Abbiategrasso Beyin Bankası Toplama, İşleme ve Yaşlanma Beyinleri Karakterize için Protokol

Summary

Bu protokol, beyin bağışı programı ve beyinlerin doğru karakterizasyonu yoluyla bireysel beyin yaşlanma yörüngelerini izlemek için bir yöntem açıklar. Beyin bağışçıları seri çok boyutlu değerlendirmeler de dahil olmak üzere uzun vadeli bir uzunlamasına çalışmada yer almaktadır. Protokol beyin işleme ve doğru bir tanı metodolojisi ayrıntılı bir açıklamasını içerir.

Abstract

Sürekli yaşlanan bir popülasyonda nörodejeneratif bozuklukların görülme sıklığının artması beklenmektedir. Hastalık mekanizmalarının anlaşılması önleyici ve iyileştirici önlemler inanahtarıdır. Bunu başarabilmek için en etkili yol hastalıklı ve sağlıklı beyin dokusunun doğrudan incelenmesi yoluyla. Yazarlar, bir antemortem beyin bağışı programına kayıtlı bireyler tarafından bağışlanan kaliteli beyin dokusu elde etmek, işlemek, karakterize ve depolamak için bir protokol mevcut. Bağış programı, insanlara karşı yüz yüze empatik bir yaklaşım, birbirini tamamlayan klinik, biyolojik, sosyal ve yaşam tarzı bilgileri koleksiyonu ve normal yaşlanma ve bilişsel gerilemenin bireysel yörüngelerini izlemek için zaman içinde seri çok boyutlu değerlendirmeler içermektedir. Birçok nörolojik hastalık asimetrik olduğundan, beyin bankamız taze numuneleri dilimleme için benzersiz bir protokol sunar. Her iki yarımkürenin beyin bölümleri dönüşümlü olarak dondurulur (-80 °C'de) veya formalin ile sabitlenir; bir yarımkürede sabit bir dilim diğer yarımkürede donmuş bir karşılık gelir. Bu yaklaşımla, tüm dondurulmuş maddelerin tam bir histolojik karakterizasyonu elde edilebilir ve her iki yarımküreden histolojik olarak iyi tanımlanmış dokular üzerinde omik çalışmalar yapılabilir ve böylece nörodejeneratif hastalık mekanizmalarının daha eksiksiz bir değerlendirmesini yapabilirsiniz. Bu hastalıkların doğru ve kesin tanısı ancak klinik sendrom ile nöropatolojik değerlendirmenin birleştirilmesiyle elde edilebilir ve bu da patogenezin yorumlanması için gerekli önemli etiyolojik ipuçlarını ekler. Bu yöntem, yalnızca sınırlı bir coğrafi alanı kapsadığı için zaman alıcı, pahalı ve sınırlı olabilir. Sınırlamaları ne olursa olsun, sağladığı yüksek karakterizasyon derecesi ödüllendirici olabilir. Nihai hedefimiz ilk İtalyan Beyin Bankası'nı kurmak, tüm bunlar olurken nöropatolojik olarak doğrulanmış epidemiyolojik çalışmaların önemini vurgulamaktır.

Introduction

WHO'ya göre, şu anda yaklaşık 50 milyon kişi demans hastası ve bu rakamın 2050 yılına kadar üçkatına çıkarılaması öngörülüyor. Alzheimer Hastalığı demans önemli nedenidir, serebrovasküler hastalık ve diğer yaşa bağlı nörodejeneratif bozukluklar izledi. DSA, 2017 yılında demans konusunda farkındalığı artırmak ve buna karşı küresel bir eylem planını teşvik etmek için Küresel Demans Gözlemevi'ni^geliştirdi. Her bireyin kendi beyin yaşlanma yörüngesi vardır, bu nedenle tedavi için arama nörodejeneratif hastalıkların patogenezkarmaşıklığı nedeniyle zor olabilir. Belki de, her kişi onu ya da kendi patogenezi kişiselleştirilmiş bir yaklaşım gerektiren beyin dokusu nda yazılı sahip. Böylece, beyin dokusu nun çalışma nörodejenerasyon mekanizmaları anlamak için anahtar olacaktır.

Nörolojitarihine baktığımızda, en etkileyici ve çığır açan keşiflerin insan beyninin doğrudan incelenmesi olmadan asla gerçekleşemeyeceğini fark ettik. Zaman boyunca, çalışılacak beyin dokusunun kaynağı ham diseksiyonlar, rasgele 'şans karşılaşmaları' ve bazı durumlarda yasadışı ticaret, organize beyin koleksiyonları ve stratejik modern beyin bankaları değişti. Birçok etik yönleri göz önünde bulundurulması, modern beyin bankalarını geçmişin beyin koleksiyonlarından farklı etkileyen başlıca faktörlerden biridir. İlk gerçek modern Beyin Bankaları (BBs)^20. Nicholas Corsellis ve Wallace Tourtelotte modern beyin bankacılığının öncüleri olarak kabul edilebilir. İngiltere'de, Corsellis çeşitli zihinsel ve nörolojik^bozukluklar2 etkilenen 1000'den fazla iyi belgelenmiş beyinler üzerinde tutan bir koleksiyon monte . Ayrıca, Corsellis biyokimyasal testler uğruna buz taze beyin dokusu korumak için ihtiyaç ortaya yardımcı oldu³. Bu arada ABD'de, Wallace Tourtelotte potansiyel beyin donörlerin talep kolaylaştırmak ve toplanan beyinler tam bir tıbbi ve nörolojik geçmişi 4 eşlik etmesini sağlamak için antemortem beyin bağışı programları tanıttı^4,5. Beyin koleksiyonları ve modern BB'ler hakkında tarihsel bir genel bakış için Carlos ve ark. ^{6 .}

Peki neden hala insan beynine ihtiyacımız var? Beyin hastalıkları sadece nöropatolojik inceleme sonrasında kesin bir tanı verilebilir. Nöropatoloji klinik tanıyı zorlar ve klinik semptomların doğru yorumlanmasının ve yeni sindromik varyantların histolojik bazlarının keşfinin anahtarıdır. Gerçekten de tanı patolojik tabloya göre yeniden tanımlanabilir. Bununla birlikte, otopsi oranı yenilikçi nörogörüntüleme teknikleri nin son gelişimi nedeniyle son yıllarda azalmıştır. Beyin görüntüleme yoluyla, beyindeki morfolojik, fonksiyonel ve metabolik değişiklikler, hem de protein misfolding ölçüde, vivoolarak değerlendirilebilir . Ancak, in vivo nörogörüntüleme ve diğer biyomarker çalışmalar sadece ince hücresel ve moleküler değişiklikleri tespit edemiyoruz gibi patolojik resmin bir "tahmin" verebilir. Moleküler görüntülemedeki ilerlemeler ve yeni biyobelirteçlerin, hedef moleküllerin ve^{izleyiciler7'nin} (örneğin, amiloid, TAU, mikroglial izleyiciler) keşfi, insan beynini klinik değerlendirmeler ve biyomarker testlerinden elde edilen verilerin yorumlanması için daha da vazgeçilmez kılmaktadır. Ayrıca, omik teknolojileri (genomik, epigenomik, transkripsiyon, metabolomikler, proteomikler, lipidomikler, vb), taze ve dondurulmuş beyin dokusu üzerinde yapılan, hastalık mekanizmaları anlamak ve risk genleri keşfetmek için yeni olanaklar açtı, yeni tanı ve prognostik belirteçleri, ve potansiyel ilaç hedefleri^{8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23}.

Bu amaçlar için, modern BBs arşiv iyi karakterize, yüksek kaliteli beyin dokuları onları bilimsel topluluk için kullanılabilir hale^3,24. BBs tarafından sağlanan beyinler tam bir klinik geçmişi eşlik etmelidir. BB'nin faaliyeti aşağıdakileri içerir: (1) Hastalıklı ve sağlıklı bireylerin beyin bağışı programlarına tanınması ve işe alınması; ideal koşul tam bir klinik, yaşam tarzı ve sosyal tarih elde etmek için yaşam boyunca donörlerin çok disiplinli bir takip elde etmek olacaktır, ve biyomarker profilleri; gerçekten de, bilişsel rezerv ve beyin yapısı yaşam tarzı ve sosyo-eğitim faktörleri bağlıdır^25,26, bu yüzden bu bilgiler eldeki toplam veri zenginleştirir. (2) Beyin (beyin, beyincik ve beyin sapından oluşan) ve ilgili dokuların (örneğin, omurilik, kranial sinirler ve ganglia, vb.) donörün ölümünden sonra edinimi, tüm bunlar sırasında standart yasal ve etik düzenlemelere uyulması. (3) Uygun işleme (diseksiyon, fiksasyon, dondurma) beynin, standart bir operatif protokolde tanımlandığı gibi, yüksek kaliteli doku elde etmek ve multidisipliner araştırmalarda gelecekte kullanıma izin vermek. (4) Kesin tanıyı sağlayan ayrıntılı nöropatolojik karakterizasyon. (5) Depolama ve araştırma topluluğuna doku materyali dağıtımı^27,28.

