görselleştirmek için EGFP etiketli α-tubulin ile birlikte, mikrotübülleri görselleştirmek için RFP etiketli Histon 2B'yi ifade etmek üzere tasarlanmış hTERT ölümsüzleştirilmiş RPE-1 hücre hattını kullanarak metafaz kromozom hizalamasının zamanlaması, anafaz başlangıcı ve nihayetinde mitotik hücre kaderi kromozom hareketi, sıkıştırma ve nükleer morfolojigörsel ipuçları kullanılarak değerlendirilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. RFP-Histon 2B (RFP-H2B) ve α-tubulin-EGFP (tub-EGFP) ifade eden hTERT-RPE-1 hücrelerinin üretimi

NOT: Tüm adımlar aseptik teknikleri takip eder ve biyogüvenlik seviyesi II+ (BSL2+) güvenlik kabininde gerçekleşir.

  1. 293T hücrelerinin uygun lentiviral plazmidlerle lipid bazlı transfeksiyon dağıtım sisteminin üretici talimatlarına göre transfeksiyonu ile ilgi genlerini (α-tubulin-EGFP ve RFP-H2B) taşıyan retrovirüs üretin.
    1. 1. Gün: Hücre kültürünün orta sını alt-confluent 293T hücrelerinden aspire etmek için tek kullanımlık cam Pasteur pipetkullanın ve 5 mL PBS ekleyerek artık orta sıyrıklı salin (PBS) ile artık ortayı yıkayın. PBS'yi plaka alt kısmında dağıtmak için girdap, ardından PBS'yi steril tek kullanımlık cam Pasteur pipetiyle aspire edin.
    2. 37 °C'ye önceden ısıtılmış 2 mL 0,05 tripsin ekleyin ve kabı 37 °C'de %5 CO2 ile 2 ila 5 dk boyunca nemlendirilmiş bir kuluçka makinesine geri getirin ve yapışık hücrelerin hücre kültürü yüzeyinden salınmasını bekleyin.
    3. Tripsin içeren tabağa %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisilin/streptomisin ile desteklenen 8 mL taze Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortası (DMEM) ekleyin.
    4. Hücreleri hafifçe boruhaline vererek yeniden askıya alın ve süspansiyonu steril 15 mL konik bir tüpe aktarın. Konik tüpü dengeli bir santrifüje yerleştirin ve hücreleri yavaşça peletlemek için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 161 x g'de döndürün.
    5. DMEM'in 10 mL'sinde peletli hücrelerden orta/tripsin çözeltisini aspire edin ve %10 FBS ve %1 penisilin/streptomisin ile desteklendi. 293T hücre süspansiyonu ve 6 kuyu plakasının kuyusu başına 2 x 106 293T hücreleri saymak için hemositometre kullanın.
    6. Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta (DMEM) toplam hacmi 2 mL kültür hücreleri% 10 fetal sığır serum (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin ile takviye ve% 5 CO2ile 37 °C nemlendirilmiş bir kuvöz de korumak .
    7. 2. Gün: Pipet 7 μL lipid bazlı transfeksiyon dağıtım reaktifi ve 100 μL azaltılmış serum ortamı 1,5 mL mikrosantrifüj tüpiçine ve oda sıcaklığında 5 dakika (tüp #1) kuluçkaya yatmaktadır.
    8. Ayrı bir 1,5 mL mikrosentrifüge tüpte, pipet 1 μg RFP-H2B ifade vektörü (veya 1 μg α-tubulin-EGFP ifade vektörü), 5 μL arttırıcı reaktifi (üreticinin yönergelerine göre gerekli olduğu gibi), 0,5 μg pMD2.G ve 1 μg psPAX2 ve 100 μL azaltılmış serum orta (tüp #2).
    9. Adım 1.1.7 ve adım 1.1.8 içeriğini dikkatlice tüp #1 içine tüp #2 boru ve oda sıcaklığında 20 dakika kuluçka boru ile birleştirin.
      NOT: Reaksiyon ek kuyularda hücrelerin transfeksiyonu için gerektiği gibi ölçeklenebilir.
    10. Pipet transfeksiyon reaksiyonu istenilen kuyuya 2 mL orta 293T hücreleri içeren damla ve 37 °C'de % 5 CO2ile nemlendirilmiş kuvöze çanak geri dönün.
