Murine Mammosphere Kültürlerde Kendini Yenileme Nin Niceliği

Thalia Vlachou; Xieraili Aobuli; Errico D'Elia; Angela Santoro; Maria Cristina Moroni; Pier Giuseppe Pelicci

doi:10.3791/60256

Yöntem makalesi

Murine Mammosphere Kültürlerde Kendini Yenileme Nin Niceliği

8.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/60256

⸱

26 Kasım 2019

Thalia Vlachou¹ , Xieraili Aobuli¹ , Errico D'Elia¹ , Angela Santoro¹ , Maria Cristina Moroni¹ , Pier Giuseppe Pelicci¹^,²

¹Department of Experimental Oncology, IEO, European Institute of Oncology IRCCS, ²Department of Oncology and Hemato-Oncology, University of Milan

Bu makalede

Özet

Burada, in vitro mammosphere öz-yenileme nicel tahsin sonuçlarının uygulanması ve yorumlanması açıklanmaktadır.

Özet

Meme bezi geniş rejenerasyon kapasitesi ile karakterizedir, bir kadının yaşam döngüsü boyunca büyük hormonal değişiklikler geçer gibi. Meme kök hücrelerinin (MASC) rolü hem fizyolojik/gelişimsel bağlamda hem de meme kanserinegenezi açısından yaygın olarak incelenmiştir. Bu açıdan, MaSC özelliklerine odaklanan ex vivo çalışmaları çok sonra aranır. Mammosphere kültürleri organ oluşumunun bir taşıyıcısı temsil ve hem temel hem de çevirisel araştırma için değerli bir araç haline gelmiştir. Burada, murine primer mamografi kültürleri ve MaSC büyüme özelliklerinin niceliği için ayrıntılı bir protokol salıyoruz. Protokol, meme bezi toplama ve sindirimi, primer meme epitel hücrelerinin (MECs) izolasyonunu, primer mammosfer kültürlerinin kurulmasını, seri geçişleri, mammosfer büyüme parametrelerinin niceliğini ve sonuçların yorumlanmasını içerir. Örnek olarak, düşük seviyeli kurucu Myc ifadesinin normal MEC'ler üzerindeki etkisini sunarak artan kendini yenileme ve çoğalmaya yol açıyoruz.

Giriş

Meme epitel sapı ve ata hücrelerinin izolasyon ve in vitro kültürü meme hücre biyolojisindeki özelliklerini anlamak için gerekli hale gelmiştir. Zarif soy izleme ve seri transplantasyon tahlilleri, in vivo niş bağlamında kök hücre (SCs) ve diğer doku alt kümelerinin incelenmesini sağlamıştır. Ancak, bu yaklaşım zaman alıcı ve muhabir fare modelleri^1,2^,³^,⁴^,⁵nesil gerektirir. Bu nedenle, in vitro kültür ve meme kök hücrelerinin yayılması (MASCs) anahtar köklük özellikleri, yani kendini yenileme ve farklılaşma yeteneği, bu alanda en büyük zorluklardan biridir. Son yıllarda, mammosphere testi yaygın normal meme dokusu ve meme kanseri büyüme modeli için, normal veya kanser SCs (CCs) ölçmek ve kendi faaliyetlerinin bir vekil muhabiri olarak kendi kendini yenileme yeteneğini değerlendirmek için kullanılmıştır^vivobağlamda kendi faaliyetlerinin bir vekil muhabiri olarak 6^,⁷^,⁸^,⁹^,10^,¹¹.

Mammosphere tsay verimli ve maliyet-etkin bir yaklaşımdır, hangi taze izole meme epitel hücreleri (MECs) non-yapışık koşullarda kültürlü olan, sadece MASCs hayatta kalacak ve süspansiyon küreler oluştururken tüm diğer hücre tipleri anoikis tarafından ölecek. Ayrıca, seri non-adherent pasajlarda mammospheres birkaç nesil oluşturmak için yeteneği MaSCs^6,⁹^,¹¹kendi kendini yenileme yeteneği ile ilgilidir. Burada, başlangıçta Dontu ve meslektaşları⁷ öncü nörosfer tahlili bir değişiklik olarak geliştirilen bir nicel mammosphere tahsin ayrıntılı bir protokol açıklar¹², uygun büyüme faktörlerinin eklenmesi ile non-adherent, serum-free koşullarda putatif SC büyümesini sağlayan⁷^,¹².