Tüm BB'ler hem dondurulmuş hem de formalin-sabit-parafin gömülü dokuları saklar. Her BB'nin kendi protokolü vardır. Biyomedikal Araştırma Enstitüsü (New Jersey)²⁹ ve serebrovasküler patoloji³⁰Deramecourt çalışma bihemisferik kesme protokolü gibi özel çalışmalar dışında, dünyanın en büyük BBs sadece orta hat boyunca serebrum, beyincik ve beyin sapı kesti (sagittal düzlem). Bir yarısı taze incelenir ve daha sonra biyokimyasal çalışmalar için dondurulmuş, diğer histopatolojik değerlendirme için formalin sabitise. Biyokimyasal ve histopatolojik analizler her yarımkürede ayrı ayrı yapılır. Hangi tarafın sabit veya dondurulmuş (yanallık) olarak karar, tekil banka^{31,32,33,34,35}bağlıdır. Birçok nörolojik hastalık asimetrik olduğu gibi, bizim BB taze beyin dilimleme için benzersiz bir protokol sunuyor: beyin sapı bitişik bölümleri ve her yarımküre dönüşümlü sabit ve dondurulmuş; bir yarımkürede sabit bir dilim diğer yarımkürede donmuş bir karşılık gelir. Bu yöntem le beyin dokusunun kullanımı optimize edilmiştir ve her iki yarımkürenin her iki alanından histolojik ve biyokimyasal bilgileri elde etme ve karşılaştırma olanağı ile tüm dondurulmuş maddelerin tam bir histolojik karakterizasyonu elde edilebilir.

Beyin bankası projemizin çerçevesi Abbiategrasso kasabasıdır. Abbiategrasso, Kuzey İtalya'da Milano şehrinin yaklaşık 22 km güneybatısında küçük bir kasabadır. Yaklaşık 32.600 kişilik bir nüfusa sahiptir. Golgi-Cenci (GC) Vakfı'naev sahipliği yapmaktadır. GC Vakfı büyük bir Rehabilitasyon Geriatrik Hastanesi (ASP Golgi-Redaelli) bir parçasıdır ve yaşlanma ve yaşlı bakımı hakkında araştırma odaklanan bir enstitüdür. Özellikle zihinsel yaşlanma, onu etkileyen sosyal ve davranışsal faktörler ve yaşa bağlı nörobilişsel bozuklukların (NPH) altında yatan biyoloji ve patolojiyi incelemeye odaklanır. 2009 yılında GC Vakfı 1321 katılımcıyla (1644 uygun deneden: ilk yanıt oranı %80,3) ile yeni bir uzunlamasına çalışma başlattı. 1935 ve 1939 yılları arasında (70-75 yaş ları arasında), Kafkas kökenli, aynı küçük coğrafi bölgede yaşayan doğdu. Çalışma InveCe.Ab (Invecchiamento Cerebrale Abbiategrasso; İngilizce: Beyin Yaşlanma Abbiategrasso, ClinicalTrials.gov, NCT01345110) olarak adlandırıldı ve şu anda devam etmektedir. InveCe.Ab, demansın görülme sıklığını, prevalansını ve doğal tarihini değerlendirmek için maksimum homojenliğe ve en az değişkenliğe sahip bir kohort, davranışsal, psikososyal, klinik ve biyolojik değişkenler de dahil olmak üzere olası risk veya koruyucu faktörleri değerlendirmek için planlanmaktadır³⁶. Kohortun özellikleri Şekil 1 ve Tablo 1'degösterilmiştir. Epidemiyolojik veriler Avrupa popülasyonundaki demans eğilimi ile tutarlıdır^37,38 ve InveCe.Ab katılımcıları homojen genetik ve çevresel özelliklere sahiptir, normal yaşlanmadan nörobilişsel bozukluklara kadar olan yörüngeyi incelemek için iyi bir modeli temsil eder. Gerçekten de, homojen popülasyonlar yeterli istatistiksel güce ulaşmak için daha az deneklere ihtiyaç duyarlar. InveCe.Ab metodolojisi zaten başka bir yerde^{bildirilmiştir 36} ama periyodik kontroller yoluyla çok boyutlu yaklaşım altını çizmek için önemlidir (her 2-3 yılda) dahil değerlendirmeler aynı seti kullanarak: kan örnekleme (metabolik panel, homosistein ve vitaminler, profil Apolipoprotein E (APOE) ve biliş ve yaşlanma ile ilgili diğer genetik polimorfizmler için DNA ekstraksiyonu, antropometrik ölçümler (ağırlık, boy ve bel), Talking While Walking Test (çift görev testi), yaşam tarzı (Akdeniz diyet bağlılık, fiziksel aktivite ve bilişsel bağlılık düzeyleri) ve sosyal faktörler (sosyal tutulum, yalnızlık), bir nöropsikolojik değerlendirme ve klinik genel muayene değerlendirmek için bir röportaj. Bu kadar uzunlamasına verileri postmortem nöropatolojik verilerle karşılaştırmak araştırma için çok önemli olacaktır. Bu nedenle, ekibimiz ve özellikle Dr Michela Mangieri yukarıda belirtilen nöropatolojik yaklaşım gebe. 2014 yılından bu yana ve ikinci takip sırasında, InveCe.Ab katılımcıların beyinlerini bağışlamak istendi, ve böylece Abbiategrasso Beyin Bankası (ABB)doğum hakkında getirerek. ABB çekirdek bağış InveCe.Ab katılımcılar ama ABB şimdi diğer gönüllü bağış açıktır. Onlar ASP Golgi-Redaelli, farklı nörolojik hastalıklar veya ABB Projesi hakkında bilgi ve aynı coğrafi bölgeye ait yetişkin gönüllüler (Abbiategrasso ve çevresi) ile tutulmuş birkaç hasta ev hastalardır. Tüm bağışçılar aynı değerlendirme protokolünden geçer.

Yazarlar, normal yaşlanmanın bireysel yörüngelerini ve NCD'lere olası ilerlemeyi izlemek ve bu tür bağışçılardan elde edilen beyinleri doğru bir şekilde yönetmek, işlemek ve karakterize etmek için bir yöntem önermektedirler. Ayrıca amacımız, bireylerin beynin refahı ile ilgili periyodik nörolojik değerlendirmeler, seminerler ve eğitim faaliyetlerine katılmaları ve araştırma amacıyla beyin bağışı konusundaki farkındalıklarını artırmalarıdır.

Protocol

Kurumumuzun İnsan Araştırma Etik Komitesi ve BNE Davranış Kuralları doğrultusunda ABB, faaliyetlerini etik standartlara uygun olarak gerçekleştirmektedir^39,40. Beyin hasat prosedürü sunuldu ve InveCe.Ab çalışma bağlamında Pavia Üniversitesi Etik Komitesi tarafından onaylandı³⁶. Çalışma prosedürleri, 1964 Helsinki Bildirgesi'nde ve aşağıdaki değişikliklerde belirtilen ilkelere uygun olarak uygulanıyordu. Onay formu eksiksiz dir ve kolayca anlaşılır. Bağış programına katılmak kişisel bir karardır ve tam bir farkındalık gereklidir. Bir kişinin onay formunu imzalamaya yetkili görülmemesi durumunda, yasal vasi veya en akrabası (NOK) tarafından yetki belgesi verilir. Tablo 2, beyin bağışı için dahil etme ve dışlama kriterlerini rapor eder. Araştırma Federazione Alzheimer Italia gözetiminde yapıldı.

