Drosophila melanogaster Öğrenme Kaynaklı Sinaptik Plastisite Vivo Optik Kalsiyum Görüntüleme

Özet

Burada drosophila öğrenme ve bellek bağlamında pre-ve/ veya postsinaptik kalsiyum görselleştirilebilen bir protokol sayılmaktadır. Sinapti lokalize kalsiyum sensörleri kullanılarak yapılan in vivo kalsiyum görüntüleme, bu tür bir assosiyatif öğrenmenin altında yatan sinaptik plastisitenin belirlenebileceği klasik koku alma koşullandırma paradigması ile birleştirilir.

Özet

Birçok model organizmalarda onlarca yıllık araştırmalar, öğrenme ve hafıza oluşumunun altında yatan mevcut sinaptik plastisite kavramına yol açmıştır. Sinaptik iletim öğrenme kaynaklı değişiklikler genellikle birçok nöronlar ve beyinde işleme düzeyleri arasında dağıtılır. Bu nedenle, nöronlar arasında öğrenme bağımlı sinaptik plastisite görselleştirmek için yöntemler gereklidir. Meyve sinek Drosophila melanogaster öğrenme altında yatan nöronal devreleri incelemek için özellikle olumlu bir model organizma temsil eder. Burada sunulan protokol, ilişkiye giren koku hafızasının oluşumunun altında yatan süreçlerin, yani sinaptik aktivitenin ve bunların değişimlerinin in vivo olarak izlenebileceğini göstermektedir. Drosophilamevcut genetik araçların geniş bir yelpazede kullanarak , özellikle belirlenen hücre popülasyonları ve hatta tek hücrelerde genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri ifade etmek mümkündür. Yerinde bir sinek sabitleme ve baş kapsülü açarak, koku uyaranları sunarken bu hücrelerde kalsiyum dinamikleri görselleştirmek mümkündür. Ayrıca, sineğin aynı anda vücuda elektrik şoklarına maruz kabileceği bir kurulum gösteriyoruz. Bu, sineklerin klasik koku alma kondisyonundan geçebildiği bir sistem sağlar - bu nedenle daha önce naif bir kokunun elektrik çarpması cezasıyla ilişkilendirildiği öğrenilir - aynı zamanda bu kokunun (ve diğer eğitimsiz kokuların) temsili olarak iki foton mikroskopisi ile beyinde gözlenir. Laboratuvarımız daha önce sinaptetik olarak lokalize kalsiyum sensörleri üretdiğini bildirmiştir, bu da floresan kalsiyum sinyallerini ön veya postsinaptik bölmelerle sınırlandırmanızı sağlar. İki fotonlu mikroskopi, ince yapıları mekansal olarak çözmenin bir yolunu sağlar. Bunu, böcek beyninin üst düzey bir merkezi olan mantar vücudundaki bilgileri birleştiren nöronlara odaklanarak örnek liyoruz. Genel olarak, bu protokol olan aktivite koku öğrenme sonucu modüle nöronlar arasındaki sinaptik bağlantıları incelemek için bir yöntem sağlar.

Giriş

Bilginin öğrenme yoluyla beyinde nereden ve nasıl elde edildiği ve daha sonra bellek olarak depolandığı deşifre etmek, nörolojinin en zorlu görevlerinden birini oluşturmaktadır^1. Nörobilimsel araştırma öğrenme ve hafıza oluşumu 2 altında yatan nöronal substrat olarak sinaptik iletim bir değişiklik kavramına yol açmıştır^2,3. Öğrenme sırasında, bir uyarıcının algılanması sırasında aktif olan nöronal topluluklar arasındaki sinaptik bağlantıların, bir leştirilmiş aktivite deseni hafıza hatırlama sırasında alınabilecek şekilde değiştirilebileceği ve bu nedenle gelecekteki davranışsal eylem⁴. Bu "engram hücreleri" ve onların sinapsları genellikle beyin bölgeleri ve işleme düzeyleri arasında dağıtılır, hangi zor bir görev veya uyarıcı öğrenme sinaptik iletim gözlenen değişiklikler atamak için yapar. Belirli bir öğrenme görevine nedensel olarak bağlı olan bu sinaptik değişiklikleri yerelleştirmek ve görselleştirmek için, bu sinapsların tam olarak sınırlandırılmasına olanak tanıyan uygun bir model sistemine ihtiyaç vardır.

