Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Eş-Kültürlerde M1 Makrofaj-4T1 Fare Mammary Karsinom Hücrelerinde Fagositik Aktivitenin Zaman Atlamalı 2D Görüntülemesi

8.9K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/60281

⸱

14 Aralık 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell and Molecular Biology, Faculty of Biotechnology and Biomolecular Sciences, Universiti Putra Malaysia, 2Institute of Tropical Forestry and Forestry Products (INTROP), Universiti Putra Malaysia, 3Department of Biomedical Science, Faculty of Medicine, University of Malaya, 4Agro-Biotechnology Institute (ABI), National Institute of Biotechnology Malaysia (NIBM)

Bu makalede

Özet

Bu çalışmada kanser hücrelerine karşı makrofaj fagositik aktivite, özellikle 4T1 fare meme karsinom hücreleri görüntülendi. Canlı hücre kokültür modeli floresan ve diferansiyel girişim kontrast mikroskobu kombinasyonu kullanılarak oluşturulmuş ve gözlenmiştir. Bu değerlendirme, çok noktalı hızlandırılmış video geliştirmek için görüntüleme yazılımı kullanılarak görüntülendi.

Özet

Tümörilişkili makrofajlar (TAM) tümör büyümesi, invazyon, metastaz ve kanser tedavilerine karşı direnç için önemli bir bileşen olarak tanımlanmıştır. Ancak, tümör ilişkili makrofajlar tümör mikroçevrebağlı olarak tümör için zararlı olabilir ve geri ya bağışıklık hücrelerinin sitotoksik aktivitesi niantüre veya anti-tümör yanıtı artırarak onların fenotipik özelliklerini değiştirebilir. Makrofajların moleküler eylemleri ve tümör hücreleriyle etkileşimleri (örn. fagosittoz) kapsamlı olarak incelenmemiştir. Bu nedenle, bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşim (M1/M2-subtype TAM) ve tümör mikroortamında kanser hücreleri arasındaki etkileşim artık kanser immünoterapi araştırmalarının odak noktasıdır. Bu çalışmada, faz kontrastı, floresan ve diferansiyel girişim kontrastı (DIC) mikroskobu kullanılarak makrofajların fagositik aktivitesini değerlendirmek için indüklenen M1 makrofajlar ve fare meme 4T1 karsinom hücrelerinin canlı hücre kokültür modeli geliştirilmiştir. Bu yöntem fagositözün çok noktalı canlı hücre görüntülemesini gözlemleyebilir ve belgeleyebilir. 4T1 hücrelerinin M1 makrofajları ile fagosittozisi, karboksifluorescein succinimidyl ester (CFSE) ile 4T1 hücrelerini boyamadan önce floresan mikroskopi ile görülebilir. Mevcut yayın, makrofajları ve tümör hücrelerini tek bir görüntüleme kabında nasıl birarada hale getirmek, M1 makrofajları polarize etmek ve 13 saat boyunca 4T1 hücresini içine alan makrofajların çok noktalı olaylarını kaydetmeyi açıklamaktadır.

Giriş

Makrofajlar bağışıklık savunmasının ilk hattıdır ve kanser hücreleri de dahil olmak üzere patojenlere ve yabancı maddelere karşı bağışıklık yanıtlarının düzenlenmesinde rol oynarlar. Onlar yok eder ve vücutta istenmeyen parçacıklar kurtulur özel bir fagosit vardır. Makrofajlar apoptotik hücrelerin ve mikroorganizmaların temizlenmesi ve diğer bağışıklık hücrelerinin işe alınması gibi savunma fonksiyonları katkıda1. Makrofajlar, çevresel sinyallere yanıt olarak M1 ve M2 makrofajları olmak üzere iki farklı tipe ayırabilir2. M1-polarize makrofajlar (yani, klasik olarak aktive makrofajlar) sitokin interferon-γ (IFN-γ) ve lipopolisakkaritler (LPS) tarafından aktive edilir ve inflamatuar yanıt, patojen açıklık, etkin fagositoz ve tümörial bağışıklık3,4katılır. M2 makrofajlar yakından tümör ilişkili makrofajlar ile ilgili (TAMs) ve anti-inflamatuar ve tümör promosyonözellikleri4 var.