1. Beyin bağışı programına işe alım

1. Projeyi (bağış programının kapsamı; beyin kaldırma, koruma, kullanma ve dağıtım süreci), herhangi bir zamanda programdan çekilme hakkı, anonimliğin korunması ve takip stratejilerini sunmak için beyin bağışı ve NOK ve/veya yasal vasilerine ilgi duyan denekleri toplayın. Ek biyomarker incelemeleri ve genetik testler olasılığını tartışın. Sonuçlar hakkında bilgilendirilmek için potansiyel donörün veya NOK'unun isteklerine dikkat edin.
2. Hem Vakıf hem de bağışçı için maddi kazanç eksikliği de dahil olmak üzere tüm ekonomik yönlerini açıklayın (beyinler bağışlanır ve fedakarca dağıtılır). ABB'nin vücut taşıma masraflarını karşıladığını, aile ise cenaze, defin veya yakma masraflarını karşıladığını bildirin.
3. Kabul edilmesi durumunda, bağış programına katılmak için onay imzasını alın. Bağışçıya anonimliği garanti etmek için tek bir sayısal kod verin. Uzunlamasına çalışmaya katılanların kimlik numarasını yazın ve beyin bankasının iki donör alt grubundan kolayca ayrılması için başka bir kod sağlayın (uzunlamasına çalışmaya katılanlar veya katılımcılar olmayanlar; bkz. Tablo 3).
4. Bağışçıya donör ününü beyan eden ve Beyin Bankası'na ölümünü bildirmek için telefon numarasını (7/24 mevcut) gösteren bir kimlik kartı verin.

2. Donör değerlendirme ve seri takipleri

NOT: Aşağıda belirtilen sınavların yalnızca bazıları ve tümü için izin vermek mümkündür. Tüm klinik değerlendirmeler bir nörolog, nöroloji konusunda uzman bir geriatri uzmanı ve 3 psikolog da dahil olmak üzere aynı ekip tarafından yapılmaktadır. Yeni semptomlar gelişirse veya bilişsel gerileme ilerlerse, takipler arasındaki zaman aralığı kısaltılabilir.

1. InveCe.Ab çalışmasında olduğu gibi, özerklik derecesi (ADL, IADL), kişisel alışkanlıklar, zihinsel işlevleri etkileyebilecek sosyal ve yaşam tarzı faktörleri de dahil olmak üzere bir yaşam tarzı-sosyal anket elde edin. Genetik, enfektif, toksik, metabolik, otoimmün, kardiyovasküler, travmatik, dejeneratif, neoplastik ve nörolojik hastalıklar la ilgili bilgilerle aile, tıbbi ve nörolojik geçmişi toplayın. Önceki klinik muayeneleri toplayın ve farmakolojik tedavileri listelayın.
2. Kranial sinirler fonksiyonu, fundus oculi, görme alanı, kas gücü ve sesi, duyarlılıklar, tendon refleksleri, ekteroseptif ve ilkel refleksler, menenjit işaretleri, duruş, yürüyüş, hareketler, koordinasyon, sfinkerik fonksiyonlar ve odak veya Babinski işaretleri herhangi bir varlığı için test dahil olmak üzere kapsamlı bir nöro-motor değerlendirme yürütmek. Dili, zihinsel durumu ve davranıştaki her türlü değişikliği değerlendirin.
3. Sözel ve görsel hafıza, dikkat, psikomotor hız, dil, semantik bellek, yürütme fonksiyonları ve visuospatial yetenekler (Ayrıntılar içinTablo 4) : küresel biliş ve belirli bilişsel alanların tam bir nöropsikolojik değerlendirme de dahil olmak üzere kapsamlı bir nöro-bilişsel değerlendirme yürütmek. Depresyonun varlığını göz önünde bulundurun (CES-D ölçeği).
4. Hem kan kimyası analizinde(Tablo 5)hem de DNA, plazma ve periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC) izolasyonve depolanmasında kullanılan kan örneğini elde edin. APOE genotipleme (rs429358 ve rs7412) (InveCe.Ab katılımcılarında daha kapsamlı bir genetik profilleme belirlenmiştir; bkz. Tablo 6). Kantitatif analiz (QEEG) için bir EKG (kardiyak değişiklikler, atriyal fibrilasyon) ve istirahat durumu Elektroensefalogram kaydedin.
5. Beyin omurilik sıvısı (BOS) TAU, fosfo-TAU ve β-amiloid ve beyin görüntüleme (MRG in vivo dejenerasyon, iskemi veya inflamasyon tespit etmek için dahil olmak üzere isteğe bağlı biyomarker test düşünün; FDG-PET metabolik yetmezliği tespit etmek için; PIB-PET Alzheimer patofizyolojisi ile ilgili beyin amiloidoz tespit etmek).
6. Beyin bağışçısının sonraki check-up programını planlayın. Farklı yaş gruplarına göre zaman aralıkları ayarlayın (64 yaşına kadar: her 10 yılda bir, 65-74 yaş: her 3 yılda bir, 75 yıldan itibaren: her 2 yılda bir).
7. DSM-V'ye göre klinik tanı ve/veya nörobilişsel tanı koyun. Klinik demans evrelemesini Klinik Demans Derecelendirmesi (CDR) skoru ile sınıflandırın. CDR'yi ölümden önceki son dönemde güncelleyin.
8. Kağıt takine benzer bir veritabanı hazırlayın. Toplanan tüm verileri Beyin Bankası veritabanına ekleyin. Herhangi bir hata olup olmadığını kontrol etmek için başka bir katip tarafından bir revizyon planlayın.

3. Ölüm ve beyin kaldırma zamanı

NOT: İtalyan yasalarına göre asystole ölümü doğrulamak için 20 dakikadan uzun süre dayanmalıdır. En az 20 dakika (thanatografi adı verilen) için düz elektrokardiyogram (EKG) kaydı, ölümün 24 saat içinde otopsi yapılmasını sağlar (DPR 285/90 madde 8 ve Kanun n. 578 Aralık 29, 1993). <24 saat ölüm sonrası zaman genel doku kalitesini korumak için iyi bir hedeftir. Otopsi süresi >30 saat olması durumunda otopsi iptal edilir (bkz. Tablo 2). Otopsi ekibi bir patolog, bir nörolog ve / veya nörobiyolog, bir hemşire, anatomik oda teknisyeni ve herhangi bir stajyer öğrencilerden oluşur; ilk iki ekip üyesi de nöropatolojik tanıyı yapar. Kadavra kullanımı ve diseksiyonu sırasında uygun giysilerin (palto, eldiven, gözlük ve saç ağı) kullanılması zorunludur. Bu bölümde, normalde laboratuvarımızda kullanılan ana araç ve gereçleri açıklıyoruz. Okuyucular kendi takdirine bağlı olarak kullanılacak araçları seçebilirsiniz. Burada kullanılan malzemelerin ayrıntılı bir açıklaması için lütfen Malzeme Tablosu'nabakınız.

