Histon deasetilez (HDAC) inhibitörü kullanılarak yapılan üç boyutlu (3D) invazyon tahlillerinde migrastatik inhibitörlerin glioma kanser hücresi göçü üzerindeki etkileri yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi ile karakterizedir.
Method Article
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
|---|---|---|---|
| Kollajen I, sıçan kuyruğu, glioma | Corning | 354236 | ; Bu, birçok distribütör / üretici tarafından sunulmaktadır ve hem amaçlanan test türü hem de kullanılan hücre hatları için belirlenmesi gerekecektir. Glioma kanseri hücre hatları için Kollajen sıçan kuyruğu tip 1 (örneğin Corning) tercih edilen seçimdir. Kollajen 4 ° C'de saklanmalıdır; C, karanlıkta, gerekene kadar. Polimerize kollajenin kıvamını etkileyebileceğinden, kollajenin farklı partilerden karıştırılması tavsiye edilmez. |
| Glioma | |||
| DMEM tozu | Sigma | D5648 | ; Bu, toz halinde satın alınabilir, çift damıtılmış suda yapılabilir ve büyüme ortamının nihai bileşimine bağlı olarak, gerekli herhangi bir katkı maddesi ile tamamlanabilir. Komple 5x çözelti bir şırınga filtre sisteminden (0.22 & mu; m) kullanmadan önce. |
| Glioma hücre hatlarının hücre kültürü için gerekli | fetal buzağı serumu | Sigma | F7524-500ML |
| Mikroskopi görüntüleme için | çeşitli | cam slaytlar | |
| Yüksek glikozlu DMEM | Gibco | 41965062 | glioma hücre hatlarının hücre kültürü için gereklidir |
| İnhibitör | Tocris | çeşitli | çeşitli - deneysel tasarıma göre; inhibitörler Selleckchem ve Tocris gibi üreticilerden satın alınabilir. Bu üreticiler, inhibitör özelliklerinin ayrıntılı açıklamasını, ilgili referanslara bağlantılar ve çalışma konsantrasyonları önerilerini sunar. Tüm inhibitörlerde olduğu gibi, potansiyel olarak toksik olabilirler ve sağlık ve güvenlik yönergelerine göre ele alınmalıdırlar. İnhibitörler, üretici tarafından tavsiye edildiği şekilde stok çözeltileri olarak hazırlanır. Örnek olarak, bu tür inhibitörlerin kullanımını göstermek için migrastatik inhibitör MI-192'yi kullandık. Bu şekilde bir dizi migrastatik inhibitörü karşılaştırılabilir sonuçlarla test ettik. |
| Mikroskobik görüntüleme için | çeşitli | ||
| montaj NaOH (1 M) | çeşitli | çeşitli | NaOH, gerekli molaritede satın alınabilir veya katı formdan hazırlanabilir. Hazırlanan çözelti, bir şırınga filtre sistemi kullanılarak filtre ile sterilize edilmelidir. Bir M NaOH aşındırıcıdır ve çözelti hazırlanırken dikkatli olunmalıdır. |
| Paraformaldehit | sferoidleri ve hücreleri sabitlemek için çeşitli çeşitli; % 4'te makyaj yapın, sağlık tehlikesine dikkat edin, sağlık ve güvenlik düzenlemelerine uyulduğundan emin olun İstila testi için kollajen çözeltisi | ||
| Pastetler (dereceli pipet, 3 mL) | istila testi için | çeşitli | çeşitli |
| PBS, doku kültürü için steril | Sigma | D1408-500ML & nbsp; | Glioma hücre hatlarının hücre kültürü için gereklidir ve boyama için yıkamalar |
| Kalem / strep (antibiyotikler) | Glioma hücre hatlarının hücre kültürü için gerekli | Sigma | P4333 |
| Birincil antikor, ikincil antikor, DAPI, Phalloidin | çeşitli | bu | reaktifler için birçok üretici vardır, ikincil etiketli antikorlar için Alexa Fluor (Moleküler Problar) öneririz. Burada primer antikorlar için fare anti-asetillenmiş tübülin antikoru (1/100, Abcam) kullandık. İkincil antikorlar için 1/500 anti-fare Alexa Fluor 488 konjuge antikor, Moleküler Problar kullandık. Nükleer leke için DAPI (birçok üretici) ve aktin boyası Phalloidin (birçok üretici) kullandık, her ikisi de önerilen 1/500 seyreltmede kullanıldı. |
| 5x konsantrasyonda glioma invazyon testi için kollajen çözeltisi için gerekli | sodyum bikarbonat | Sigma | S5761 |
| Sodyum piruvat | Sigma | P5280 | 5x konsantrasyonda glioma invazyon testi için kollajen çözeltisi |
| Tripsinizasyon için tripsin | Sigma T4049 | ||
| Ultra düşük bağlantı plakaları | Sigma / Nunc | CLS7007-24EA | glioma invazyon testi için; İncelenen bileşiklerin büyük ölçekli taranmasına izin vermek için tercih edilen 96 oyuklu plakalar ile düşük yapışkan bir plaka gereklidir. Piyasada bulunan birkaç düşük yapışma plakası vardır; Optimum sferoid üretimi için çeşitli plakaların test edilmesi tavsiye edilir. Deneyimlerimize göre, kapaklı, yuvarlak tabanlı Costar Ultra Low Cluster, %100 sferoid oluşumu ve tekrarlanabilirlik açısından glioma kanser hücrelerinden sferoid üretimi için en iyi sonucu verir. Bu plaklar ayrıca laboratuvarımızda hasta kaynaklı materyal, mesane ve yumurtalık kanseri hücrelerinden glioma sferoidlerinin üretilmesi için başarıyla kullanılmıştır. Ek olarak, standartlaştırılmış nörosfer sferoidlerinin oluşumunu kolaylaştırmak için bu plakalarda kök veya progenitör nöroküreler kullanılabilir |
| Striptizler (serolojik pipetler, steril, 5 mL ve 10 mL) | çeşitli, örneğin Costar | CLS4488-50; Doku | kültürü ve kollajen hazırlama için |
| Çeşitli çok kanallı (50 - 250 μ L) ve tek kanallı pipetler (10 μ L, 50 μ L, 200 μ L 1 mL) | hücre ve sferoid kullanımı için | çeşitli | |
| Geniş alan mikroskobu | çeşitli | sferoid oluşumunun ve sferoid görüntülemenin gözlemlenmesi için çeşitli; burada geniş alanlı floresan görüntüleri, bir EVOS FL hücre görüntüleme sistemi (Thermo Fisher Scientific) kullanılarak yakalandı.Plan | |
| Apochromat 63x 1.4 NA yağ objektifi ile donatılmış Zeiss LSM 880 CLSM | Üreticiden | Zeiss | Confocal görüntüler, Plan Apochromat 63x 1.4 NA yağ objektifi ile donatılmış bir Zeiss LSM 880 CLSM kullanılarak çekildi. Diyot 405nm, 458/488/514 nm argon multiline ve HeNe 594nm lazerler sırasıyla Phalloidin 594, Alexa Fluor 488 ve DAPI'yi uyarmak için kullanıldı. Her görüntü için tek bir temsili optik bölüm yakalandı ve hem görüntü yakalama öncesi hem de sonrası tüm ayarlar karşılaştırmalı amaçlar için korundu. Tüm görüntüler daha sonra ilgili Zen görüntüleme yazılımı ve Adobe Photoshop kullanılarak işlendi. |
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request Permission