Böyle bir çaba için, Drosophila melanogaster göreceli beyin basitliği, davranışsal zenginlik ve deneysel erişilebilirlik birleştirir çünkü özellikle uygundur. Köklü model organizmalar arasında, Drosophila nöronal karmaşıklık açısından fareler gibi nematod C. elegans ve genetik olarak çekilebilir memeliler arasında yer almaktadır. C. elegans'tastereotipik nöron sayısı (~300) ve sınırlı davranışsal repertoi gözlenir. Memelilerin ise milyonlarca nörona ve şaşırtıcı davranış sallabına sahiptir. Meyve sineğinin beyni, ~100.000'i ile, çoğu omurgalının beyninden önemli ölçüde daha küçük nöronlardır ve nöronların çoğu tek tek tanımlanabilir^5. Ancak, Drosophila karmaşık davranışlarıgeniş bir yelpazede göstermek, sağlam bir bağdaştırıcı koku öğrenme ve hafıza oluşumu sergilemek için bir yetenek de dahil olmak üzere, ilk üzerinde açıklanan⁴⁰yıl önce 6 . Bu klasik koşullandırma prosedürü sırasında, sinek grupları koşullu uyarıcı (CS⁺) olarak bir kokuya maruz kalırken, koşulsuz uyarıcı (ABD) olarak cezalandırıcı bir elektrik şoku alırlar. İkinci bir koku (CS^-) sonra herhangi bir ceza olmadan sunulmaktadır. Bu nedenle, hayvanlar iki koku, CS⁺ ve CS arasında bir sonraki seçim durumunda test edilebilir ceza ile ilişkili koku önlemek için öğrenirler^-. Drosophila bu davranışın altında yatan nöronal substrat diseksiyon çalışmaları mantar organları (MB) "engram"^{7,8,9,10 birincil site olarak belirlemiştir} ve, bu nedenle, bu beyin bölgesinin devre ve bir bellek engram elde edilir ve saklanır mantığı ortaya çıkarmak için yoğun araştırma konusudur (son zamanlarda gözden^11,12).

Drosophila MB oluşur ~ 2,000 içsel nöronlar (Kenyon hücreleri) yarımküre başına, paralel aksonal projeksiyonlar düzenlenen¹³. Koku projeksiyon nöronların aksonlar lateral protocerebra ve MB calyces, MB ana dendritik giriş sitesi ve anten lobları koku girişi almak uzatılır. Kenyon hücrelerinin uzun, paralel aksonlar demeti peduncle ve loblar oluşturmaktadır. Kenyon hücrelerinin çoğu, bir teminatı beynin orta çizgisine, dikey α/α'-lobları ise dorsal-anterior yönde ikinci kollateral projektifi genişleterek yatay β/β'-loblar oluşturur. Kenyon hücrelerinin diğer grup öğrenme süreci ve sonraki kısa süreli bellek oluşumu lokalize olabilir MB yatay γ-loblar¹³ oluşturur¹⁰. MB loblar afferent giriş almak ve efferent çıkış sağlamak, her ikisi de genellikle Kenyon hücre aksonları boyunca farklı bölümalt bölgeleri ile sınırlıdır^14,15,16. Özellikle, afferent dopaminerjik MB giriş nöronların, örneğin, cezalandırıcı, uyarıcı koku öğrenme etkileri takviye değer tabanlı aracılık gösterilmiştir^15,17. Mantar vücut loblarından stereotipik ve bireysel olarak tanımlanabilir efferent MB çıkış nöronlar Kenyon hücrelerinin çok sayıda arasında bilgi entegre, hedef çeşitli beyin alanları ve ayı davranış-öğretici iştah açıcı veya aversive bilgi¹⁵ . Bu nöronal mimari assosiyatif engram organizasyonu bir kavram yol açmıştır. Kokular nispeten hassas Kenyon hücrelerinin seyrek aktive topluluklar tarafından kodlanır. Bu Kenyon hücre topluluklarının tesadüfi aktivitesi ve dopamin salınımı - uyarıcıları cezalandırarak uyarılmış - Kenyon hücre presynapses mb çıkış nöronlar üzerine bulaşma modüle böylece hayvanlar daha sonra bu özel koku önlemek olacaktır^{10 ,12}. Bu tam olarak tanımlanmış ve lokalize engramı, sinaptik aktivitedeki bu öğrenmeye bağımlı değişikliklerin nasıl belirlenip izlenebileceğini göstermek için paradigmatik bir olgu olarak kullanırız.