Protokol

In vivo işlemler AB direktifi 2010/63 ve kurumsal etik komitesi (Hayvan Sağlığı için Organizma-OPBA) ve İtalya Sağlık Bakanlığı (IACUC Numaraları 762/2015 ve 537/2017) onayı sonrasında gerçekleştirilmiştir.

1. Murine Meme Bezi Toplama ve Sindirim

Tipik bir deney için, CO₂ teneffüs tarafından 8-10 haftalık bakire dişi fareler kurban. Deneyin amaçlarına bağlı olarak 5-30 fare kullanın. Fareleri bir kaputun altına diseksiyon tahtalarına yerleştirin. Ön ayakları germek ve etanol ile hayvanın kürk aşağı yıkamak için iğnekullanın.
Forseps ile cildi kaldırın ve pelvik alan düzeyinde başlayan ve serviks e kadar tüm yol hareket dikey bir kesi gerçekleştirmek, periton bozulmadan bırakarak. Cilt veya periton yırtılma önlemek için, yuvarlak kenarlı makas kullanın.
Dikkatle vücudun lateral ekseni boyunca makas nazik hareketleri ile vücuttan cilt ayırmak.
Deri torasik ve karın bölgesinden tamamen ayrıldıktan sonra, hayvanın dört uzuvları boyunca dört kesi yapın ve iğnelerle deriyi sabitler. Tam genişletilmiş deri den hayvanın vücut ayırmak için makas ve forceps kullanın.
Yavaşça şimdi tamamen maruz ve dikkatle makas yardımı ile deriden ayırmak meme yağ pedleri kaldırmak için forseps kullanın. Her farenin alt torasik ve abdominal meme bezlerini toplayın ve 50 mL konik tüpiçinde Dulbecco'nun fosfat tamponlu salinine (DPBS) batırın. Tüp başına en fazla 20 bez toplayın. Dokuları buzda tut.
NOT: Gerekirse, bezleri bir gecede buz üzerinde kalabilir. Burası güvenli bir durak noktası. Aşağıdaki adımlar steril koşullar altında yapılmalıdır.
Sindirim ortamını hazırlayın ve filtreleyin: Dulbecco'nun modifiye kartal ortası (DMEM) 2 mM glutamin, 100 U/mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin, 200 U/mL kollajenaz ve 100 μg/mL hyaluronidaz (Malzeme Tablosunabakınız).
100 mm Petri kabına 20 beze aktarın ve neşter veya kavisli makas kullanarak dokuyu dolayın. Büyük hacimlerde DPBS'yi yemeğe aktarmaktan kaçının.
Her Petri kabına 10 mL sindirim ortamı ekleyin ve 25 mL serolojik pipet kullanarak kıyma dokusunu 50 mL konik bir tüpe aktarın.
Tüpleri parafilm ile kapatın ve bir rotator üzerine yerleştirin. Rotatörü düşük hızda (0,03 x g)ayarlayın ve %5 CO₂içeren nemli bir atmosferde 37 °C'de 2,5 saat kuluçkaya yatırın.
Sonraki adımlara geçmeden önce süspansiyonu görsel olarak inceleyin. Büyük doku parçaları sindirilmemiş kalırsa, kuluçka süresini 37 °C'de 30 dakika daha uzatın.
NOT: Alternatif olarak, sindirim bir gecede yapılabilir 37 °C, 5% CO₂, nazik bir kollajenaz / hyaluronidase enzim karışımı kullanılarak¹³.