Fagositoz, Antik Yunanca 'dan türetilmiştir (fajin), anlamı "yutmak", (kytos), anlamı "hücre", ve -osis, anlamı "süreç"5. Fagosittoz, fagositlerin (makrofajlar, monositler ve nötrofiller dahil) istilacı patojenleri öldürüp yuttuğu, yabancı parçacıkları temizlediği ve apoptotik hücre enkazlarını temizlediği reseptör aracılı bir süreçtir. Tümör ilişkili makrofajlar (TAM) meme kanseri de dahil olmak üzere farklı tümörlerde stroma bulunur, ve pro-tümör fonksiyonları var6,7, fagosityolis direnç ile sonuçlanan. Makrofajlar ile tümör hücrefagositozunun detaylı mekanizması henüz anlaşılamamıştır.

Bu çalışmada iki aşamalı bir yöntem ortaya konmaktadır: 1) 4T1 fare meme karsinom hücreleri ve M1-polarize makrofajlar birlikte kültürlenmiş, ve 2) makrofajların fagositik aktivitesi canlı hücreli video mikroskopisi kullanılarak değerlendirilmektedir. CFSE floresan boya 4T1 fare meme karsinom hücreleri leke kullanılmıştır. Leke etiketler 4T1 hücreleri tek bir görüntüleme çanak içinde cocultured M1 makrofajlar onları ayırt etmek için. RAW 264.7 makrofajlar LPS ve IFN-γ ile M1 fenotip içine polarize edilir. Tam bir polarizasyon sağlamak için FITC'ye konjuge anti-iNOS antikorile immünoleme yapıldı. Daha sonra, zaman atlamalı görüntülerin çok noktalı bir dizi eşkültür içinde, fagositoksis de dahil olmak üzere birden fazla olay gözlemlemek için elde edildi.

Tümör hücreleri ve makrofajlar arasındaki etkileşimlerin daha iyi anlaşılması potansiyel kanser immünoterapisine yol açabilir. Canlı hücre görüntüleme gerçek zamanlı bir ortamda hücresel dinamiklerin ayrıntılı bir görünüm sunar ve hücre göçü, fenotipik tarama, apoptoz ve sitotoksisite8,9 nörobilim, gelişimsel biyoloji ve ilaç keşfi çalışma için kullanılmıştır. Bu çalışmada önerilen tümör meme kanseri olmasına rağmen, yöntem aynı zamanda birden fazla hedef hücreleri ve farklı etki hücreleri uygulanabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

NOT: Bölüm 1−6 4T1 fare meme karsinom hücrelerinin ve RAW 264.7 fare makrofajlarının eşkültür modelini tanımlar. Bölüm 7, Fagosilenmiş 4T1 hücrelerinin M1 makrofajlarının hızlandırılmış değerlendirmesini açıklar.

1. Culturing 4T1 fare meme karsinom hücreleri ve RAW 264.7 fare makrofajlar

  1. 37 °C'de bir su banyosunda hafif ajitasyon veya hücre hatları için normal büyüme sıcaklığı ile kriyojenik olarak korunmuş 4T1 ve RAW 264,7 passage 6 hücrelerinden oluşan bir şişeyi eritin.
    NOT: Erime hızlı bir şekilde, yaklaşık 2 dakika içinde yapılmalıdır. Kontaminasyonu önlemek için, su banyosundan şişeyi çıkarın ve %70 etanol püskürterek dezenfekte edin. Genetik sürüklenme önlemek için, özellikle makrofajlar için, düşük bir geçiş numarası kullanın (yani, az 20).
  2. 15 mL konik tüp içinde tam DMEM orta 10 mL çözülmüş hücreleri seyreltmek ve bir hücre pelet elde etmek için 5 dakika için 600 x g hücreleri santrifüj.
    NOT: Protokol boyunca %10 (v/v) fetal büyükbaş hayvan serumu (FBS), 200 U/mL penisilin/streptomisin ve 2 mM L-glutamin ile takviye edilen komple DMEM ortamı kullanılmaktadır.
  3. Dikkatlice medya aspire, tam orta 8 mL hücreleri resuspend ve 25 cm2 doku kültürü tedavi şişe içine transfer. Kültür hem 4T1 ve RAW 264.7 hücreleri tam DMEM orta 37 °C% 5 CO2ile .
    NOT: Hücre peletlerini yavaşça askıya alın ve hücreleri öldürmemek için hücre yiğindamla damlasına kadar hücre süspansiyonunu kültür şişesine ekleyin.
  4. Hücre yapışmasına izin vermek için 1 haftalık bir kültürden sonra, şişeyi günlük olarak izleyin ve gerektiğinde 8 mL tam DMEM ortamı ekleyin.