      NOT: Hem RFP-H2B hem de α-tubulin-EGFP ifade eden hücreler oluşturmak için her ifade yapısı için ayrı virüs oluşturur (adım 1.1.7- 1.1.9).
    11. 3. Gün: Orta yı %10 FBS ve %1 penisilin/streptomisin ile takviye edilmiş 2 mL taze DMEM ile değiştirin. Yemeği %5 CO2ile 37 °C'de nemlendirilmiş kuluçka makinesine geri döndürün.
  2. 4. Gün: 293T hücrelerini bozmamak veya çıkarmamak için dikkatli davranarak ifade edilen virüs parçacıklarını içeren ortamı toplayın. Virüs partikülleri içeren ortamı, 5 mL'lik bir şırıngaya bağlı 0,45 μM'lik bir filtreden geçirerek filtreleyin. Aliquot virüsü 4 °C'de kısa süreli depolama için veya -80 °C'de uzun süreli depolama için.
    NOT: Bu şekilde elde edilen viral parçacıklar ~1 x 107 ila 1 x 108 Transducing Birimleri/mL aralığında bulunacaktır. Enfekte edilecek viral üreten hücreler ve hücreler aynı ortamda kültürlendirildik, ortamın yerini almak için viral konsantrasyon gerekli değildir ve filtrelenmiş viral partiküller doğrudan hücreleri enfekte etmek için kullanılabilir.
  3. Tohum 2 x 105 hTERT-RPE-1 hücreleri viral enfeksiyon için hazırlık 6-iyi çanak iyi başına. DMEM'in 2 mL'lik kültür hücreleri %10 FBS ve %1 penisilin/streptomisin ile desteklenir ve %5 CO2ile 37 °C'de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde muhafaza edilir.
  4. 5. Gün: HTERT-RPE-1 hücrelerine hexadimethrine bromür (örn. polibren) ekleyin ve 8 μg/mL'lik son konsantrasyona ekleyin. Hücre kültürü ortamının 500 μL'sinde seyreltilmiş 500 μL'lik bir virüs karışımı ile hücreleri enfekte edin.
    NOT: Hexadimethrine bromür çözeltisi steril distile suda hazırlanır ve 0,45 μm filtreden geçirilir.
  5. 6. Gün: Tek kullanımlık cam pasteur pipet kullanarak, virüs enfekte hücreleri içeren kuyulardan orta aspire. Hücre kültürü ortamını %10 FBS, %1 penisilin/streptomisin içeren 2 mL DMEM ve plazmid entegrasyonu ve ekspresyonu için uygun antibiyotik konsantrasyonları ile değiştirin.
    NOT: Açıklanan deneylerde kullanılan α-tubulin-EGFP ekspresyonu plazmidpuromisin direnci geni, RFP-H2B ekspresyonu plazmid ise blastisdin direnci geni taşır. Bu nedenle α-tubulin-EGFP, RFP-H2B ve hTERT RPE-1 hücrelerinin seçiminde 10 μg/mL puromisin ve 2 μg/mL blasticidin kullanılır. Seçim için kullanılan antibiyotik konsantrasyonları kullanılan çeşitli hücre hatları için farklı olabilir.
  6. 5-7 gün antibiyotik seçimi altında hücreleri korumak, uygun seçim reaktifler içeren taze orta ile her 3 günde bir orta değiştirerek.
    NOT: Hücreler seçim sırasında alt kesişme noktasında tutulmalıdır ve 1.1.1 ile 1.1.4 adımlarında açıklandığı gibi gerektiğinde genişletilmelidir.
  7. Etiketli yapılar ifade onaylamak için immünofloresan görüntüleme kullanın.
    NOT: İstenirse, hücre popülasyonu içinde tek tip ifade düzeylerini elde etmek için tek hücreli klonlar türetilebilir. Bir kez istikrarlı klonlar teyit edilir, hücreler antibiyotik seçimi yokluğunda standart kültür koşulları altında muhafaza edilebilir.

2. Mitotik mil tedirginlikleri sonrasında canlı hücre görüntülemesi için hücrelerin hazırlanması

NOT: Aseptik teknikleri kullanın ve bir BSL2 güvenlik kabininde adımları gerçekleştirin.