Bir model sistemi olarak Drosophila değeri güçlü bir tanımlamak için transgenler ifade sağlar eşsiz genetik araç kutusu dayanır, izleme, ve karmaşık devreler içinde tek nöronlar kontrol¹⁸. Nöronal aktivite izleme teknikleri gelişiyle - kalsiyum görüntüleme gibi, burada tartışılan - belirli bir uyarıcı yanıt olarak nöronal aktivite kalıplarının belirlenmesi için izin verdi. Genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerinin (GECIs) spesifik Gal4 güdümlü ifadesini koku stimülasyonu ile birleştirerek, ilgi nöronların koku uyandıran kalsiyum dinamiklerini görselleştirebilirsiniz¹⁹. Bu protokolde, bu tekniği klasik koşullandırma paradigması ile daha fazla bağlayarak, bu koku alma yanıtlarını öğrenme bağlamında incelemenin mümkün olduğu gösterilmiştir. Öğrenme kaynaklı plastisite sadece tek bir spesifik nörona lokalize değil, aynı zamanda bir nöronun belirli alt bölümlerine gecis kullanılarak daha da kesilebilir. Pech ve ark.²⁰ tam olarak bu izin araçları bir seçim kurdu. GCaMP3^21'i, omurgalı Synaptophysin veya dHomer'a bağlantı yoluyla, sırasıyla^20-ön veya postsynapse'ye hedefleyerek, bu sitelerin diferansiyel modülasyonu ayırt edilebilir. Bu yerelleştirme, bu bağlamda, sitosol boyunca her yerde mevcut olan çoğu GECIs üzerinde bir avantaj confers - örneğin, GCaMP²², GCaMP3²¹, veya GCaMP6²³ - bu önceden ve postsynaptic geçici olabilir anlamına gelir çünkü nöron aktivasyonu sonucu oluşan genel entegre kalsiyum akını ayırt. Bu, öğrenme ve hafıza oluşumuna neden olan veya bunun sonucu olarak ortaya çıkan plastisitenin konumu ve türleri hakkında ipuçları sağlayabilir. Örnek olarak, burada sağlanan protokol, kalsiyum sensörünün ekspresyonunu sadece postsynapse'ye doğru hedefleyerek koku alma sırasında MB çıkış nöronların modülasyonunu çözmede bu aracın değerini göstermektedir. İzleyerek, tek bir sinek içinde, koku kondisyon öncesi ve sonrası koku uyarılmış aktivite naif bir koku tepkisi ve öğrenilen bir koku tepkisi arasında doğrudan bir karşılaştırma çizilebilir. Aynı görüntüleme odasında sabit iken, sinekkokular bir seçim maruz kalır. Daha sonra, bu kokulardan birinin elektrik şokuyla eşleştirilmiş olduğu (CS⁺olma) ve başka bir kokunun takviye olmadan sunulduğu (CS^{olma - )}bir önleyici bağdaştırıcı koşullandırma protokolü alırlar. Son olarak, sinekler yine ilk adımda olduğu gibi aynı kokulara maruz kalırlar. Kalsiyum dinamiği iki foton mikroskopi ile gözlenir.

Protokol

1. Transgenik meyve sinekleri, Drosophila melanogaster

1. Çapraz dişi bakire ve erkek sinekler (12 saat açık/karanlık bir döngüde %60 bağıl nemde 25 °C'de yükselir) istenilen Gal4'ü taşır ve UAS, belirli ilgi nöronlarının genetik olarak kodlanmış bir şekilde ifade ettiği sinekleri üretmek için sırasıyla^25'iinşa eder. kalsiyum göstergesidir.
2. Yaş onlar 3-6 gün post-klozyon aralığında olana kadar yukarıdaki haç kadın soyundan. Dişi sinekler biraz daha büyük boyutları nedeniyle tercih edilir.