2. M1 polarize RAW 264.7 makrofajların immünboylemi

  1. RAW 264.7 hücrelerinin birleşmesi %70−80'e ulaştığında, kültür ortamını atın ve en az 2 mL PBS ile 2 kat hafifçe durulayın.
    NOT: RAW 264.7 hücrelerini tohumlamadan önce, hücre farklılaşmasının (örn. dendrit benzeri fenotip ve/veya artan hücre boyutu) meydana gelmediğinden emin olun. Hücre morfolojisi değişiklikleri görünürse, kültürü atın ve önceki geçiş şişesinden yeni bir hücre hattını eritin.
  2. Bir hücre kazıyıcı kullanarak yapışık hücreleri yavaşça etkisiz hale getirerek makrofajları toplama için hazırlayın ve bunları 15 mL konik tüpe aktarın.
  3. Hücreleri hemositometre kullanarak sayın ve tam DMEM ortamını kullanarak 1 x 105 hücre/çanak hücre süspansiyonu hazırlayın.
  4. Makrofajların tohum 2 mL'si iki görüntüleme yemeğine süspansiyon. Hücreleri 2−3 h 37 °C'de %5 CO2 ile tüpaltında tünyolayın ve hücre yapışmasını bekleyin.
  5. Komple DMEM orta10içine100 ng/mL LPS ve 20 ng/mL IFN-γ ekleyerek M1 polarizasyon ortamını hazırlayın,11.
  6. Makrofajlardan kültür supernatant atın ve dikkatle PBS en az 1 mL ile çanak 2x monolayers yıkayın.
  7. Görüntüleme türlerinden birine 2 mL M1 polarizasyon ortamı ekleyin, RAW 264.7 hücrelerinin M1 makrofaj fenotipini indüklemesine izin verin ve %5 CO2ile 37 °C'de 2-3 saat kuluçkaya yatırın.
    NOT: Anti-iNOS antikor boyama için bir kontrol olarak% 10 FBS ile desteklenen DMEM ile bir görüntüleme çanak tohum RAW 264.7 makrofajlar. Görüntüleme bulaşıklarını sırasıyla RAW (kontrol) ve M1 makrofajlarını (LPS ve IFN-γ polarize) etiketleyin.
  8. İmmün boyamadan önce RAW 264.7 ve M1 makrofaj hücrelerini 2 mL 4 paraformaldehit ve 15 dakika boyunca 37 °C'de (oda sıcaklığında, RT) kullanarak düzeltin.
  9. Supernatant çıkarın ve en az 3x PBS 1 mL ile hücre monolayer yıkayın.
  10. PBS'de 2 mL 50 mM amonyum klorür ve RT'de 15 dakika kuluçkaya yatın.
  11. RT'de 15 dakika boyunca PBS'de %0,3 Triton X-100'ün 2 mL'sini kullanarak permeabilize edin.
  12. Supernatant çıkarın ve en az 3x PBS 1 mL ile hücre monolayer yıkayın.
  13. RT'de 30 dk pbs'de %10 FBS'nin 2 mL'sini kullanarak engelleyin.
    NOT: İmmünboyamada engelleme adımı hücre içindeki antikorların spesifik olmayan bağlanmasını en aza indirmektir.
  14. Supernatant çıkarın ve en az 3x PBS 1 mL ile hücre monolayer yıkayın.
  15. PBS'de 2 mL anti-iNOS-FITC ve 4 °C'de bir gecede %1 FBS ile inkübat.
    NOT: Hücreleri üreticinin tavsiyelerine uygun antikor seyreltme sini kullanarak etiketlendirin. Bu noktadan itibaren alüminyum folyo ile kaplayarak bulaşıkları ışıktan koruyun.
  16. Supernatant çıkarın ve en az 3x PBS 1 mL ile hücre monolayer yıkayın.
  17. 300 nM 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) 10 dakika boyunca 37 °C'de, karanlıkta alüminyum folyo ile kaplayarak görüntüleme yemekleri içine 1 mL incubate.
  18. Hücreleri 1 mL PBS ile en az 3x yıkayın ve görüntüleme yemeklerine 1 mL tam DMEM ortamı ekleyin.
    NOT: Hücreler floresan görüntüleme için hazırdır. Mikroskop kurulumu, seçilen lekeler (bu durumda, FITC ve DAPI) için ters bir aşama ve uyarma filtrelerine ihtiyaç duyacaktır.
  19. Mikroskobu açın ve görüntüleme yazılımını yükleyin. Görüntüleme çanağını mikroskoba yerleştirin ve RAW 264.7 ve M1 makrofajlarını gözlemlemek için odağı ayarlayın. Aktarılan ışığı ve pozlama sürelerini ayarlayarak faz kontrastlı FITC ve DAPI görüntülerinin görünümünü optimize edin.
    NOT: Tüm noktalar odaklandığında ve kanallar optimize edildiğinde görüntülemeye başlayın.
  20. Faz kontrastı FITC ve DAPI görüntülerini yakalayın (Şekil 1).