2. Birincil Murine MECs Izolasyon

Rotatörü durdurun ve tüpleri kuvözden çıkarın. 5 mL serolojik pipetin açılışında p1000 ucunu ayarlayın. Süspansiyon P1000 ucundan geçerse, sonraki adımlara devam edin. Aksi takdirde, 37 °C'de kuluçka süresini 30 dakika daha uzatın.
Santrifüj 100 x g, 4 °C'de 5 dk. Supernatant'ı dikkatlice decant ve her tüpün peletini 3 mL DPBS'de yeniden askıya alın.
NOT: Düşük santrifüj hızı lenfositler ve yağ dokusu hücrelerinin kaldırılmasını sağlar. Bu adımda peletin sislodging önlemek için nazik manipülasyon gereklidir.
100, 70 ve 40 μm hücreli süzgeçkullanarak her tüpteki hücre süspansiyonuna ayrı ayrı süzün. Her filtreleme adımında, geçişi toplamadan önce süzgeçleri 2 mL DPBS ile yıkayın.
NOT: Bu noktadan itibaren, hücre süspansiyonları biraraya getirilebilir ve birlikte işlenebilir.
Santrifüj 300 x g, 4 °C'de 5 dk. Supernatant'ı dikkatlice decant ve DPBS'nin kalan hacmindeki hücreleri yeniden askıya alın.
Eşit hacimde amonyum-klorür-potasyum (ACK) lysis tamponu ekleyerek kırmızı kan hücresine (RBC) devam edin (Bkz. Malzemeler Tablosu). Pipetleme ile karıştırın ve 5 dakika kadar buz üzerinde kuluçka.
4 °C'de 5 dk için 300 x g'de10 mL DPBS ve santrifüj ekleyin. Supernatant'ı dikkatlice dekatant ve peleti görsel olarak inceleyin. Pelet beyazsa, bir sonraki adıma geçin. Aksi takdirde RBC lysis adımını tekrarlayın (adım 2.5).
Mammosphere media 1-5 mL hücre pelet resuspend: meme epitel hücre büyüme bazal orta (MEBM), 2 mM glutamin ile takviye, 100 U/mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin, 5 g/mL insülin, 0.5 μg/mL hidrokortizon, %2 B27, 20 ng/mL epidermal büyüme faktörü (EGF), 20 ng/mL temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) ve 0.4 IU/mL heparin (Tablo Malzemeler)

3. Seri Mammosphere Re-kaplama

Mammosfer kültürlerinin kurulması için, hücreleri mamografi mecrasında 200.000 canlı hücre/mL yoğunlukta tedavi edilen doku dışı kültüre (ultra-düşük yapışma) 6-iyi plakalar üzerine plakalayın. Hücreleri 37 °C,%5 CO_2'de7-10 gün kuluçkaya yatırın.
%95 etanolde %1 poli-HEMA çözeltisi hazırlayın ve filtreleyin (bkz. Malzemeler Tablosu). Aşağıdaki pasajlar için ultra düşük yapışma 6-iyi plakalar katlayın, kuyu başına 400 μL poli-HEMA çözeltisi ekleyerek ve etanolün tamamen kurumasını sağlayarak. Daha iyi sonuçlar elde etmek için kaplamayı iki kez tekrarlayın.
NOT: İlk geçiş sırasında kaplamasız plakaların kullanılması fibroblastların kültürden seçici olarak çıkarılmasını sağlar.
7-10 günlük kültürün sonunda, tüm kuyulardan birincil mammospheres toplamak ve santrifüj 300 x g, 4 ° C'de 5 dakika için.
Supernatant'ı dikkatlice dekantın ve filtreli uçlu P200 pipeti kullanarak mammospheres'in mekanik ayrıştırılmasına devam edin. Pipet yaklaşık 100 kez ve görsel olarak büyük küresellerin varlığı için süspansiyon incelemek.
NOT: 37 °C'de düşük hacimli (0.2-0.5 mL) küre peletinin kısa bir kuluçka (2-5 dk) veya %5 CO_2,mekanik dissosiasyonu kolaylaştırmak için kullanılabilir. Her pasajın kaplaması için taze mammosphere orta (adım 2.7) hazırlayın.
Taze mamografi orta 1-5 mL resuspend ve canlı hücreleri saymak. Varsa, tedavi gruplarında veya kültür koşullarına hücreleri bölün.
Plaka 20.000 canlı hücre /mL poli-HEMA kaplı ultra-düşük yapışma 6-iyi plakalar ve kuluçka 37 °C, 5% CO₂.
NOT: Mamospheres hücre kaplama sonra 5-7 gün içinde maksimum boyutuna ulaşır. Mümkün olduğunda, teknik çoğaltmalar elde etmek için her örnek veya koşulun hücrelerini birden çok kuyuya dağıtın. Hücre agregasını önlemek için kaplama yoğunluğu düşük tutulmalıdır. 6-iyi plakalar için maksimum 20.000 hücre/mL ve 24 kuyulu plakalar için 5.000 hücre/mL önerilir.
5-7 gün sonra, iyi başına küre sayısını saymak. Bu, 10x büyütme lensi ile donatılmış bir mikroskop kullanılarak veya dijital görüntü analizi kullanılarak manuel olarak yapılabilir (bkz. adım 4).
Her kuyunun mamospheres ayrı ayrı toplayın ve santrifüj 300 x g, 4 °C'de 5 dakika için.
Supernatant'ı dikkatlice dekantın ve filtreli uçlu P200 pipeti kullanarak mammospheres'in mekanik ayrıştırılmasına devam edin. Pipet yaklaşık 100 kez ve görsel olarak büyük küresellerin varlığı için süspansiyon incelemek.
Taze mammosphere orta 1 mL resuspend ve canlı hücreleri saymak. Her numunenin veya koşulun hücrelerini birleştirin ve 3.6-3.10 adımlarını yineleyin. Kaplanmış hücre sayısını ve her geçit için her biri için sayılan küre ve hücre sayısını kaydedin. Kümülatif büyüme hesaplaması için adım 5'e geçin.