1. Aile tarafından seçilen cenaze ajansıA ait cesedi ABB tesislerine getirdiğinden emin olun. Kardiyak aktivitenin olmaması gereken thanatografiyi yapın. Eğer öyleyse, bir ölüm belgesi imzalayın ve otopsi işlemlerine başlayın.
2. Kadavrayı otopsi odasına götürün. Kafatasının çevresini başın en geniş kısmı seviyesinde ölçün. Anteroposterior çapı (APD) elde etmek için nasion'dan inion'a kadar ölçün, bir kulaktan diğerine olan uzaklık enine çapı (TD) verir. Milik indeksi (CI) formülü kullanarak hesaplayın: CI = TD/APD x 100.
3. Keskin bir neşter kullanarak, koronal düzlemde bir kafa derisi kesi yapmak, bir tarafta mastoid sürecinin ucundan diğer tarafına, tepe noktası üzerinden geçen. Saç, deri ve deri altı dokusunu kesin ve kafa derisinin iki kıvrımını kafatasının altından dikkatlice ayırın. Sarı supraorbital yağ görünür hale gelene kadar kesi gerçekleştirin ve ön kafa derisi yansıtacak. Diğer kısmı arka arkaya çekin.
4. Neşter ve forseps kullanarak, her iki tarafta temporal kas küçük bir örnek almak, 4% formaldehit birini koymak ve diğer dondurma (bölüm 7 bakınız).
5. Ön taraftaki V-cut'ı takiben bir elektrikli testere kullanarak kafatasını kesin. Kafatası kapağını çıkarın ve menineleri kesin. Dura numunesi hem %4 formaldehit ve dondurulmuş olarak sabitlenir (bkz. bölüm 7).
6. Üçüncü ventriküle ulaşmak için korpus callosum'a 20 G 3.5 in. iğne takarak yaklaşık 10 mL BOS elde edin. BOS'un görünümünü, rengini ve bulanıklığını değerlendirin ve pH'ı ölçün. Daha sonra, her biri yaklaşık 1 mL 10 aliquots yapmak ve -80 °C onları saklayın.
7. Beyin hassas hem frontal loblar çekerek yukarı kaldırın ve hem optik sinirler infundibulum kesti, iç karotis arterler (ICA) ve üçüncü, dördüncü, beşinci ve altıncı kranial sinirler. Posterior fossa ulaşmak için tentorium kesin ve vertebral arterler ve alt kranial sinirler kesti. Medullanın en kaudal kısmını kesmek için neşteri foramen magnumdan mümkün olduğunca derine yerleştirin. Bu noktada, yavaşça tüm beyin kaldırın.
8. Neşterle, Meckel'in mağarasının üzerindeki kemiği delin ve her iki taraftan gasserian ganglion'u elde edin. % 4 formaldehit bir ganglion düzeltmek ve diğer dondurmak (bölüm 7 bakınız). Hipofiz bezini çıkarmak için cerrahi tokmak ve keski kullanarak kemik sella turcica kırın ve sonra% 4 formaldehit düzeltmek.
9. Kafatasını ve tüm beyni makroskopik değişiklikler ve damar değişiklikleri için inceleyin. Bir ölçüm bandı ile, enine ve anteroposterior çapları elde beyin ölçmek. Willis çemberini özenle alın ve anatomik varyantlar, lezyonlar veya damar darlığı varlığı için makroskopik olarak (Şekil 2E) değerlendirin.
10. Konveksitten 2-4 cm 2'lik^1-2 adet leptomening alın ve %20 fetal sığır serumu (FBS), %1 kalem/strep, %1 glutamin ve %1 temel olmayan aminoasitler içeren 4 °C'de tam yüksek glikozlu Dulbecco'nun modifiye Edilmiş Eagle media (DMEM) kültür ortamında saklayın (daha önce bazı değişikliklerle birlikte yayınlandığı gibi)⁴¹.
    1. Fibroblast lar elde etmek için leptomeningleri 10 cm'lik petri kabına yerleştirin ve sıvıyı her seferinde fosfat tamponsal salin (PBS) ile iki kez yıkayın.
    2. Bir neşter ve pipet ucu kullanarak, yaklaşık 2 veya 3 mm küçük parçalar halinde leptomeningler kesilmiş, tohum 3-4 adet daha önce jelatin ile kaplanmış 6-iyi plaka her kuyuda 3-4 adet daha önce% 0.5 jelatin kaplı ve tam orta 2 mL ile doldurulur amhotericin B% 1 ile takviye (kültürün sterilitesini garanti etmek için bir biyogüvenlik kabininde işleme yapmak).
    3. Plakayı en az bir hafta boyunca 37 °C, %5 CO₂ kuluçka makinesine yerleştirin ve harcanan ortamı her 3-4 günde bir değiştirin. Kuyu yaklaşık % 70'inde olduğu zaman steril 1x tripsinli hücreleri trypsinize. Bir T75 şişesi içine leptomeningeal fibroblastlar yerleştirin ve tam orta 12 mL ile doldurun. 5 gün sonra 900 μL FBS ve 100 μL dimetil sülfoksit (DMSO) ile saklayın.
11. Ayrı ve serebrum, beyincik ve beyin sapı incelemek ve ayrı ayrı ağırlık. Epifiz bezini çıkar ve %4 formaldehitle düzeltin. Koku ampulleri ve optik sinirleri çıkarın ve yan bağımsız olarak, her çifti birini düzeltmek veya dondurmak. Doku bozulmasını en aza indirmek ve doku yumuşaklığını azaltmak için diseksiyon için hazır olana kadar en az 2-4 saat boyunca 4 °C'de serebrum, beyincik ve beyin sapını buzda tutun.
12. Hasattan sonra kadavraya dikkat ve özen. Süper yapışkan tutkal kullanarak kemiği yeniden dikin ve cerrahi bir iğne ve emilemeyen dikişler kullanarak kafa derisini geri dikin.
13. Kadavraya nazikçe davranarak merhuma saygı ve minnet gösterin. Temiz ve yüz tıraş, ve yıkama ve saç kuru, kadavra sevdikleriniz için görünür açık bir tabut koymak çünkü.
    NOT: Kadavranın yeniden besteedilmesi bir teknisyen tarafından yapılır. Protokol burada duraklatılmış olabilir.

4. ABB diseksiyon protokolü

NOT: Aynı patolog ve/veya nörolog beyin sapını, beyincik ve serebrumu duman kaputunun altında keser. Bir nörobiyolog kesitten sonra dilimleri düzenler. Beyin bölümlerini işlemeyan bir kursiyer, sonraki doku işleme aşamalarında kılavuz olarak hizmet vermek üzere veritabanına yüklenecek fotoğraflarla tüm prosedürü belgeler.

1. Bir kesme bıçağı kullanarak, aksiyel beyin sapı kesmek ve rostral orta beyin düzeyinde ilk kesim yapmak, üstün kolikulus aracılığıyla, substantia nigra açığa iki dilim elde etmek için (SN).
2. Yaklaşık 10 bölüm elde etmek için 8 mm beyin sapı dilimleri elde etmek için kesim geri kalanı olun. Lokus coeruleus (LC) ve medulla oblongata ile akustik striae inferior apeks sadece dördüncü ventrikül inferior apeks üzerinde vagus (DMNV) dorsal motor çekirdeği de dahil olmak üzere dilimler için gözlemlemek için dördüncü ventrikül üstün kenarları yakınında rostral pons geçen kesim dahil dikkatli olun.
3. Bölümleri tanımlamak için tüm dilimleri rostrocaudal anlamda BS (beyin sapı) ve ardından Arapça sayılar olarak adlandırın. Son beyin sapı bölümünden sonra, sc (spinal cord) ve ardından 1-n sayılarını kullanın. Çıkarılan spinal metamerlerin sayısına bağlı olarak yaklaşık 2-4 SC dilimleri elde edilir(Şekil 2H-I).
4. Sabitlenecek veya dondurulacak tüm bölümleri etiketleyin ve fotoğraf arşivi için resim çekin (Şekil 2). Daha sonra, aşağıda açıklandığı gibi tüm dilimleri düzeltin ve dondurun (4.7 ve 4.8 adımları).
5. Vermis düzeyinde iki serebellar hemisfer ayırmak için sagital düzlemde serebellum kesin. Her yarımküreden 5 dilim elde etmek için sagital kesit yapın(Şekil 2F–G).
6. Vermisteki tüm dilimleri CBR veya CBL olarak adlandırın (sırasıyla sağ ve sol beyincik için) ve bölümleri tanımlamak için Arapça numaraları kullanın. Sabit veya dondurulmuş tüm bölümleri dönüşümlü olarak etiketleyin ve arşiv için fotoğraf çekin (Şekil 2). Daha sonra, aşağıda açıklandığı gibi tüm dilimleri düzeltin ve dondurun.
7. Korpus callosum(Şekil 2A-B)ile cerebrumun iki hemisferini ayırın ve koronal düzlemde tekil olarak dilimleyin. Optik kiazma ve mammillary organları arasında geçen bir düzlemde ilk kesim olun, frontal lob ile, temporal kutup, ön sindürme, anterior komissür, Meynert ve bazal ganglia çekirdeği.
8. Mammillary organları geçerek ve bazal gangliyonu, anterior talamus, subtalamus ve amigdala açığa yaklaşık 1 cm arkai ikinci kesim gerçekleştirin. Her yarımküre için 15-20 bölüm elde etmek için 1 cm dilim elde etmek için ön ve arka bölgeleri incelemek için dilimleme devam edin.
9. Dilimleri düz bir yüzeye ayarlayın. Anteroposterior yönünde orijinal konumunu takip lay, frontal oksipital kutup için, kısmı yukarı bakacak şekilde bir önceki dilim ile sürekli.
10. Her iki yarımküreden kesitleri karşılaştırarak, sabit veya dondurulmuş malzeme olarak muhafaza edilecek her yarımküreden alternatif bölümleri seçin. Frontal ve temporal loblar, singulat, bazal ganglia, Meynert çekirdek bazalis, amigdala, talamus, hipokampus ve entorinal korteks, oksipito-temporal girus, parietal ve oksipital loblar dahil histopatoloji için sabit ve işlenmiş ana bölümleri tanıyın.
11. Anteroposterior anlamdaki tüm dilimleri L (sol) veya R (sağda) ve ardından Arapça sayılar olarak adlandırın ve dilimin sabit mi yoksa dondurulup dondurulmayacağını belirten bir etiket koyun(Şekil 2A-D). Bölümleri tanımlamak için fotoğraf arşivi için bir resim çekin. Ardından, bölüm 7 ve 8'de açıklandığı gibi tüm dilimleri düzeltin ve dondurun.