  1. Steril tek kullanımlık cam Pasteur pipeti kullanarak, yapı(lar) ifadesini taşıyan hücre hattını içeren kültür plakasından ortayı aspire edin (adım 1.7'den). Hücreleri 10 mL steril PBS ile kısaca yıkayın. PBS'yi plaka alt kısmında dağıtmak için girdap, ardından pbs'yi steril tek kullanımlık cam Pasteur pipetiyle aspire edin.
  2. 10 cm plakaya %0,05 tripsin 2 mL ekleyin. Plakayı 37 °C'de 2-5 dakika veya hücreler plaka yüzeyinden ayrılana kadar kuluçkaya yatırın.
  3. Tripsin içeren tabağa 8 mL taze orta ekleyin. Hücreleri hafifçe boruhaline vererek yeniden askıya alın ve süspansiyonu steril 15 mL konik bir tüpe aktarın. Konik tüpü dengeli bir santrifüje yerleştirin ve hücreleri yavaşça peletlemek için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 161 x g'de döndürün.
  4. 10 mL serolojik pipetle hafifçe boru haline vererek 10 mL PBS'de süpernatantı dikkatlice aspire edin ve yeniden askıya alın. Konik tüpü dengeli bir santrifüje yerleştirin ve hücreleri yavaşça peletlemek için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 161 x g'de döndürün.
  5. Supernatant'ı dikkatlice aspire edin ve 10 mL serolojik pipetle hafifçe boru haline vererek taze ortamın 10 mL'inde yeniden askıya alın.
  6. Hücreleri sayın, daha sonra bir hemacytometer kullanarak hücre numarasını hesaplayın ve hücre kültürü ortamda 1-2 x 105 hücre/mL konsantrasyonuna seyreltin. Steril 12 kuyulu bir alt plakanın her kuyuya hücre süspansiyonunun 500°L'sini tohumlayın. Plakayı hücre kültürü kuluçka makinesine yerleştirin ve hücrelerin plaka yüzeyine yapışmasını bekleyin.
    NOT: Canlı hücre görüntüleme, hücrelerin görüntü edinimi sırasında görüntüleme düzlemi ile ilişkili kalması için iyi yapışmasını gerektirir. Kaplamayı takiben hücrelerin yapışması için gereken süre bir hücre hattından diğerine farklılık görebilir ve çalışılan hücre hattı için optimize edilmelidir.
  7. Hızlandırılmış görüntülemeyi başlatmadan önce 30 dakikaya kadar, hücrelerle tohumlanan kuyulardan birine veya daha fazlasına ilgili bir mitotik ilaç konsantrasyonu ekleyin. Organik çözücünün hücresel davranış üzerindeki potansiyel etkisini hesaba katmak için, inhibitörün dilüentinin eşit hacimli liğini kontrol olarak hücrelere ekleyin. Örneğin, mitotik kiaz Aurora A'nın spesifik inhibitörüolan 100 nM'nin eklenmesinin hücrelerin kontrol kuyusu olan bu ilacın dilüenti olan DMSO'nun eşit hacmiyle paralel olduğundan emin olun.
    NOT: Mitotik progresyondaki dinamik değişikliklerin karşılaştırmalı analizi, deneysel koşullara paralel olarak normal mitozların görüntülenebilmesi için pertürbasyonların yokluğunda hazırlanacak hücre kuyularının hazırlanmasını gerektirir.

3. Mikroskop, RFP-H2B, α-tubulin-GFP ifade eden hücrelerin hızlandırılmış görüntülemesi için ayarlanmıştır (Şekil 1, Şekil 2)