4. Dijital Görüntü Analizi (DIA) Kullanarak Küre Numaralandırma

Her pasajın sonunda, tüm kuyuların tüm yüzeyini tarayıp stereoskopüzerine monte edilmiş bir dijital kamera kullanarak kürelerin görüntülerini elde edin. Görüntüleri .tif dosyaları olarak kaydedin.
ImageJ^14'ükullanarak stereoskop görüntülerini Görüntü Dizisi olarak aktarın. Ölçeği ve görüntü türünü 8 bit olarak ayarlayın.
Resim yığınını çoğaltın ve menü çubuğundaki sekme işleminden Arka Planı Çıkar'ı seçin. Seçenekleri kontrol Edin Işık arka plan ve Kayan paraboloid ve düğmesinetıklayın Tamam . Yığının tüm görüntülerini işle.
Menü çubuğunun sekmesinden Ayarla ve Ardından Eşik'i seçin. Uygula'yatıklayarak, Yığını İkiliye Dönüştür başlıklı bir diyalog penceresi görüntülenir. Yöntem olarak Varsayılan'ı ve arka plan olarak Işık'ı seçin. Kutuyu işaretle Her görüntü için hesapla eşiğini hesapla ve Tamamdüğmesine tıklayın.
Menü çubuğunun sekmesinin altındaki İkili listeden Havza, Aç ve Erode komutlarını sırayla seçin. Görünen diyalog kutusunun Evet düğmesine tıklayarak yığının tüm görüntülerini işleyin.
NOT: Bu işlemler, nesnelerin dokunması, nesnedüzitme ve nesnelerin kenarından piksel kaldırma görsel bölümleme sağlar.
İşlevçözümme menüsünden Parçacıkları Analizet'i seçin. Minimum boyut eşiğini 10.000 μm² ve 0,50 ile 1,00 arasında dairesellik olarak ayarlayın. Açılan menüden Elips seçeneğini seçin. Özetle'yiişaretleyin , kenarlarda hariç tut ve yerinde Göster ve Tamamdüğmesine tıklayın. Yığının tüm görüntülerini işle.
Elipslerin kürelerle olan yazışmalarını görsel olarak inceleyin ve gerekirse parçacık sayısını buna göre düzeltin. Her kuyunun tüm karelerinden sayımları toplamı, her kuyunun toplam mammospheres sayısını elde etmek için.

5. Kümülatif Büyüme Eğrisi Hesaplama

NOT: Her pasajın sonunda her kuyuda sayılan mammospheres sayısı (P_N)P_Nbaşında tohumlanmış mammosphere başlatan hücrelerin sayısını yansıtır.