3. Tohumlama 4T1 fare meme karsinom hücreleri

  1. 4T1 hücrelerinin birleşmesi %70−80'e ulaştığında, kültür ortamını atın ve en az 2 mL PBS ile 2x hafifçe durulayın. Hücreleri ayrıştırmak ve 37 °C'de 20 dakikaya kadar kuluçkaya yatırmak için önceden ısıtılmış tripsin 1 mL ekleyin.
    NOT: Hücreleri mikroskop altında gözlemleyin. Ayrılmış hücreler yuvarlanır.
  2. Hücreler bir kez kopup, 15 mL konik bir tüp e aktarın ve trypsin inaktive etmek için önceden ısıtılmış tam DMEM orta 2 mL ekleyin. Hücreleri kurtarmak için hücre tabakası yüzeyini boruya tutarak ortamı yavaşça dağıtın. Daha sonra, bir hücre pelet elde etmek için 5 dk için 600 x g santrifüj.
  3. Supernatant çıkarın ve önceden ısıtılmış tam DMEM orta 10 mL pelet resuspend.
  4. Doku kültürü ile tedavi edilen iki adet 35 mm cam dipli görüntüleme çanaklarının her birinde tam DMEM ortamının 2 mL'sinde hemositometre ve tohum 1 x 105 4T1 hücre kullanarak hücreleri sayın. Hücreleri bir gecede %5 CO 2 ile 37 °C'de kuluçkayayatırın.
    NOT: M1 polarizasyon ortamı ve etiket 4T1-Inducer (kontrol) ile görüntüleme yemeklerinden birinde Kültür 4T1 hücreleri. Bu indükleyiciler maruz kaldığında 4T1 hücrelerinin normal büyümesini sağlamaktır.