  1. RFP-H2B, α-tubulin-GFP içeren hücre kültür plakasını, hTERT RPE-1 hücrelerini ifade eden hücre kültür plakasını, yüksek çözünürlüklü bir kamera (piksel boyutu 20x) ile donatılmış ters epifloresan mikroskopüzerinde uygun bir aşama kesici uçta görüntülenecek şekilde yerleştirin. 37 °C'ye kadar önceden ısıtılmış çevre odası ve nemlendirilmiş %5 CO2için bir dağıtım sistemi.
    NOT: Kapalı çevre odaları veya sıcaklık kontrollü sahne uçları, nemlendirilmiş %5 CO2'nin teslim edilmesi ve stabil sıcaklık kontrolü sağlanması koşuluyla uygun olabilir.
  2. 0,5 sayısal diyafram açıklığı ile 20x hava hedefi kullanın ve yüksek kontrastfloresan ve faz kontrastı veya brightfield görüntüleme için donatılmıştır. Faz kontrastı veya parlaklık alanı ile hücreleri görüntüleyin ve hücreleri odak haline getirmek için rotayı ve mikroskobu ince odak ayarlayın.
  3. Brightfield, GFP ve RFP görüntü edinimi için en uygun pozlama sürelerini, görüntülenecek floroforlar için uygun uyarma ve emisyonla ilgili filtre küpünü seçerek belirleyin ve ayarlayın. Alternatif olarak, önceden belirlenmiş bir pozlama süresi girdirmek için otomatik pozlama düğmesini tıklatın. Sinyal yeterince yoğun değilse, binning sekmesine tıklayarak ve açılan menüden 2 x 2 piksel binning seçerek daha kısa pozlama sürelerini etkinleştirmek için piksel binning'i seçin.
    NOT: Fototoksisite mitotik progresyon ve hücre canlılığını bozabilir. Kontrol popülasyonlarında bulunan mitotik hücrelerin normal mitozları tamamlayamamaları, maruz kalma sürelerinin ve/veya görüntüleme süresinin daha da optimize edilmesi gerektiğinin bir göstergesi olabilir.
  4. Çok eşgüdümlü, çok iyi görüntülemenin aynı anda elde edilmesini sağlayan ve görüntü edinimi parametrelerini tanımlayan bir satın alma ve analiz yazılımı kullanın.
    1. Üreticinin talimatlarına göre mikroskop aşamasını çok kuyulu çanağa seçin ve kalibre edin. Kullanılan plaka biçiminin diyagramındaki ilgili kuyulara tıklayarak görüntülenecek kuyuları vurgulamak veya başka bir şekilde seçmek için görüntü edinme yazılımını kullanın.
    2. Oluşturulan Puanlar kontrol paneli altında(Şekil 2), Nokta Yerleştirme sekmesine tıklayarak ve önceden tanımlanmış veya rasgele koordinat yerleşimi seçerek görüntülenecek her kuyunun içindeki koordinatları tanımlar açılan menü. Çalışma Alanı sekmesini seçin ve kuyunun sınırlarını dışlamak için koordinat seçim alanını kısıtlamak için açılır menüden sınırlı seçeneğini belirleyin. Her kuyuda yakalanacak noktaların sayısını ve dağıtımını seçmek için Sayım ve Dağıtım sekmelerini tıklatın.
      NOT: 5 dk'lık zaman dilimi içinde her kuyu da görüntülenebilen koordinat sayısı, görüntülenecek kuyu sayısı ve her kanalın pozlama süresiyle sınırlı olacaktır. Tipik olarak, kuyu başına 5-8 koordinatlar 4 saat içinde mitoz bölünme yoluyla her durumda en az 50 hücre gözlemlemek için yeterlidir.
    3. Zaman Sırası kontrol paneline tıklayıp içeri sokarak görüntüleri toplamak için zaman aralığını ve süresini seçin ve girdi.
      NOT: Görüntülerin her 1 ila 5 dakikada bir elde edilmesi mitotik ilerleme dinamiklerini izlemek için uygundur. Görüntülemenin toplam süresi, hücre hattının istenilen uç nokta ve çoğalma oranını yansıtmalıdır. Örneğin, 4 saat mitoz bölünme yoluyla birçok hücre ilerleme görmek için yeterli, 16 saat mitoz yoluyla bir asynchronous popülasyon ilerleme en RPE-1 hücreleri görmek için yeterlidir.

4. Mitotik mil tedirginlikleri sonrasında metafaz zamanlaması ve mitotik hücre kaderini belirlemek için hızlandırılmış görüntü analizi

NOT: Görüntü analizini bir görüntü edinme yazılımı(Tablo Malzemeler), ImageJ veya karşılaştırılabilir görüntü analizi yazılımı kullanarak gerçekleştirin.