2. In vivo kalsiyum görüntüleme için meyve sineği hazırlanması

1. Tek bir dişi sinek seçin ve en fazla 5 dakika buz üzerinde anestezi.
2. İnce çömeçler kullanarak, sineği görüntüleme odasına yerleştirin (Şekil 1c'degösterilmiştir). Toraks ve bacakların odanın altındaki elektrik telleriyle temas halinde olduğundan ve başın düz olduğundan emin olun. Net yapışkan bant kullanarak sineğin konumunu düzeltin.
   NOT: Bu protokol, sineklerin sabit olduğu, baş kapsülünün açılması için erişilebilir olduğu ve sineklerin antenlere hem de toraks ve bacaklara elektrik şoklarına hem koku stimülasyonu alabildiği özel olarak inşa edilmiş bir oda gerektirir(Şekil 1).
3. Neşter sapına sabitlenmiş cerrahi bir neşter bıçağı (Bkz. Malzemeler Tablosu),sineğin başının etrafındaki bantta bir pencere keserek anteni kapalı ve toraksın sadece ön kısmını açıkta bırakarak.
4. Mavi ışık kür tutkal ile başın yanve arka surround, dikkatle içbükey-dışbükey çeneler tarafından düzenlenen bir böcek pimi kullanılarak manipüle. Mavi ışık yayan LED lamba kullanarak tutkal ayarlayın.
5. Tutkal tamamen ayarlanmış olup olmadığını kontrol edin ve sinek başının sırt yüzeyinden herhangi bir kalıntı sertleşmemiş tutkal temizleyin.
6. Başın açıkta kalan manikülünü örtmek için bir damla Ringer çözeltisi²⁴ (Bkz. Malzeme Tablosu)uygulayın.
7. Çok ince bıçaklı bıçak kullanarak, miğanı keserek. Miteliğin en verimli şekilde çıkarılması için, ilk olarak ocelli'yi başlangıç noktası olarak kullanarak başın arka tarafına kesin. Sonra, her iki tarafı kesip, gözlere medial, kolayca forseps kullanılarak yırtılmış olabilir mite bir flep oluşturmak için.
8. İlgi beyin bölgesini bloke edebilir herhangi bir aşırı mitikül kaldırın.
9. İnce prizler kullanarak herhangi bir trakeanın dorsal yüzeyini dikkatlice temizleyin, beyin dokusunun bozulmasını önleyin. Doku enkaz alanını temizlemek için ringer'ın çözeltisi^24'ü (Bkz. Malzeme Tablosu)çıkarın ve yenileyin.
10. Hipodermik koku iletim iğnesini sinek başından yaklaşık 1 cm uzakta, pozisyona yerleştirin. Antene koku iletimini engelleyecek hiçbir şey olmadığından emin olun.
11. Mikroskopta, görüntüleme odasını hipodermik koku dağıtım iğnesi ile koku dağıtım sistemine bağlayın.
12. Sineğin anestezi ve ameliyattan tam olarak kurtulması ve hava akışına uyum sağlaması için bu aşamada 10 dk'lık bir dinlenme süresi uygulayın.

3. In vivo kalsiyum görüntüleme

1. Bir kızılötesi lazer ve bir su daldırma amacı ile donatılmış bir multifoton mikroskop kullanın (Malzemeler Tablosubakınız), titreşim izole bir tablo üzerine yüklü. GFP tabanlı kalsiyum göstergelerinin görselleştirilmesi için lazeri 920 nm'lik uyarma dalga boyuna ayarlayın ve GFP bant geçiş filtresi tonu kurun.
2. Kaba Z ayar buzlemi kullanarak, beynin Z ekseni üzerinden tarayıp ilgi çekici beyin bölgesini bulun. Tarama süresini en aza indirmek için yalnızca bu alana odaklanmak ve kafanın ön kısmı aşağı bakacak şekilde tarama görünümünü döndürmek için kırpma işlevini kullanın.
3. Çerçeve boyutunu 512 x 512 px'e ayarlayın, hızı > 4 Hz'e ayarlayın ve ilgi çeken nöronların kapsanması için (Y boyutunda) taşkınlık bölgesini takın.