4. CFSE boyama kullanarak yaşayan 4T1 fare meme karsinom hücrelerinin etiketlanması

  1. İlk olarak, 4T1 hücreleri görüntüleme bulaşıkları mevcut medya kaldırın. Hücre monokatını en az 2x PBS 1 mL ile yıkayın.
  2. CFSE'yi 1 mL PBS'de seyrelterek 5 m CFSE boyama çözeltisi hazırlayın. Her görüntüleme kabına 1 mL 5 mCFSE boyama çözeltisi ekleyin ve hücreleri karanlıkta 20 dakika RT veya 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
    NOT: Optimum CFSE boyama konsantrasyonunu elde etmek için hücreleri üreticinin önerilerine ve ön deneylere uygun CFSE çalışma konsantrasyonu kullanarak etiketlendirin. CFSE PBS'de seyreltilirse etiketleme verimliliği daha yüksek olacaktır.
  3. Hücrelere %10 FBS ve boyama çözeltisi içeren eşit hacimli tam DMEM ortamı ekleyerek boyamayı söndürün ve karanlıkta RT'de 5 dakika kuluçkaya yatırın.
  4. CFSE içeren çözeltiyi atın ve hücreleri eşit hacimli kültür ortamıyla 1kat yıkayın.
    NOT: 4T1 hücreleri artık floresan olarak etiketlenmiştir.
  5. 4T1-CFSE hücrelerini %5 CO2 ile RT'deki standart kültür koşullarına geri döndürün.

5. 4T1 ile SEEDing RAW 264.7 fare makrofajları ve coculture

  1. RAW 264.7'nin birleşimi %70−80'e ulaştığında, kültür ortamını atın ve en az 2 mL PBS ile 2x hafifçe durulayın.
  2. Bir hücre kazıyıcı kullanarak yapışık hücreleri yavaşça etkisiz hale getirerek makrofajları toplama için hazırlayın ve bunları 15 mL konik tüpe aktarın.
  3. Hücreleri hemositometre kullanarak sayın ve kalan çözeltiyi tohumlama yoğunluğuna göre tam bir DMEM ortamı ile seyrelterek 1 x 105 hücre/mL'lik bir hücre süspansiyonu hazırlayın.
    NOT: Kokültürdeki aşırı konfluent hücreler fagositozu ciddi şekilde azaltabilir. Bu çalışmada makrofajların tohumlama oranı: kanser hücreleri 1:1 oranına göre ayarlanmıştır. Oran tümör hücrelerinin agresifliği ve makrofajların kökenine bağlı olarak ayarlanabilir.
  4. Kokülatyapmadan önce, bir gün önce tohumlanan 4T1 hücrelerinden (adım 4.5) kültür süpernatantını atın ve monolayers 2x'i en az 1 mL PBS ile dikkatlice yıkayın.
  5. Tohum 1 x 105 RAW 264.7 hücreleri 2 mL tam DMEM orta 4T1 görüntüleme yemeklerinden birine. Hücreleri 2−3 h 37 °C'de %5 CO2 ile tüpaltında tünyolayın ve hücre yapışmasını bekleyin. Görüntüleme çanak 4T1-M1 coculture etiket.
    NOT: 4T1 (kontrol) hücreleri makrofajlarla birlikte kullanılmadı.

6. RAW 264.7 makrofajların M1 polarizasyonu

  1. %10 (v/v) FBS10,11ile tamamlanan komple DMEM ortamına 100 ng/mL IFN-γ ekleyerek M1 polarizasyon ortamını hazırlayın.
  2. Önce kuluçkaya yatan makrofajlardan (adım 5.5) kültür supernatant'ı atın ve en az 1 mL PBS ile çanak 2x'teki monokatmanları dikkatlice yıkayın.
  3. Daha sonra, görüntüleme kabına 2 mL M1 polarizasyon ortamı ekleyin ve RAW 264.7 hücrelerinin 37 °C'de %5 CO2ile kuluçkaya yatarak M1 makrofaj fenotipiniçine indüklemesine izin verin.
    NOT: M1 makrofaj hücreleri tam polarizasyon elde etmek için kuluçka 2−3 saat sürebilir. Makrofajların tam kutuplaşmasına izin vermek için uygun kuluçka süresini sağlamak için ön deneyler inkübasyon yapılmalıdır.

7. Fagositözcanlı hücreli video mikroskobu

NOT: Görüntü pozlama, zaman ölçümü ve otomatik odaklama düzeltmesinin optimizasyonu da dahil olmak üzere, çoğaltılabilir bir video elde etmek için canlı hücre görüntüleme yaparken birçok faktörün göz önünde bulundurulması gerekir.