  1. RFP filtre küpü yle çekilen görüntüleri yerinde seçerek RFP-H2B etiketli kromatini görselleştirin. Mitoz girilen bir hücreyi ilk kromatin sıkıştırmasında belirtildiği gibi(Şekil 2C, mavi ok ucu) ve nükleer zarf ın parçalanması (α-tubulin-EGFP artık nükleer sınır tarafından dışlanmadığında) tanımlayın.
  2. Tek tek hücrelerde metafaz hizalama ve anafaz başlangıcının mitotik zamanlamasını belirleyin: RFP-H2B etiketli kromatine kadar mitotik girişten zaman puanlarını/dakika sayısını belirlemek için edinilmiş filmde ardışık zaman noktaları üzerinden hücreyi izleyin metafaz sırasında hücre ekvatorundaki hizalamayı tamamlar(Şekil 2C, sarı ok ucu).
  3. Mitotik zamanlamayı, mitotik sadakati ve hücre kaderini izlemek için, anafaz kromozom ayrımının belirgin olduğu zaman koordinatını belirlemek için hücreyi ardışık zaman noktalarından izlemeye devam edin(Şekil 2C, beyaz ok ucu) ve/veya kromatin decompaction ve nükleer zarf reformasyon (çekirdekten tubulin dışlanması ile belirtildiği gibi) meydana gelmiştir.
    NOT: Mil montajı veya mitotik progresyonpertasyonları, bipolar mitotik mil elde etmek ve tam kromozom hizalaması veya anafaz kromozom segregasyonunu tamamlamak için gereken zamanın bir fonksiyonu olarak değerlendirilebilir.
  4. Anafaz kromozom ayrımı sırasında gecikmeli kromozomlar ve kromatin köprüleri de dahil olmak üzere mitotik bozukluklar sergileyen her popülasyondaki hücreleri tanımlamak için RFP-H2B'yi görselleştirin.
    NOT: Tehlikeye mitotik sadakat de multinucleated veya mikronükleli kız hücreleri neden olabilir ve hücrelerde mitotik çıkış sonrası görselleştirilmiş olabilir, Şekil 3'teolduğu gibi .

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Mil pertürbasyonları varlığında mitotik progresyonun değerlendirilmesi
Mil direk odaklama nın düzenlenmesi uygun bipolar mil oluşumunda önemli bir adımdır. Protein tükenmeleri yoluyla bu süreçte bozulma, ilaç inhibisyonu, veya centrozom numarası bozuk mil yapısı nda değişiklikler ve gecikme veya mitotik ilerlemesini durdurmak10,11,12,13. Bunu...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Zaman atlamalı görüntüleme tarafından sağlanan zamansal çözünürlük, tek hücre içindeki ardışık hücresel olayların görselleştirilmesini ve değerlendirilmesini sağlar. Hücre senkronizasyonunu ve ardından hücrelerin ardışık zaman noktalarında toplanması ve fiksasyonundan yararlanan yaklaşımlar, sonuçta hücre popülasyonları arasında karşılaştırmalar yapılmasıyla sınırlıdır. Pertürbasyonlara hücresel yanıtın tekdüze olmadığı veya görselleştirilen sürecin dinamik olduğu bağlamlarda, canlı hücre zaman atlamalı görüntüleme, hem ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