4. Koku alma koşullandırması ile koku uyandıran kalsiyum geçicilerinin görselleştirilmesi

1. Bir koku dağıtım sistemi kullanın^19,26 bir zamansal hassas bir şekilde çeşitli koku uyaranları sunabilir.
   1. Cihazı kontrol etmek ve deneyler sırasında koku uyarımlarını görüntü yakalama yla koordine etmek için görüntüleme mikroskop yazılımıyla iletişim kurmak için ek bir bilgisayar kullanın.
   2. Harici bir girdiye yanıt veren görüntü edinme yazılımı ve koku dağıtım programını (örneğin, mikroskop kontrol yazılımına yüklenmiş bir VBA makro paketi, bkz. Malzeme Tablosu'nabakın) bağlayabilecek önceden programlanmış bir makro paketi başlatın ayrı bir programda bir koku dağıtım protokolü başlatılması ile sağlanan tetikleyici).
2. 512 x 512 px çözünürlükte "ön eğitim"/naif koku uyarılmış kalsiyum geçicilerini ve 4 Hz. Kare lik bir kare hızını izleyerek ölçüme başlayın. ₀ temel değeri) ve 12.5 s sonra koku ofset. Bunu ikinci bir koku yla ve üçüncü bir koku yla tekrarlayın.
3. Klasik klima ("eğitim") sinek ile bu ölçümden sonra 3 dakika devam edin.
   1. CS⁺ koku ve başka cs olmak için "ön eğitim" aşamasında sunulan kokuları birini seçin^- koku. 12 90 V elektrik şoku ile birlikte 60 s için bilgisayar kontrollü koku teslim sistemi kullanarak CS⁺ koku mevcut.
   2. 60 s aradan sonra, CS mevcut^- 60 s. koku 4-metilsikloheksanol ve 3-oktanol olarak kullanın tek başına koku. Üçüncü odorant (örneğin, 1-octen-3-ol) bu eğitim sırasında sadece önce kontrol olarak kullanılan olarak (adım 4.2.) ve sonra (adım 4.4) eğitim aşamasından sonra sunmayın.
4. Eğitim aşamasını bitirdikten sonra "eğitim öncesi" koku stimülasyon protokolünü (adım 4.2.) 3 dk tekrarlayarak "eğitim sonrası" koku uyarılmış kalsiyum geçicilerini tekrar ölçün (adım 4.3).
   NOT: Bu adımın zamanlaması bellek oluşumundan sonraki ilgi süresini yansıtmalıdır (örn. kısa süreli belleği araştırmak için koşullandırma adımından 3-4 dk sonra bu adımı gerçekleştirin). Tipik olarak, sinekler bu hazırlık birkaç saat yaşayabilir.
5. Görüntüleme dosyalarını daha sonraki görüntü analizi için uygun bir biçimde (örneğin, Tiff) kaydedin.

5. Görüntü analizi

1. Görüntüleri analiz etmek için, Fiji²⁷gibi görüntü analizi yazılımında Tiff (veya benzeri) dosyaları açın.
2. X ve Y yönünde en az hareketi sağlamak için bir hareket düzeltme algoritması kullanarak yığınları hizala. Z ekseninde güçlü hareket gösteren tüm kayıtları atın.
3. İncelenecek alanın etrafındaki ilgi alanını (YG) işaretlemek için kullanılan yazılımın aracını seçin. Bu arka plan floresan etkisini sınırlamak için mümkün olduğunca hassas olmalıdır.
4. Seçilen YG'den veri dosyaları olarak zamansal floresan yoğunluğu verilerini ayıklamak için yazılımın ilgili aracını kullanın, böylece kaydın her karesi için bir değer oluşturulur.
5. Her koku izleme için ΔF/F₀ değerlerini hesaplamak için bir veri analiz programı kullanarak verileri açın. F₀ = koku başlamadan önce 2 s ortalama floresan. ΔF = belirli bir çerçevedeki ham floresan ile F₀arasındaki fark . Bu değerlerden, koku uyarıcı dönemi boyunca göreceli floresan yansıtacak şekilde zamana karşı çizilebilen her kare için bir ΔF/F₀ değeri hesaplayın.