Her geçiş için (P_N),kaplamalı hücre sayısını ve iyi başına sayılan hücre ve küre sayısını kaydedin. Her pasajın sonundaki küre boyutunu hesaplayın:
küre boyutu P_N (hücre / küre) = p_n / küre sayılan_p n sayılan hücreler
NOT: P_N'deki küre boyutu, P_N'detohumlanan her mammosferbaşlatan hücrenin proliferatif potansiyelinin bir ölçüsüdür.
P_N için kaplanmış hücre sayısını bir önceki pasajın sonunda hesaplanan küre boyutuna bölerek kaplamalı kürelerin sayısını çıkar (P_N-1):
küreler p_N = hücreleri p_n / küre boyutu P_N-1 kaplama
NOT: Konvansiyona göre, küre boyutu kültürün ilk geçişi sırasında kararlı kabul edilir (yani, küre boyutu P₀ = küre boyutu P_1). Birden çok kuyu teknik çoğaltma olarak kullanılıyorsa, P_N-1'deki ortalama küre boyutunu payda olarak kullanın.
Her geçit için kümülatif hücre ve küre numarasını hesaplayın:
kümülatif sayı P_N = (p_n / kaplamaLı P_N)X kümülatif sayı P_N-1.
NOT: Konvansiyona göre, kümülatif sayı P₀ = p₁plakalı . Teknik çoğaltma olarak birden çok kuyu kullanılıyorsa, her geçiş için numune veya koşul başına ortalama kümülatif sayıyı hesaplayın.
Veri noktalarını yarı logaritmik ölçekte çizin. Geçiş numarasını (P_0-P _N)x ekseninde (doğrusal ölçek) ve y ekseninde kümülatif hücre veya küre numarasını (logaritmik ölçek) görüntüleyin.
Üstel bir eğilim çizgisini veri noktalarına sığdırın ve uyumun iyiliğini ölçmek için belirleme katsayısını (R²⁾hesaplayın.
NOT: Veri noktalarına takılan eğilim çizgisi, sabit bir hızda büyüyen veya ölen bir hücre popülasyonu için beklendiği gibi üstel bir eğriye yaklaşmalıdır. R^2, 0 ile 1 arasındaki değerleri alır ve 1'e en yakın değerler daha iyi bir uyum gösterir.
Kültürün büyüme hızını (GR) çıkarmak için eğilim çizgisinin denklemini doğal bir üstel işlev olarak gösterin:
y = y₀ e^(GR)x, y₀ değeri ise y = 0 olur.

Sonuçlar

Normal MECs MYC aşırı ekspresyon, mammosphere başlatan hücrelerin artan sıklığı yol açar. Bu çift mekanizma ile elde edilir: Myc MaSC simetrik bölünmeler ve yeni MASCs¹¹içine progenitor yeniden programlama sıklığını artırır. Düşük kurucu Myc ekspresyonunun etkisini test etmek için, Myc aktivitesinin 4-hidroksitamoksifen (4-OHT)^tarafındanindüklenebileceği Rosa26-MycER transgenik fare modelini kullandık. 4-OHT yokluğunda, fibroblastları çıkarmak için ilk olarak MEC'leri ultra düşük yapışma 6-iyi plakalara yapıştırdık. İlk pasajdan sonra kültürü ikiye böldük: iki kuyu tedavi edilmedi (kontrol) ve iki kuyu 200 nM 4-OHT (MycER) ile tedavi edildi. Üç bağımsız deney için 5 ardışık pasajın küre ve hücre numaralarını saydık(Tablo 1). Her geçitteki kümülatif hücre ve küre sayıları Tablo 2'degösterilmiştir. 4-OHT ile indüksiyon, Şekil 1'degösterildiği gibi küre ve hücre büyüme oranlarının artmasına yol açar.

figure-results-1
Şekil 1: Temsili sonuçlar. Kümülatif küre (A) ve hücre (B) kontrol ve MycER mammospheres büyüme eğrileri. 3 bağımsız deneyin ortalama ve standart sapması gösterilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

		1. kaplama			2. kaplama			3. kaplama			4. kaplama			5. kaplama
		Kaplanmış Hücreler	Hücre Sayısı	Küre Sayısı	Kaplanmış Hücreler	Hücre Sayısı	Küre Sayısı	Kaplanmış Hücreler	Hücre Sayısı	Küre Sayısı	Kaplanmış Hücreler	Hücre Sayısı	Küre Sayısı	Kaplanmış Hücreler	Hücre Sayısı	Küre Sayısı
Exp1	Denetim	77,000	50,000	31	65,000	58,500	41	57,000	30,000	32	30,000	22,000	5	22,000	0	0
	Denetim	77,000	81,000	41	65,000	55,000	23
	MycER	77,000	31,0000	193	80,000	375,000	323	80,000	380,000	217	80,000	220,000	223	80,000	170,000	155
	MycER	77,000	110,000	142	80,000	505,000	396	80,000	270,000	149	80,000	290,000	194	80,000	250,000	160
Exp2	Denetim	75,000	75,000	71	60,000	17,000	34	28,000	45,000	29	45,000	13,000	2	13,000	0	0
	Denetim	75,000	47,000	45	60,000	11,000	47
	MycER	75,000	200,000	188	80,000	225,000	277	80,000	230,000	155	80,000	210,000	211	80,000	100,000	95
	MycER	75,000	250,000	192	80,000	202,500	283	80,000	305,000	185	80,000	160,000	237	80,000	100,000	133
Exp3	Denetim	82,500	130,000	121	80,000	45,000	105	80,000	110,000	86	80,000	58,500	75	58,500	58,500	78
	Denetim	82,500	125,000	177	80,000	71,250	42
	MycER	82,500	325,000	457	80,000	610,000	327	80,000	367,000	309	80,000	500,000	260	80,000	115,000	146
	MycER	82,500	475,000	463	80,000	455,000	392	80,000	415,000	204	80,000	470,000	295	80,000	185,000	161