  1. Deneyden önce, 37 °C'de termostatı açarak ve %5 CO2sağlayarak hücre kültürü kuluçka makinesini ayarlayın.
    NOT: Mikroskop kurulumu ters bir evre, bir aşama üst kuluçka makinesi, nem kontrolü (%95) ve gaz kuluçka sistemi gerektirir. Bu kurulum uzun vadeli canlı hücre video mikroskobik değerlendirme için hücreleri korumak için çok önemlidir.
  2. Piezo aşaması da dahil olmak üzere mikroskobu açın ve mikroskop görüntüleme yazılımını yükleyin.
  3. Tohumlu coculture hücrelerini sahnenin ortasına 35 mm'lik cam dipli bir görüntüleme kabına yerleştirin ve üst hazneyi hafifçe vidalayın. Görüntülenecek konumu seçerek sahneyi motorize etmek için joystick'i kullanın.
  4. Örneği görüntülemek için taretüzerindeki faz kontrast filtresini seçin. Örneği ilk olarak görüntüledikten sonra, uygun alanları bulun ve örneği odak haline getirin.
    NOT: Görüntüleme yazılımı tam otomatik objektif seçimi, Perfect Focus Sistemi, hızlandırılmış serisi, çok kanallı görüntü edinimi ve çok noktalı görüntü edinimi kullanımına olanak sağlar.
  5. CFSE etiketleme ve diferansiyel girişim kontrast ı edinme için çok kanallı floresan ayarlamak için, görüntüleme yazılımı edinme iletişim kutusunu açın ve [Lambda] sekmesi onay kutusunu seçin(Şekil 2).
    NOT: 13 saatlik hızlandırılmış görüntüleme için faz kontrastlı bir kanal kullanılmalıdır.
  6. [Lambda] sekmesini seçin | [Optik Yapılandırma] ve diferansiyel girişim kontrastı için [10X DIC] ve yeşil floresan filtre onay kutusu için [GFP-R] seçeneğini belirleyin. [Lambda] altında | [Odak] sütununda, odak başvurusu olarak ayarlamak üzere [10X DIC] onay kutusunu seçin.
  7. Görüntüleme yazılımı edinme iletişim kutusunu açın ve [XYZ Saati ...] düğmesini tıklatın ve [XY] sekmesini seçin.
  8. Canlı görüntüyü kontrol ederken motorlu sahnedeki joystick'i kullanarak görüntü edinme noktasına geçin veya göz lerden farklı bir konum seçin. Ardından,[Nokta Adı] sütunun altındaki onay kutusunu tıklattığınızda, görüntü yakalama için her konumdaki her noktayı ayarlayın (Bkz. Şekil 3).
    NOT: Otomatik aşama, birden çok alanı yakalamak için farklı XY koordinatlarının çok noktalı görüntü edinimine olanak tanır.
  9. Ekranda görüntülenen her örnek için odakta ince ayar. Otomatik odaklama düzeltmesiüzerindeki denetimleri kullanın.
  10. Hızlandırılmış görüntü yakalamayı ayarlamak için yazılımı kullanın. Görüntüleme yazılımı edinme iletişim kutusunda[Zaman] sekmesini işaretleyin (Bkz. Şekil 4).
  11. [Interval] (bir zaman noktasının başlangıcı ile başka bir zaman noktası arasındaki gecikme) ve [Süre] (denemenin toplam süresi) belirleyin. Zaman birimleri değişir ve açılan menüden milisaniye (ms), saniye (s), dakika (m) veya saat (h) olarak seçilebilir.
    NOT: Floresan ve DIC hızlandırılmış çok kanallı edinimin zaman atlamalı görüntüleme söyme süresi, bu talimikullanılan floresan boyaya bağlı olarak değişebilir. Etiketli hücreler çok uzun süre maruz kalırsa fotobeyazrlama oluşabilir.
  12. Edinilen görüntüleri kaydetmek için [Dosyaya Kaydet] onay kutusunu işaretleyin. [Zaman çizelgesi] sekmesinin altında çok noktalı zaman serisi görüntüleri elde etmek için [Şimdi Çalıştır] düğmesini tıklatın (Bkz. Şekil 5).
    NOT: Görüntüleme yazılımında görüntüler nd2 dosya biçiminde kaydedilir. Her zaman atlamalı daha sonra bir MP4 dosya biçiminde ayrı ayrı kaydedilebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