5. Beyin ve damar muayenesi ve makroskopik patolojik değerlendirme (çıplak gözle)

1. Meningeal değişiklikler, diffüz veya lokalize kortikal atrofi, hipokampal atrofi, ventriküler genişleme, serebellar atrofi, beyin sapı atrofisi, substantia nigra pallor, beyaz madde değişiklikleri (tip ve yer belirtin) göz önünde bulundurularak genel bir makroskopik inceleme gerçekleştirin.
2. Ateroskleroz ve oklüzyon göz önünde bulundurularak Willis çemberini inceleyin. Atama puanı = 1 fazla% 50 darlık olmadan ateroma varlığında, en az bir arter% 50 veya daha fazla tıkanmış ise puan = 2, iki veya daha fazla arter% 50 veya daha fazla tıkanmış ise puan = 3⁴². Diğer intrakranial damarlarda patolojinin varlığını veya yokluğunu değerlendirin.
3. Parankimal vasküler lezyonları saptamak için beyin hemisferlerini, beyincik ve beyin sapı inceleyin. Lacunar lezyonlar (çap < 10 mm), iskemik veya hemorajik infarktlar ve kanama (çap > 10 mm) göz önünde bulundurun. Varsa, boyutu milimetre, sayı ve konum olarak belirtin. Ayrıca, subaraknoid kanama varlığı veya yokluğu düşünün.

6. Doku kalite kontrolü

NOT: Agonal faktör skoru (AFS) 0 ile 2 arasında değişmekte dir ve doku kalitesinin değerlendirilmesinde önemlidir. AFS'yi belirlemek için, ölüm zamanı (özellikle beyin asidozunun belirlenmesinde görülen durumlar) ve agonal durum (ani ölüm veya uzun süreli ıstırap) civarında meydana gelen klinik koşulları göz önünde bulundurun. AFS > 1 ise, beyin dokusu optimum kalitede olmayabilir⁴³. Ayrıca beyin ve BOS pHdüşünün; pH < 6 ise, beyin dokusu optimum kalitede olmayabilir^43,44.

1. Ölüm hipoksi, uzun süreli asidoz, mekanik ventilasyon, multi-organ yetmezliği, yüksek ateş, şiddetli kranial travma, nörotoksik maddelerin yenmesi, şiddetli dehidratasyon, şiddetli hipoglisemi, epileptik durum ve uzun süreli koma gibi beyin dokusuna zarar verebilir koşullar neden olup olmadığını doğrulayın. Bu koşullardan biri varsa, 1 puan atayın.
2. Agonal durum süresini doğrulayın (ölüm 1 saat içinde meydana gelirsehızlı, ölüm 1 ile 24 saat arasında gerçekleşirse ara, agonal durum 1 günden fazla sürerse yavaş). Bir ara veya yavaş bir ölüm gerçekleşirse, 1 puan atayın.
3. AFS skorunu hesaplayın ve BOS pH'ı bir elektrot pH iğnesi ve doku pH'ı ile her lobdan ve serebellar kesitindeki bir beyin dilimindeki yüzey pH ölçerle ölçün.

7. Doku dondurma

1. Tüm dokuların 4 °C'de buzda dondurulmasını engelleyin. Sonra, hızlı bir şekilde dondurun. Önceden dondurulmuş alüminyum tepsiye yerleştirin. Onları düz tutmak için birbirine bağlı alüminyum plaka ile kapak. 3 dk için -120 °C'de sıvı nitrojen koyun.
2. Dilimleri, ilgili kimlik kodu ve dilim numarasıyla etiketlenmiş plastik bir torbanın içine yerleştirin. Plastik torbaları üç kriyojenik kutuya (sağ yarımküre, sol yarımküre ve beyin sapı için) ayırın ve -80 °C'de saklayın.

8. Doku fiksasyonu

1. Dilimleri gazlı bezle tek tek sarın ve dilimleri %10 fosfat tamponlu formalin çözeltisi içine koyun. 1 gün sonra formalin çözeltisini yeni bir çözümle değiştirin. 4 °C'de soğuk bir odada yaklaşık 5 gün bekletin.
2. Bir bütün olarak tüm dilimleri tutun ve iki parçaya hipokampus ve amigdala içeren sadece dilimleri bölün(Şekil 3). Her iki dilimin üst kısmı frontal lob içerecektir (Şekil 3'teR10a-L9a); alt kısımlar sırasıyla içerecektir: (1) amigdala, temporal lob ve bazal gangliyon (Şekil 3B'deL9b), ve (2) hipokampus ve temporal lobun bir kısmı (Şekil 3A'daR10b). Bu, çeşitli yapılar arasındaki ilişkiyi sürdürmek için yapılır.
3. Tüm bölümleri fosfat tamponuna en az 2 gün boyunca koyup çapraz bağlantı ürünlerini temizleyip çıkarın.
   NOT: Protokol burada duraklatılabilir.

9. Dehidratasyon, temizleme, parafin gömme ve slayt hazırlama

1. %70'ten %100'e kadar artan etil alkol konsantrasyonlarını, ksilen'i ve iki set erimiş parafin balmumu hazırlayın. Dehidratasyon, temizleme prosedürü ve parafin infiltrasyonu (makro (serebrum ve beyincik dilimleri) ve mikro numuneler (beyin sapı dilimleri ve diğer küçük örnekler) için iki farklı doku işleme protokolleri kullanın) için otomatik işlemci beyin bölümleri yerleştirin; Tablo 7). Bir metal veya plastik kalıp üzerine parafin balmumu doku gömmek.
2. Montine indeksini nöropatolojik karakterizasyon için uygulayan tüm ilgi bölgelerini değerlendirmek için dilimlemek için bölümleri seçin⁴⁵ (Tablo 8). Ardından, seçili bölümleri dilimleyin.
3. Makrokesitler için bir kızak mikrotomu ve küçük kesitler için döner mikrotom kullanın. Hematoksilin ve Eozin (H&E) boyama için 5 m dilim, diğer lekeler ve immünohistokimya için 8 m dilim kesin. Dilimleri üç farklı türde histolojik slayta koyun: en büyük dilimler için 8,5 cm x 11 cm, orta dilimler için 5 cm x 7,5 cm ve en küçük ler için klasik 2,5 cm x 7,5 cm.
   NOT: Protokol burada duraklatılabilir.

10. Deparafinizasyon, histolojik boyama ve immünohistokimya (IHC)

1. Sulu boya çözeltileri ile reaksiyona izin vermek için deparafinizasyon gerçekleştirin. Ksilen kullanarak ve azalan alkol konsantrasyonu (her adım için 5 dk) kullanarak gerçekleştirin. Distile su ile 5 dakika rehydrate.
2. Mimari ve yapısal doku anormalliklerini ve hücresel morfolojiyi değerlendirmek için aşağıdaki histolojik lekeleri kullanın: H&E (vasküler mikroskobik lezyonlar ve inflamasyon için), Cresyl Violet (NISSL; nöronal kayıp için), Luxol Fast Blue (LFB; demiyelinasyon için), Gallyas (neuritik plaklar ve nöropiller için).
3. Belirli hedef yapıların varlığını vurgulamak için immünohistokimya (IHC) kullanın. Anti-NeuN ve anti-GFAP nöronal ve glial kompartmanları tanımlamak için kullanılır; 4G8, AT8, α-SYN ve TDP-43 nörodejeneratif hastalıklarda birleşen proteinleri tanımlamak için kullanılır (Malzeme Tablosu).
   1. Pretreat 10 dk için % 3 H₂O₂ ile kesitler dewaxed sonra PBS durulayın. 4G8, α-SYN, TDP-43 ve NeuN antijenleri için 0,01 M pH 6 (2, 1 ve 2 dk için seri olarak mikrodalgada pişirilmiş) ile alma tedavisi yapın; 4G8 ve α-SYN için %70 formik asit kullanın. Preinkübat 30 dk için 5% normal keçi serumu.
   2. Bir gecede 4 °C'de birincil antikorla kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, ikincil antikor (Envision+ System-HRP etiketli Polimer) ile kuluçkadan önce PBS'deki bölümleri oda sıcaklığında 1 saat pBS'de 1:2 seyreltme ile durulayın.
   3. Mikroskop altında reaksiyon gelişimine (büyütme 4-10x) bakarak diaminobenzidin (Liquid DAB+Substrat Kromojen Sistemi) ile pbs ve inkübat kromojen sistemde birkaç kez yıkayın. Son olarak PBS'deki bölümleri yıkayın. DPX montaj ile hematoksilin, dehidrat ve coverslip bölümleri karşı leke.
      NOT: Tablo 8 standart protokolü özetler. Seçili bölümlerde özel/özel lekeler ve reaksiyonlar kullanılırken, tüm bölümlerde H&E boyama yapın. Seçili servis talepleri ek alanlar veya reaksiyonlar gerektirir. Malzeme Tablosu IHC için kullanılan antikorların ayrıntılarını gösterir.