DLM bir NSF GRFP tarafından desteklenir. ALM, Smith Aile Biyomedikal Araştırmada Mükemmellik Ödülü'nden gelen fonla desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 0.05 TripsinGibo-Yaşam bilimleri25-510Kültür kaplarından yapışkan hücreleri serbest bırakmak için kullanılan bir serin proteaz
15ml santrifüj tüpleriOlympus Plastics28-101
20x CFI Plan Fluor objektifi NikonHem parlak alanı hem de floresanı görselleştirmek için Canlı hücre görüntülemede kullanım için
293T HücreleriATCCCRL-3216Retroviral transfeksiyonda kullanım için; adım 1.1'de kullanılır
a-tubulin-EGFP Addgeneçeşitli sayılarYeşil bir floresan protein etiketine kaynaşmış alfa tübülin için ekspresyon vektörü; canlı hücre görüntülemede tübülinin görselleştirilmesinde kullanım için: Addgene ve diğer satıcılar aracılığıyla ticari olarak temin edilebilir
AlisertibSelleckchemS1133Mitotik kinaz Aurora A'nın küçük molekül inhibitörü Stok konsantrasyonu DMSO'da 10mM'de hazırlanır ve 100nM'lik bir nihai konsantrasyonda kullanılır.
BlasticidinInvitrogenA11139-03Antibiyotik seçim ajanı; A-tub-EGFP eksprese eden hücreleri seçmek için kullanılır
C02Hava GazıHücre kültürü ve canlı hücre görüntülemede kullanım için
Chroma ET-DS Kırmızı (TRITC/Cy3)Chroma49005Tek bantlı filtre seti; uyarma dalga boyu 25nm bant genişliği ile 545nm ve 70nm bant genişliği ile 605nm dalga boyunda emisyon; H2B-RFP'nin
görselleştirilmesi içinChroma ET-EGFP (FITC/Cy2)Chroma49002Tek bantlı filtre seti; 40nm bant genişliğine sahip uyarma dalga boyu 470nm ve 50nm bant genişliğine sahip 525nm dalga boyunda emisyon; GFP-tubulin
tek kullanımlık cam Pastüer pipetlerinin görselleştirilmesi için, sterilize edilmiş ve nbsp;Fisher Scientific13-678-6AAspirasyon hücrelerinde kullanım için 
Dulbecco' s Modifiye Eagle Medium (DMEM)Gibo-Life sciences11965-084RPE-1 ve 293T hücrelerinin büyümesi için hücre kültürü ortamı
Fetal Sığır Serumu (FBS)Gibo-Life sciences10438-026Hücre kültürü ortamı takviyesi
Lipofektamin 3000 ve p3000InvitrogenL3000-015Plazmitlerin transfeksiyonu için lipid bazlı transfeksiyon reaktifi; 1.1.4
Çok kuyulu Doku Kültürü tabaklarındaHücre kültürü, transfeksiyon / enfeksiyon ve canlı hücre görüntülemede kullanım içinçeşitliCorning
Nikon Ti-E mikroskobuCanlıhücre görüntülemede kullanım için
NIS Elemanları HC NikonSürüm 4.51Görüntü elde etme ve analiz yazılımı; bölüm 3 ve 4'te kullanılır
OPTI-MEMGibo-Yaşam bilimleri31985-070Hücre transfeksiyonu için indirgenmiş serum ortamı; adım 1.1.3'te kullanılır
Penisilin/Streptomisin Gibo-Life sciences15140-122hücre kültürü ortamında kullanılan antibiyotik
fosfat tamponlu salin (PBS)Keson laboratuvarlarıPBP06-10X1LThücre kültürü ile kullanım için steril salin çözeltisi
pMD2.GAddgene12259Lentiviral VSV-G zarf ekspresyon yapısı; adım 1.1.4'te kullanılır
PolybreneSigma-AldrichH9268Viral enfeksiyon etkinliğini artırmak için kullanılan katyonik polimer; adım 1.1.10'da kullanılır
psPAXAddgene122602. nesil lentiviral ambalaj plazmidi; adım 1.1.4'te kullanılır
PuromycinInvitrogenant-pr-1Antibiyotik seçim ajanı; RFP-H2B eksprese eden hücreleri seçmek için kullanılır
RFP-Histon 2B (H2B)Gençeşitli numaralarekleyinKırmızı floresan proteini etiketli histon 2B için ekspresyon vektörü; canlı hücre görüntülemede kromatinin görselleştirilmesinde kullanım için: Addgene ve diğer satıcılar aracılığıyla ticari olarak temin edilebilir
RNAi MaxInvitrogen13778-150siRNA'nın transfeksiyonu için lipid bazlı transfeksiyon reaktifi
RPE-1 hücrelerioluşturur ATCCCRL-4000İnsan retinal pigment epitel hücre hattı
Doku kültürü kabı 100x20mmCorning Yapışık hücrelerin kültürlenmesinde kullanım için353003
Zyla sCMOS kamera Hücrelerin görüntülerini yakalamak için kullanılan mikroskoba bağlıNikon
kullanılırNikon Ters epifloresan mikroskobu Fotoğraf Makinesi