4T1 fare meme karsinom hücre hatlarının coculture modelinin zaman atlamalı iki boyutlu (2D) görüntüleri, 13 saatlik bir süre boyunca M1 makrofajları tarafından yutulan 4T1 hücrelerini göstermektedir. İmmünboyama yaparak M1 makrofajlarının tam bir polarizasyonunu sağlamak önemlidir. Sonuçlar(Şekil 1)100 ng/mL lipopolisakkarit (LPS) ve 20 ng/mL IFN-γ polarize RAW 264.7 makrofajkonsantrasyonunun M1 durumuna girdiğini göstermektedir. Hedeflenen hücreleri floresan boya ile etiketlemek ve efektör ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Açıklanan protokol iki adım gerektirir: 1) 4T1 fare meme karsinom hücreleri ve M1-polarize makrofajlar coculture ve 2) zaman atlamalı mikroskopi kullanarak makrofaj fagositik aktivitenin değerlendirilmesi. Canlı hücre kokültür yaygın fagositositve göç tahlillerinde kullanılır. Canlı hücre kokültür modeli burada bir floresan boya kullanan basit, uyarlanabilir in vitro prosedürü(Şekil 2)4T1 hedefli hücreleri etiketlemek için kullanılan bir floresan boya, CFSE. Bu, canlı hücre görüntüleme sıras...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma Finansal Geran Putra Berimpak (GBP), Üniversite Putra Malezya: 9542800 tarafından finanse edilmiştir. Agro-Biotechnology Institute, Malaysia (ABI) laboratuvarları ve mikroskopi görüntüleme tesisine teşekkür ederiz. Bu çalışma için deneysel video düzenleme ve kayıt ile ilgili yardım için Mohd Daniel Hazim için özel teşekkürler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Anti-INOS antikoru, konjuge FITC,Miltenyi, BiotecREA982150 & mikro; 1 mL içinde g
Karboksifloresein süksinimidil ester (CFSE)İnvitrojenC115725 mg
DAPI (4 ',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidroklorür)İnvitrojenD130610 mg
DMEM / yüksek glikozHyCloneSH30003.04670.0 g
Fetal sığır serumuTico EuropeFBSEU500500 mL
LipopolisakkaritlerSigmaL4516-1MG1 mg
Fare rekombinant interferon-gamaKök Hücre Teknolojileri78021100 & mikro; g
Penisilin-streptomisin çözeltisiCellgro30-003-CI100 mL
Fosfat tamponlu salinSigma-AldrichP5368-10PAK10 paket
Tripsin EDTACellgro25-052-CI1X, 100 mL
1000 ve mikro; L pipet uçlarıWhiteBoxWB-301-01-0525000 uç/kutu
2 mL serolojik pipetJET BIOFILGSP012002Priyojenik olmayan
200 ve mikro; L pipet uçlarıWhiteBoxWB-301-02-30220.000 tps/kutu
25 cm2 hücre kültürü şişesiCorningCLS430639Doku kültürü ile tedavi edilmiş
Tezgah üstü santrifüjDynamicaFA15CModel: Velocity 14R
Biyolojik güvenlik çeker ocakNuaireNU-565-400Model: Ana Sayfa/ LabGard® ES TE NU-565 Sınıf II, Tip B2 Biyogüvenlik Çeker ocak
CO2/hava karıştırıcıChamlide (Canlı Hücre Cihazı)FC-R-20FC-5 (CO2/Hava Karıştırıcı) akış ölçerli
Hücre sıyırıcıNEST710001220 mm
CO2 hücre inkübatörüPanasonicN/AModel: MCO-19M(UV)
Konfokal mikroskopNikon Instruments Inc.N/ANikon Ti-Eclipse
Cam alt çanakIbidi81218-20035 mm
NIS elemanları yazılımıNikon Instruments Inc.Mevcut çevrimiçi indirme
Pipet kontrol cihazıCappAidPA-100CappController pipet kontrol cihazı, 0.1-100ml
TermostatShinkoÜretimi DurdurulanJCS-33A 48 x 48 x 96,5 mm
, ,