Tablo 1: Her geçitte sayılan küre lerin sayısı ve kaplanmış ve sayılan hücre sayısı.

figure-results-2
Tablo 2: Kaplamalı küre numaraları ile kümülatif küre ve hücre numaralarının hesaplanması. Bu tablonun daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)

Tartışma

Burada, masc büyüme özelliklerinin in vitro nicel tanımı için bir protokol açıklıyoruz. Örnek olarak, düşük seviyeli kurucu Myc ifadesinin normal murine MASC'ler üzerindeki etkisini sgörüyoruz. Ancak bu yaklaşım çeşitli bağlamlara eşit olarak uygulanabilir. İnsan veya murine birincil hücreleri, hem de kurulan hücre hatları, seri olarak geçilebilir mammosfer kültürleri kurmak için ankraj bağımsız koşullarda kültürlenebilir. Gen aşırı ekspresyonu ve RNA paraziti protokole ilk geçişin sonunda viral bir transdüksiyon adımı eklenmesiyle (3.5. adımdan sonra) kolayca sunulabilir. Alternatif olarak, hücreler yapışma enfekte olabilir ve daha sonra mammospheres olarak kaplanmış.

Burada sunulan tahmin kritik bir yönü, sonuçların yorumlanması na müdahale agregaların nesil önlemek için yeterince düşük olmalıdır tohumlama hücre yoğunluğu vardır¹⁶^,¹⁷. Mammospheres morfolojisi bu belirsizliği gidermek için bilgilendirici olabilir. Sadece kompakt, yuvarlak küreler her pasajın sonunda numaralandırılmalıdır. Hem küresellerin daireselliği hem de boyutu göz önünde bulundurulmalıdır. DIA'nın otomatik leştirilmiş işlemi kullanılarak, bu adım uygun eşiklerle objektif ve mutlak bir şekilde sağlanır. Genellikle, ataları mamosfer sayımları dışında tutulmalıdır acinar yapılar veya hücrelerin daha küçük kümeleri oluşturacaktır. Başparmak kuralı olarak, 100 μm çapında bir eşik kullanırız. Son olarak, sağlam veya tamamen ayrıştırılmış olmayan mammopsheres bir pasajdan diğerine transferi önlemek için dikkatli olmalıdır. Öte yandan, aşırı pipetleme artan hücre ölümüne yol açacaktır. Bu nedenle, bu tür zorluklarla karşılaşılırsa, hafif tripsinizasyon veya Accutase tedavisi kullanmanızı ve tek hücreli süspansiyonların oluşmasını sağlamak için ayrık küreleri 40 μm'lik bir süzgeçten geçirmenizi öneririz.

Küre şekillendirme verimliliği (SFE) alternatif olarak, mammosphere kültürlerde SC veya CSC quantitation ex vivo için bir vekil olarak kullanılmıştır. SFE gerçekten belirli bir hücre popülasyonundaki kök benzeri hücrelerin bir ölçüsüdür. Ancak, yalnızca farklı zaman noktalarında bilgi sağladığından daha az vicdanlı bir yaklaşımı temsil eder. Bunun yerine, kümülatif küre sayılarının hesaplanması ve kümülatif büyüme eğrilerinin üretilmesi, kültürün ilk hücre tohumlama adımından kültür tükenene kadar ya da ölümsüzleştirilmiş kültürlerde istenilen sayıda geçit için kültür büyüme hızının çıkarımını sağlar. Büyüme özelliklerinin değerlendirilmesi, katsayı R² ile üstel büyümeden sapmanın değerlendirilmesine ve ikinci adımda GR değerinin kendisinin değerlendirilmesine olanak sağlar.

Daha da önemlisi, kümülatif mammosfer büyüme eğrileri csc düzeyinde seçici küçük molekül inhibitörleri veya diğer kemoterapötik ilaçların etkisini değerlendirmek için kullanılabilir⁶^,¹¹. 5-7 pasajda fonksiyonel olarak egzoz normal primer mammospheres aksine, tümör mammospheres süresiz olarak genişletmek eğilimindedir. Bu özellik sınırsız CSC kendini yenileme yeteneği ile bağlantılıdır. Proliferasyon ve CSC kendini yenileme üzerindeki etkileri tümör hücresi ve mammosphere büyüme eğrileri üretimi ile uncoupled olabilir, sırasıyla. Bir CSC özgü etkisi kümülatif mammosphere büyüme hızında bir azalmaya neden olması bekleniyor, veya kümülatif hücre büyüme hızı üzerinde etkisi olmadan⁶^,¹¹.