11. Temel nöropatolojik karakterizasyon

NOT: Nonspesifik beyin dokusu değişiklikleri, vasküler patoloji, Alzheimer Hastalığı (AD) patolojisi, AD-AD TAUopatiaları, sinükleinopatiler, TAR DNA bağlayıcı Protein (TDP-43) patolojisi ve hipokampal lezyonlar incelenmiştir. Parankimal mikroskobik lezyonları tespit etmek için kameraya bağlı optik mikroskop kullanılır. Histolojik değerlendirme nöropatoloji konusunda eğitimli personelden oluşan aynı ekip tarafından yapılır, bir nöroloji profesörü, bir nörolog ve bir patolog da dahil olmak üzere. Bu değiştirilmiş Montine yaklaşımı⁴⁵ dayanmaktadır(Tablo 8) ayrıca dahil: (1) Fronto-Temporal Lob Dejenerasyonu patolojik damgasını oluşturan heterojen non-AD TAUopathies (FTLD) TAU mevduat ile ilgili: Pick hastalığı, akıcı olmayan Primer Progresif Afazi (TAU-nfPPA), Progresif Supranükleer Palsy (PSP)^46,,47 ve Cortiko-Bazal Dejenerasyon (CBD)⁴⁸. Buna ek olarak, non-AD TAUopatiler yaşlanma ile ilgili koşulları içerir ve Primer Yaşa Bağlı TAUopati (PART)⁴⁹gibi kesin bir klinik önemi ile , Yaşa Bağlı TAU Astro-Gliopati (ARTAG)⁵⁰, arjirophilic tahıl hastalığı⁴⁸. (2) Parkinson Hastalığı (PD) ve Lewy Organları Demans (LBD) ile ilgili Lewy Tipi Sinükleinopati (LTS). LTS aramak için, aşağıdaki hiyerarşik adımları uygulayın: ilk başta, koku ampul, beyin sapı, amigdala / temporal korteks; önceki alanlar pozitif ise, limbik yapılar ekleyin (hipokampal oluşumu, entorinal korteks, anterior singulat), orta frontal girus, inferior parietal lobule ve oksipital korteks⁴⁵. Kortikal LBD'nin klinik özellikleri mevcutsa (örneğin, dalgalanmalar ve/veya halüsinasyonlar), ilk adım için limbik yapıları ve izokorteksi göz önünde bulundurun. (3) TDP-43 mevduat, FTLD patolojik özelliği TDP-43 mevduat ile ilgili: Fronto-Temporal Demans davranışsal varyantı (bvFTD), Semantik Demans (SD veya svFTD), TDP-nfPPA ve FTD-Motor Nöron Hastalığı (FTD-MND). TDP-43 için IHC aşağıdaki bölümlerde yapılır: amigdala, hipokampus, entorinal korteks ve orta frontal girus; klinik FTLD şüphesi olan olgularda, diğer bölümleri incelemeyi düşünün⁵¹.

1. GFAP ve NeuN için H&E, NISSL, LFB ve IHC kullanarak seçili bölümlerdeki nonspesifik beyin dokusu değişikliklerini değerlendirin. Nöronal rarefaction düşünün, balonlu nöronlar, spongiosis, gliozis, miyelin kaybı, inflamatuar veya tümöral infiltrasyon varlığı veya yokluğu. Bu değişikliklerin yaygın konumunu belirtin.
2. Mikroskobik vasküler lezyonlarısaptamak için, en az iki hemisferik makro kesit (memperter gövdelerden ilk geçen (Charcot kesimi) frontal ve temporal loblar içeren H&E ve LFB slaytlarını inceleyin, bazal ganglia, anterior talamus, amigdala, ve oksipital lobdan geçen ikinci geçiş), hipokampal formasyonun "geniculate" bölümü, bir serebellar kesit ve beyin sapının üç ana bölümü (substantia nigra, locus coeruleus ve DMNV ile).
   1. Arterioloskleroz, lipohyalinoz, perivasküler alan dilatasyonu, beyaz madde kaybı, leptomeningeal ve/veya parenkimal ve/veya kapiller serebral amiloid anjiyopatisi gibi küçük damar hastalığını saptamak. Derecelendirme (0-3) ve yaygın konumu^42,52belirtin. Hemosiderin sızıntı, mikro kanamave mikroinfarktların varlığını veya yokluğunu göz önünde bulundurun.
   2. Hiyerarşik Deramecourt şeması (damar duvarı değişiklikleri-küçük damar hastalığı-makroskopik enfarktlar) kullanarak bilişsel bozukluk için vasküler hasar katkısını değerlendirmek. Bu değerlendirme için bir frontal ve temporal lob bölümü düşünün, bazal gangliyon ve hipokampus (skor 0-20)³⁰. Ayrıca, serebral vasküler hastalık VCING skoru (düşük-orta-yüksek) kullanarak bilişsel bozulmaya katkıda bulunduğu olasılığını tahmin, hemisferik makroskopik infarktlar ve şiddetli arterioloskleroz ve amiloid anjiyopati orta dahil olmak üzere oksipital lob küçük damar hastalığı dikkate alınarak elde⁵³.
3. Amiloid yayılması için IHC (4G8) kullanarak AD patolojisi değerlendirin. Thal'ın evrelerini (1-5)⁵⁴, agrega Amiloid skorlama (0-3)⁴⁵ve bölge başına morfolojiyi (diffüz, fokal, kored) tanımlayın.
   1. Ad Tau patolojisini IHC (AT8) kullanarak değerlendirin ve bölge başına yaygın morfolojiyi (nörofibrillary tangles, nöropil iplikleri, neuritik plaklar) tanımlayın. Braak'ın evresini tanımlayın (I-VI +; pozitif işaret, Braak hiyerarşisini takip eden hiperfosforilat Tau patolojisinin ek alanlarının varlığını gösterir)⁵⁵ ve toplam puanlama (0-3)⁴⁵.
   2. Gallyas boyama ve CERAD skoru (0-3)⁵⁶kullanarak neuritik plakları değerlendirin. Daha sonra, Amyloid-B raak-C ERAD skoru (ABCBskoru 0-3): hiçbiri-düşük-orta-yüksek⁴⁵kullanarak bir AD klinik sendromuna karşılık gelen nöropatolojik özelliklerin olasılığını tanımlayın.C
4. Yaygın konumu ve tuhaf morfolojik resmi belirten AD OLMAYAN TAU patolojisinin varlığını veya yokluğunu fark etmek için AT8 IHC'yi kullanın. Alev şeklinde veya globose tangles, küresel-globuler eklemeler (yani, Pick's bodies)⁵⁷, nöropil konuları, distrofik nöritler, arjirophilic taneleri gibi nöronal eklemeler düşünün; tufted astrositler, dikenli astrositler, astrositik plaklar, sarmal cisimler, küresel inklüetler^58,59gibi glial eklemeler .
5. Yukarıdaki nottaki alanlarda LTS'yi (Lewy cisimleri, soluk gövdeler ve Lewy nöritleri) tespit etmek için α-syn IHC'yi kullanın. Pozitiflik durumunda, lezyonların şiddetini değerlendirmek için McKeith'in derecesini (0-4) uygulayın⁶⁰; sonra, topografik dağıtım için Beach aşamaları (I-IV) kullanın (koku ampul, beyin sapı baskın, limbik baskın, neokortikal)⁶¹. LBD ve AD^{patolojisi 60,}61^,62arasındaki ilişkiyi tanımlamak için Beach ve Braak aşamalarını karşılaştırın.⁶²
6. Çoklu Sistem Atrofisinin (MSA) patolojik ayırıcı özelliği olan Glial Sitoplazmik İçkilerin (GCI; non Lewy-tipi glial sinükleinopati) varlığını veya yokluğunu göz önünde bulundurun ve yaygın konumlarını belirtin⁶³.
7. Yukarıdaki nottaki alanlardaTDP-43 birikintilerini tespit etmek için TDP-43 IHC'yi kullanın. Bölge başına yaygın morfolojiyi tanımlayın: Nöronal Sitoplazmik İnkiler (NcIs), Distrofik Nörit lerin eklenmesi (DNs), Nükleer İçkiler (NIIs). Deseni tanımlayın: A (baskın NCI'ler ve DN'ler: bvFTD ve nfPPA); B (baskın NCI:FTD-MND); C (baskın uzun DNs: svPPA ve bvFTD)^51,64. AD durumlarda TDP-43 varlığını tanımlamak için Nelson şemasını kullanın^65,66.
8. Subiculum ve Sommer sektöründen (CA1) başlayarak hipokampusu değerlendirin. Rauramaa'nın skorunu kullanın (0-4): mikroinfarcts ve makroinfarktlar için sırasıyla 1-2; 3-4 orta ve şiddetli nöronal kaybına karşılık gelen, sırasıyla, ve hipokampal atrofi (hipokampal skleroz: HS). Patolojik protein birikintilerinin varlığına veya yokluğuna dikkat çekmek (frekans sırasını azaltarak: pTAU, TDP-43, α-syn)⁶⁷.
9. Nöropatolojik tanıyı tanımlayın ve veritabanına tüm patolojik verileri girin.
   NOT: Bağışçıların biyolojik materyalinin ve mantıklı verilerinin saklandığı odalar her zaman kilitlidir ve hem güvenliği hem de gizliliği garanti etmek için sadece yetkili personelin girmesine izin verilir. Dondurulmuş biyolojik malzeme -80 °C'de kilitli dondurucularda saklanırken, formalin-sabit parafin gömülü dokular oda sıcaklığında kilitli dolaplarda saklanır. Çift motorlu dondurucular kullanılır ve yedek dondurucu da mevcuttur. Ayrıca, dondurucuların her zaman çalıştığından emin olmak için, alarm veren 7/24 izleme sistemi sağlanır. Bir acil durum jeneratörü de mevcut, elektrik kesintisi durumunda. Katılımcılar, gizliliklerini sağlamak için sayısal bir kodla anonimleştirilmiştir; yetkili olmayan personelin bağışçıların kimliğine ve bunların mantıklı verilerine geri dönmesi mümkün değildir. Tüm bilgiler parola korumalı bir veritabanında toplanır; aynı şekilde, bu verilerin basılı bir kopyası kilitli arşivlerde tutulur.