Kaynaklar

  1. Rostam, H. M., Reynolds, P. M., Alexander, M. R., Gadegaard, N., Ghaemmaghami, A. M. Image based Machine Learning for identification of macrophage subsets. Scientific Reports. 7 (1), 1-11 (2017).
  2. Mantovani, A., Sozzani, S., Locati, M., Allavena, P., Sica, A. Macrophage polarization: Tumor-associated macrophages as a paradigm for polarized M2 mononuclear phagocytes. Trends in Immunology. , (2002).
  3. Lee, K. Y. M1 and M2 polarization of macrophages a mini-review. 2 (1), 1-5 (2019).
  4. Martinez-Marin, D., Jarvis, C., Nelius, T., Filleur, S. Assessment of phagocytic activity in live macrophages-tumor cells cocultures by Confocal and Nomarski Microscopy. Biology Methods and Protocols. 2 (1), 1-7 (2017).
  5. Tauber, A. I. Metchnikoff and the phagocytosis theory. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (11), 897-901 (2003).
  6. Eiro, N., Gonzalez, L. O., Cid, S., Schneider, J., Vizoso, F. J. Breast Cancer Tumor Stroma: Cellular Components, Phenotypic Heterogeneity, Intercellular Communication, Prognostic ImplicationsTherapeutic Opportunities. Cancers. 11 (5), 1-26 (2019).
  7. Larionova, I., et al. Interaction of tumor-associated macrophages and cancer chemotherapy. OncoImmunology. 8 (7), 1-15 (2019).
  8. Jain, P., Worthylake, R. A., Alahari, S. K. Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (63), e3585(2012).
  9. Weiss, S., Luchman, H. A., Restall, I., Bozek, D. A., Chesnelong, C. Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion. Journal of Visualized Experiments. (138), e58152(2018).
  10. Tsitsilashvili, E., Sepashvili, M., Chikviladze, M., Shanshiashvili, L., Mikeladze, D. Myelin basic protein charge isomers change macrophage polarization. Journal of Inflammation Research. 12, 25-33 (2019).
  11. Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunological Methods. 426, 56-61 (2015).
  12. Kobelt, G., Eriksson, J., Phillips, G., Berg, J. The burden of multiple sclerosis 2015: Methods of data collection, assessment and analysis of costs, quality of life and symptoms. Multiple Sclerosis Journal. 2, 153-156 (2017).
  13. Escórcio-Correia, M., Hagemann, T. Measurement of tumor cytolysis by macrophages. Current Protocols in Immunology. , SUPPL.92 1-11 (2011).
  14. Cui, K., Ardell, C. L., Podolnikova, N. P., Yakubenko, V. P. Distinct migratory properties of M1, M2, and resident macrophages are regulated by αdβ2and αmβ2integrin-mediated adhesion. Frontiers in Immunology. 9, 1-14 (2018).
  15. McWhorter, F. Y., Wang, T., Nguyen, P., Chung, T., Liu, W. F. Modulation of macrophage phenotype by cell shape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (43), 17253-17258 (2013).
  16. Penjweini, R., Loew, H. G., Hamblin, M. R., Kratky, K. W. Long-term monitoring of live cell proliferation in presence of PVP-Hypericin: A new strategy using ms pulses of LED and the fluorescent dye CFSE. Journal of Microscopy. 45 (1), 100-108 (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

M1 MakrofajlarZaman Atlamal G r nt leme4T1 Karsinom H creleriKo k lt r ModeliFloresan MikroskopiDiferansiyel nterferans KontrastCFSE BoyamaM1 PolarizasyonuCanl H cre Videosu
Eş-Kültürlerde M1 Makrofaj-4T1 Fare Mammary Karsinom Hücrelerinde Fagositik Aktivitenin Zaman Atlamalı 2D Görüntülemesi
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.