Son olarak, ilgi başka bir alan yetişkin doku SC yeniden programlama biridir. Tam olarak yetiştirilen mammospheres bir fenotipik heterojen hücre popülasyonu oluşur, hangi sadece küçük bir kesir kök benzeri özellikleri korur, vivo nakli üzerine mammosphere başlatma yeteneği ve meme bezi rejenerasyonu da dahil olmak üzere⁶^,⁹^,¹¹^,¹⁸^,¹⁹. Meme ataları böylece ya in vitro etiket istinat tahlilleri kullanılarak izole edilebilir⁶^,⁹^,¹¹ veya, ex vivo, kurulan yüzey belirteçleri kullanarak²^,³. Özellikle, meme ataları anoikis hayatta değildir ve mammospheres oluşturmak mümkün değildir. Zorunlu Myc ifade meme ataları PKHneg olarak izole mammosphere inisiyasyon potansiyeli vermek için gösterilmiştir¹¹, süresiz olarak geçilebilir bir kültürün nesil sonuçlanan. Benzer şekilde, fizyolojik yeniden programlama negatif düzenleyicilerin girişim aynı test kullanılarak test edilebilir. Bu bağlamda, ortaya çıkabilecek ortak bir sorun hücre girişi sınırlı sayıda. Hücre girişi 10.000 hücreden daha düşükse, 24 kuyulu tabaklarda (maksimum 5.000 canlı hücre/mL) tohumlamanızı öneririz. Bununla birlikte, ankraj bağımsız kültür koşulları, özellikle yeniden programlama etkisi hemen olmadığı durumlarda, yeniden programlama puanlama için çok sert olduğu kanıtlanabilir. Bu gibi durumlarda, destekleyici bir matris ve 3 boyutlu organoid kültürlerin kullanımı daha uygun olabilir²⁰.

Genel olarak, mammosphere test kolayca normal ve tümöral MEC popülasyonlarında kök benzeri özellikleri puanlama için istihdam edilebilir maliyet-etkin bir seçenektir. Bu protokolde alınan nicel yaklaşım, farklı koşullarda veya farklı uyaranlara maruz kalan kültürler arasındaki karşılaştırmaları kolaylaştırır. Titizlikle takip edildiğinde, daha ayrıntılı mekanistik çalışmalar imkanı sunan, in vivo kök özellikleri tanımlayan birden fazla oyuncu ayrılmasına izin veren nispeten basit bir ex vivo model sistemi sağlar.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Biz Rosa26-MycER transgenik fare modeli tür hediye için Bruno Amati teşekkür ederiz. Bu çalışma WWCR, AIRC, ERC ve İtalya Sağlık Bakanlığı'ndan P.G.P. T.V. ve X.A.'ya verilen hibelerle finanse edilmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
ACK lizis tamponu	Lonza	10-548E	Amonyum-klorür-potasyum lizis bufer, 100 mL.
B27	Invitrogen	17504-044	B27 takviyesi 50X (10 mL). Nihai konsantrasyon %2 v/v.
bFGF	Peprotech	100-18B	İnsan rekombinant fibroblast büyüme faktörü - bazik, 50 >. Stok çözeltisi 100 &�; g/μ Tris 5 mM pH 7.6'da L. Son seyreltme %0.02 v/v.
Kollajenaz	Sigma	C2674	Clostridium histolyticum'dan kollajenaz. Tip I-A, liyofilize toz, 1 g. DMEM'de 20.000 U/mL stoklayın. Son seyreltme %1 v/v.
DMEM	Lonza	12-614F	Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle'ın orta
DPBS	Microgem'i	S17859L0615	Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu su
EGF'si	Tebu-Bio	AF-100-15	Rekombinant insan epitel büyüme faktörü. Stok çözeltisi 100 μ steril dH₂O'da g/mL. Nihai seyreltme% 0.02 v/v.
Glutamin	Lonza	17-605E	L-Glutamin, 200 mM. Son seyreltme %1 v/v.
Heparin	PharmaTex	34692032	Stok konsantrasyonu 5.000 IU/mL. Son seyreltme %0.008 v/v.
Hyaluronidaz	Sigma	H4272	Tip IV-S, toz, 750-3.000 U / mg katı, 30 mg. Steril dH_{2< / sub>O'da stok çözeltisi 10 mg / mL. Nihai seyreltme% 1 v / v.}
Hidrokortizon	Sigma	H0888	Stok konsantrasyonu 100 μ g/mL'dir. Son seyreltme %0,5 v/v.
İnsülin	SAFCBiosciences	91077C	İnsülin, insan rekombinant, kuru toz, 250 mg. Stok konsantrasyonu 1 mg / mL. Son seyreltme %0,5 v/v.
Düşük ataşmanlı 6 oyuklu plakalar	Corning	351146	Steril 6 kuyulu işlem görmemiş, şeffaf düz tabanlı ve kapaklı hücre kültürü plakaları.
MEBM	Lonza	CC-3151	Meme epitel hücre büyümesi bazal ortam
Penikllin-Streptomisin karışımı	Lonza	17-602F	10.000 U potasyum penisilin ve 10.000 & içerir; % 0.85 tuzlu su içinde mL başına g streptomisin sülfat. Son seyreltme %1 v/v.
Poly-HEMA	Sigma	P3932	Gece boyunca 55 ° C'de% 95 EtOH içinde çözülür. Stok konsantrasyonu% 12 w / v. Nihai seyreltme% 95 EtOH içinde% 1 v / v. Filtre (0.22 μ m) kullanmadan önce.