Kaynaklar

  1. Szuts, D., Krude, T. Cell cycle arrest at the initiation step of human chromosomal DNA replication causes DNA damage. Journal of Cell Science. 117, 4897-4908 (2004).
  2. Gayek, A. S., Ohi, R. CDK-1 Inhibition in G2 Stabilizes Kinetochore-Microtubules in the following Mitosis. PLoS One. 11, e0157491(2016).
  3. Mackay, D. R., Makise, M., Ullman, K. S. Defects in nuclear pore assembly lead to activation of an Aurora B-mediated abscission checkpoint. The Journal of Cell Biology. 191, 923-931 (2010).
  4. Cimini, D., Fioravanti, D., Salmon, E. D., Degrassi, F. Merotelic kinetochore orientation versus chromosome mono-orientation in the origin of lagging chromosomes in human primary cells. Journal of Cell Science. 115, 507-515 (2002).
  5. Kwon, M., et al. Mechanisms to suppress multipolar divisions in cancer cells with extra centrosomes. Genes & Development. 22, 2189-2203 (2008).
  6. Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38, 2-16 (2006).
  7. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? Journal of Cell Science. 122, 2579-2585 (2009).
  8. van Vuuren, R. J., Visagie, M. H., Theron, A. E., Joubert, A. M. Antimitotic drugs in the treatment of cancer. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 76, 1101-1112 (2015).
  9. Chan, K. S., Koh, C. G., Li, H. Y. Mitosis-targeted anti-cancer therapies: where they stand. Cell Death and Diseases. 3, 411(2012).
  10. Martin, M., Akhmanova, A. Coming into Focus: Mechanisms of Microtubule Minus-End Organization. Trends in Cell Biology. 28, 574-588 (2018).
  11. Maiato, H., Logarinho, E. Mitotic spindle multipolarity without centrosome amplification. Nature Cell Biology. 16, 386-394 (2014).
  12. Vitre, B. D., Cleveland, D. W. Centrosomes, chromosome instability (CIN) and aneuploidy. Current Opinion in Cell Biology. 24, 809-815 (2012).
  13. Godinho, S. A., Pellman, D. Causes and consequences of centrosome abnormalities in cancer. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369, (2014).
  14. Navarro-Serer, B., Childers, E. P., Hermance, N. M., Mercadante, D., Manning, A. L. Aurora A inhibition limits centrosome clustering and promotes mitotic catastrophe in cells with supernumerary centrosomes. Oncotarget. 10, 1649-1659 (2019).
  15. Conte, N., et al. TACC1-chTOG-Aurora A protein complex in breast cancer. Oncogene. 22, 8102-8116 (2003).
  16. Schumacher, J. M., Ashcroft, N., Donovan, P. J., Golden, A. A highly conserved centrosomal kinase, AIR-1, is required for accurate cell cycle progression and segregation of developmental factors in Caenorhabditis elegans embryos. Development. 125, 4391-4402 (1998).
  17. Asteriti, I. A., Giubettini, M., Lavia, P., Guarguaglini, G. Aurora-A inactivation causes mitotic spindle pole fragmentation by unbalancing microtubule-generated forces. Molecular Cancer. 10, 131(2011).
  18. Chan, J. Y. A clinical overview of centrosome amplification in human cancers. International Journal of Biological Sciences. 7, 1122-1144 (2011).
  19. Kramer, A., Maier, B., Bartek, J. Centrosome clustering and chromosomal (in)stability: a matter of life and death. Molecular Oncology. 5, 324-335 (2011).
  20. Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460, 278-282 (2009).
  21. Silkworth, W. T., Nardi, I. K., Scholl, L. M., Cimini, D. Multipolar spindle pole coalescence is a major source of kinetochore mis-attachment and chromosome mis-segregation in cancer cells. PLoS One. 4, e6564(2009).
  22. Nigg, E. A. Centrosome aberrations: cause or consequence of cancer progression? Nature reviews, Cancer. 2, 815-825 (2002).
  23. Godinho, S. A., Kwon, M., Pellman, D. Centrosomes and cancer: how cancer cells divide with too many centrosomes. Cancer Metastasis Reviews. 28, 85-98 (2009).
  24. Quintyne, N. J., Reing, J. E., Hoffelder, D. R., Gollin, S. M., Saunders, W. S. Spindle multipolarity is prevented by centrosomal clustering. Science. 307, 127-129 (2005).
  25. Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Floresan aretli Belirte lerKromatin Mikrot b lleriOlu um AnaliziMitotik lerleme zlemeMitotik Defekt Tan mlamaDinami i De erlendirmesiMitotik H cre Kader Analizi
Mitotik Mil Pertürbasyonları Sonrası Metafaz Zamanlaması ve Hücre KaderiniN Dinamiği Nin Dinamiği Nin Dinamitini Değerlendirmek Için Canlı Hücre Görüntülemesi
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.