Results

Beyin donörler ve beyin hasat verileri

	&E

Discussion

Protokoldeki kritik adımlar
Amacımız, uzunlamasına gözlemden elde edilen detaylı geçmişe sahip konulardan gelen kaliteli dokuları elde etmek, karakterize etmek ve depolamaktır. Bu amaca ulaşmak için aşağıdaki temel hususlarla uğraşmak gerekmektedir. Yukarıda açıklandığı gibi, protokol ilk önemli adım olan bağışçıların işe alınması ile başlar. Daha sonra, bağışçıların takip programına devam etmesi ve beynin gerçek bağışına kadar zaman içinde projeye yapışmasını sürdürmeleri gerekmektedir. Ölüm anında, yeterli doku kalitesi için önemli olan otopsi ekibinin 24 saat içinde toplanması için ABB personelinin derhal bilgilendirilmeleri gerekmektedir. Serebral hemisferlerin taze kesimi sabit bir el ve belirli bir eğitim gerektirir. Yavaş donma nedeniyle hücresel hasar önlemek ve kriyostat ve Omics için kaliteli dilimler elde etmek için, hızlı bir şekilde dondurulmuş olması önemlidir. Formalin çözeltisinin (1 mm/saat) penetrasyon hızı göz önünde bulundurularak, doku antijenitesini korumak için tek dilimin ıslatma süresi minimumda tutulur.

Yöntemin sorun giderme
Yukarıda belirtilen kritik adımları ele almak için aşağıdaki yaklaşımı sunuyoruz. Donör alımı ve takiplere bağlılık: Vücudun figürü, saflık ve bütünlüğüne zarar verme korkuları veya ölümden sonra acı hissetme olasılığı da dahil olmak üzere beyin bağışını engelleyen çeşitli faktörler vardır. Hatta bazıları otopsinin hala hayattayken yapılabileceğinden endişe ediyor^70,71. Cenaze düzenlemeleri ve mali yük bozulması ile ilgili endişeler de mevcuttur⁷². Ayrıca, bir sağlık personelinin ölüm sonrası prosedürler hakkında bilgi eksikliği ve potansiyel bağışçıların veya nok'larının endişelerini giderememeleri kayıt işlemlerini engelleyebilir. Tüm bu faktörler, kayıtlı katılımcı sayısının düşük olması ve zaman içinde donör kaybı olasılığının yüksek olması ile düşük bir farkındalık düzeyine neden olabilir. Gerçekten de, donör işe alma programı farkındalık yaymak, güven aşılamak ve kayıt ve takip katılım yüksek oranlarda korumak insanları ikna verimli olmalıdır. Deneyimlerimize göre, bu potansiyel bağışçıların dikkatli seçimi ve BB'nin amaçlarının ayrıntılı açıklaması yoluyla yapılır. Hem sağlıklı insanların hem de nörodejeneratif hastalıklardan ve ailelerinden etkilenenlerin korkularını ve ihtiyaçlarını karşılayan eğitim faaliyetleri ve empatik bir yaklaşım sunuyoruz. Potansiyel bağışçıların bizzat yaklaştıklarında rıza gösterme olasılıklarının daha yüksek olduğunu görüyoruz. Yüz yüze yaklaşım, beyin bağışı ve takip değerlendirmelerine yüksek bir kayıt yüzdesi elde etmek için temel olan karşılıklı güven ve saygıya dayalı bir ilişki yaratır. Güçlü bir etik anlayışına sahip yüksek eğitimli bir personel önce potansiyel bağışçıya yaklaşır, ölümden sonra beyni bağışlama olasılığını tartışır, insan beyin dokusunun nörobilimsel araştırmalara değerini açıklar ve ölüm sonrası prosedürlerle ilgili şüpheleri açıklar. Ağız olumlu kelime eşit derecede önemlidir. Beyin hasat sonra, uygun dikkat ve bakım kadavra yeniden oluşturmak için verilir. Kadavraya nazikçe davranarak merhuma saygı ve minnet göstermek önemlidir. Birkaç ay sonra, bir toplantı aile üyeleri tarafından istendiğinde nöropatolojik analiz sonuçlarını iletmek için planlanır.

Ölüm ve beyin hasadı zamanı: Kişi kabul ettiğinde donör olur ve 24 saat/gün, 7 gün/hafta (bize bağlı OLAN ASP Golgi-Redaelli Geriatri Hastanesi'nin resepsiyon numarası) iletişim kurmak için bir numara içeren bir kimlik kartı verilir. Ayrıca hastaneye yatış durumunda kullanılmak üzere yakınlarına yapıştırıcı etiketi verilir. Cenaze ekipleridaha önce cesedi otopsi ekibinin çağrıldığı ABB tesislerine getirmeleri için bilgilendirildi. Otopsi ekibi bir patolog, bir nörolog ve/ veya nörobiyolog ve bir anatomik oda teknisyeni, her gün 06:00-23:00 arasında nöbette olan oluşur; bazı stajyer öğrenciler de sık sık yardımcı olmak ve fotoğraf çekmek için mevcut.