Kaynaklar

Kordon, E. C., Smith, G. H. An entire functional mammary gland may comprise the progeny from a single cell. Development. 125 (10), 1921-1930 (1998).
Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
van Amerongen, R., Bowman, A. N., Nusse, R. Developmental stage and time dictate the fate of Wnt/beta-catenin-responsive stem cells in the mammary gland. Cell Stem Cell. 11 (3), 387-400 (2012).
Van Keymeulen, A., et al. Distinct stem cells contribute to mammary gland development and maintenance. Nature. 479 (7372), 189-193 (2011).
Cicalese, A., et al. The tumor suppressor p53 regulates polarity of self-renewing divisions in mammary stem cells. Cell. 138 (6), 1083-1095 (2009).
Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes & Development. 17 (10), 1253-1270 (2003).
Grimshaw, M. J., et al. Mammosphere culture of metastatic breast cancer cells enriches for tumorigenic breast cancer cells. Breast Cancer Research. 10 (3), R52(2008).
Pece, S., et al. Biological and molecular heterogeneity of breast cancers correlates with their cancer stem cell content. Cell. 140 (1), 62-73 (2010).
Ponti, D., et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Cancer Research. 65 (13), 5506-5511 (2005).
Santoro, A., et al. p53 Loss in Breast Cancer Leads to Myc Activation, Increased Cell Plasticity, and Expression of a Mitotic Signature with Prognostic Value. Cell Reports. 26 (3), 624-638 (2019).
Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
Gao, H., et al. Murine mammary stem/progenitor cell isolation: Different method matters? Springerplus. 5, 140(2016).
Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
Murphy, D. J., et al. Distinct thresholds govern Myc's biological output in vivo. Cancer Cell. 14 (6), 447-457 (2008).
Bailey, P. C., et al. Single-Cell Tracking of Breast Cancer Cells Enables Prediction of Sphere Formation from Early Cell Divisions. iScience. 8, 29-39 (2018).
Lombardo, Y., de Giorgio, A., Coombes, C. R., Stebbing, J., Castellano, L. Mammosphere formation assay from human breast cancer tissues and cell lines. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
Peng, T., Qinghua, M., Zhenning, T., Kaifa, W., Jun, J. Long-term sphere culture cannot maintain a high ratio of cancer stem cells: a mathematical model and experiment. PLoS One. 6 (11), (2011).
Smart, C. E., et al. In vitro analysis of breast cancer cell line tumourspheres and primary human breast epithelia mammospheres demonstrates inter- and intrasphere heterogeneity. PLoS One. 8 (6), (2013).
Panciera, T., et al. De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Meme Kök Hücreleri Primer Meme Epitel Hücreleri Seri Pasajlama Sfer Boyutu Kantifikasyonu ImageJ Analizi Myc Ekspresyonu Öz-Yenilenme Değerlendirmesi Hücre Kültürü Protokolü Büyüme Hızı Ölçümü

Murine Mammosphere Kültürlerde Kendini Yenileme Nin Niceliği