Sonuçlar

Yukarıdaki protokol ile elde edilen görüntülerin bir örneği Şekil 2'degörülebilir. d Homer-GCaMP3 olan dendritler MB γ-lob bölmesi 1 innervate bir MB çıkış nöron ifade edilir (nöron MVP2 denir^28,29) ve genetik split-Gal4 hattı MB112C¹⁶kullanılarak hedeflenir . Ayrıca, gösterdi bir sitosolik ve post-synaptically lokalize kalsiyum indikatörü subsellüler lokalizasyon fark...

Tartışma

Öğrenme ve hafızanın altında yatan nöral devrelerin diseksiyonu nöroloji alanında önemli bir hedeftir. Drosophila genetik erişilebilirlik ve genişliği ve davranışsal test kolaylığı bu tür olayları araştırmak için ideal bir araç yapar. Burada, koku alma koşullandırması sonucunda hücre altı düzeyde meydana gelen modülasyonu tek tek sinekler içinde görselleştirmenin mümkün olduğu bir yöntem sunulmaktadır. İlk olarak^17.grubumuz tarafından kurulan koku uyarılmış kalsiyum dinamiğinin hem eğitim...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1-Octen-3-ol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD	O5284	Koku verici olarak kullanılan kimyasal
3-Oktanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD	218405	Koku verici olarak kullanılan kimyasal
4-Metilsikloheksanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD	153095	Koku verici olarak kullanılan kimyasal
EGFP (525/50 nm) için bant geçiren filtreCarl	Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Almanya
Şeffaf yapışkan bant	Tesa SE, Norderstedt, Almanya		Standart şeffaf yapışkan bant
İçbükey dışbükey çeneler	Güzel Bilim Araçları, Kuzey Vancouver, Kanada	10053-09	İçbükey dışbükey çeneli Bıçak Tutucular
İnce forseps	Güzel Bilim Aletleri, Kuzey Vancouver, Kanada	11412-11	Forseps ucu 0,1 x 0,06 mm
Hipodermik iğne	Sterican - B. Braun, Melsungenk, Almanya	4665120	1.20x40mm
Böcek Minutien pimleri	Güzel Bilim Araçları, Kuzey Vancouver, Kanada	26002-10	Çap 0,1 mm, uç 0,0125 mm
Kentoflow	Kent Express Diş Malzemeleri, Gillingham, Birleşik Krallık	953683	Mavi ışıkla sertleşen yapıştırıcı
Mikroskop lamı	Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Almanya	0656.1	Standart amaç slayt 76 x 26 mm
Mineral yağ	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD	M8410	Koku vericiler için seyreltici olarak kullanılır
Mod kilitli Ti-Safir lazer Chameleon Vision 2	Coherent Inc., Santa Clara, CA, ABD		Ayarlanabilir kızılötesi femtosaniye lazer
BiG dedektörleri ile donatılmış Multifoton Mikroskobu LSM 7MP	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Almanya		Çoklu foton mikroskobu, birden fazla şirket benzer cihazlar sağlar.
Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0) suya daldırma objektifi	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Almanya	421452-9900-000	Objektif W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm
Ringer çözeltisi			KCl, 130mM NaCl, 2mM MgCl2, 2mM CaCl2, 5mM Hepes-NaOH, 36mM sükroz, pH = 7.4
Bıçak bıçağı	Sharpoint, Surgical Specialties Corporation, Reading, PA, ABD	72-1551	5.0mm Düz kısıtlı bıçak derinliği
Cerrahi neşter bıçağı	Swann-Morton, Sheffield, UK	0303	Ürün No. 11
Cerrahi neşter sapı	Swann-Morton, Sheffield, UK	0907	Ürün No. 7S/S
Koku verme cihazından ve elektrik çarpması uygulama cihazından (güç kaynağı) bir tetikleyici almak için Zeiss'ın mikroskobu kontrol eden ZEN yazılımı ile etkileşim kurmak için Visual Basics of Applicatons (VBA) yazılımı.	Özel olarak yazılmıştır ve istek üzerine temin edilebilir		.