Taze kesme prosedürlerinin hassasiyeti ve tutarlılığı, yöntemi geliştirmiş ve nöropatolojide birkaç yıllık deneyime sahip aynı iki operatörün (bir nörolog ve bir patolog) katılımı yla sağlanır. Dilimleri dondururken, önceden dondurulmuş alüminyum tepsiye konur ve onları iyi düz tutmak için birbirine bağlı bir alüminyum plaka ile kaplıdır. Hemen sonra, -80 °C'de depolamadan önce 3 dakika sıvı nitrojene konur. Sabitlenecek dilimler ayrı ayrı gazlı bez sarılır ve bir gün sonra yerine %10 fosfat tamponlu formalin çözeltisi içine batırılır. Daha sonra, en fazla 5 ek gün formalinda tutulur; ancak formalin çözeltisinin 1 mm/gün'e kadar nüfuz ettiğini göz önünde bulundurarak ıslatma süresini daha da kısaltmak istiyoruz.

Yöntemin sınırlamaları
Burada açıklanan araştırma yöntemi sadece sınırlı bir coğrafi alanı kapsamaktadır ve bağış programına katılan bireyler genel nüfusu tamamen temsil etmeyecek özelliklere sahiptir. Kabul edilebilirden daha fazla olmasına rağmen, 24 saate kadar bir postmortem aralığı bazı protein yapılarında değişiklikler üretebilir, enzimler ve beyin dokusunun RNA. AFS ve pH tayini doku kalitesini belirlemek için tamamen yeterli olmayabilir⁷³ ve RNA bütünlüğüne dayalı doku kalitesini doğrulamak için başka yollar geliştiriyoruz.

Mikrotom kesme prosedürü ile ilgili olarak, anatomik ilişkilerin yeniden yapılanmasında çok yararlı olsa da, makrokesitlerin kullanımının basit olmadığı ve bazı teknik güçlükler sunduğu unutulmamalıdır. Yöntemimiz zorlu ve zaman alıcıdır. Maliyetleri oldukça yüksek ve finansman her zaman kolay değildir. Finansman öncelikle kamu (ASP Golgi-Redaelli Geriatri Hastanesi) ve özel kaynaklar (Golgi-Cenci Vakfı), özel bağışlar, kar amacı gütmeyen kuruluşlar (örneğin "Federazione Alzheimer Italia") gelir ve katılım hibe.

ABB yönteminin mevcut/alternatif yöntemleraçısından önemi
Başlangıçta, beyin bağışı programımız InveCe.Ab uzunlamasına çalışmaya katılan bireyleri hedef aldı. Sonuç olarak, bağışlanan beyinler yıllar içinde toplanan ayrıntılı klinik, biyolojik ve sosyal bilgiler le birlikte verilir. ABB'nin gücü tam olarak bu ayırt edici kökenden kaynakla türetilmiştir. Gerçekten de, biyolojik özellikleri ve çevresel maruziyetleri paylaşan sosyal ve genetik olarak ilişkili bir grup insanı incelemek istatistiksel analizi geliştirir. Ayrıca, çalışma aşağıdaki yararları içerir: 1) Toplumun ihtiyaçlarını göz etmek ve sağlamak ("sormadan önce verme" eylemi): insanlar pratisyen hekime bilgi verilen ücretsiz bir periyodik kontrol alırlar, sekreterimizin bir telefon numarası istişareler için sağlanır ve ağır özürlüler evlerinde ziyaret edilir; 2) Periyodik seminerler (beyin sağlığı, beyin bağışı ve genel sağlık ile ilgili) ve tematik derslerin planlanması (örn. yaşlılar için bilgi teknolojisi cihazlarının kullanımı) aracılığıyla, katılımcılara, kamu salonlarıve pratisyen hekimlerin eğitim faaliyetlerine katılmaları; 3) İnsanlarla tanışmak ve yüz yüze bir yaklaşım benimsemek. Tüm bu unsurlar ABB projesinin gücünü oluşturmaktadır. Ayrıca, proje ilgili tıbbi personelin klinik yeteneklerini geliştirir, onlar antemortem değerlendirmeler ve postmortem nöropatolojik değerlendirmeler hem de deneyim kazanmak gibi. Bu bağlamda, "Azınlık yaşlanma araştırma çalışması" çok tuhaf bir deneyim söz etmek istiyorum. Bu çalışma, Chicago bölgesinde yaşayan sınırlı ve seçilmiş sayıda Afrikalı Amerikalıyı kapsıyor (1.357 uygun deneğin 784'ü: yanıt oranı %57). Katılımcılar her yıl evlerinde ziyaret edildi ve beyin bağışı programına katılmaları istendi. Bu çalışma, beyin bağışı programına yüksek oranda olumlu yanıt almak bizimkine benzerliği olan alışılmadık bir yaklaşıma dayanmaktadır (784 katılımcıdan 352'si kayıtlıydı: %44, otopsi oranı oldukça tatmin edici olmasa da (%53)^74. Tıpkı "Azınlık yaşlandırma araştırması" çalışmasında olduğu gibi, eğitim faaliyetleri ve empatik bir yaklaşım sunarak mükemmel sonuçlar elde ediyoruz. Özellikle yanıt oranımız %93, kayıt oranımız %28.7 ve şu anda otopsi oranı %67. Bu oranlar, insanları doğrudan ilgilendiren projelerin bağışların daha önemli bir yüzdeye sahip olduğunu göstermektedir. Diğer beyin bağışı programları, potansiyel bağışçılar ile bir ilişki bina içine daha az dikkat ile, genellikle düşük bir kayıt yüzdesi var, etrafında olmak 10-15% veya daha az^73,75.

Nöropatolojik analizle biten daha önceki birkaç kohort çalışması vardır. Ayrıca, beyin bankaları ve depoların çoğunluğu hastalık merkezli ve sağlıklı donörler "hastalıklı" beyin sayısına göre "kontrol" beyin bir kıtlığı vardır. Sadece sınırlı^,sayıda BBs^73,74, 76^{,,7777,78,79,80}yaşlanma yörüngeleri çalışma için hem hastalıklı hem de normal konuları içeren nüfus çalışmaları dayanmaktadır. ABD^74'teki "Azınlık yaşlandırma araştırması" ve Finlandiya^76'daki "Vantaa 85+ çalışması" gibi bazı çalışmalar bizimkine benzer olmakla birlikte kohortun sona ermesiyle sonuçlanması eğilimindedir. Bunun yerine, ABB'nin bağış programının gelecekte de uzun bir süre devam etmesi, potansiyel bağışçıların yer aldığı ve InveCe.Ab uzunlamasına çalışmanın bitiminden sonra bile takipleri planlaması öngörülüyor. Bu yaklaşım, işe alım yöntemimizi emeklilik topluluğunu hedefleyen "Güneş Sağlığı Araştırma Enstitüsü (SHRI) beyin bağışı programına" benzer hale getirir^73. Beyin bağışı için SHRI protokolü dünyanın en kısa ortalama ölüm sonrası aralığı (3.92 saat) ile çok etkilidir. Dünyanın en büyük BBs benzer, SHRI protokolü sadece orta hat (sagittal düzlemde) içinde serebrum, beyincik ve beyin sapı kesti, sonra bir yarısı taze ve biyokimyasal çalışmalar için dondurulmuş kesilir, diğer histopatolojik değerlendirme için formalin sabittir. Ancak, SHRI diseksiyon protokolünün güçlü yanlarından biri, tüm yarımküre yerine tek tek dilimlerin fiksasyonudur. Gerçekten de, bir yarımküreyi bir bütün olarak sabitlemek, yüzey ve çekirdek arasındaki farklı fiksasyon degradeleri nedeniyle en uygun olmaz. Ayrıca, kortikal proteinler formalin çözeltisine uzun süreli maruz kalma dan etkilenebilir. Böylece, neden tek tek dilimleri düzeltmek için karar nedeni.

Hangi tarafın sabit veya dondurulmuş olarak karar, tekil banka bağlıdır (her zaman aynı, rasgele atanan veya diseksiyon günü tek ya da çift olup olmadığına bağlı olarak atanmış)^{31,32,33,34,35}. Biyokimyasal ve histopatolojik analizler her yarımkürede ayrı ayrı yapılır. Birçok nörolojik hastalık asimetrik olduğundan, BB'miz taze numuneleri dilimlemek için benzersiz bir protokol sunar: beyin sapından ve beyincik ve serebrumun her yarımküresinden alternatif kesitler sabit veya dondurulmuş malzeme olarak korunur; bir yarımkürede sabit bir dilim diğer yarımkürede donmuş bir karşılık gelir. Yöntemimiz, tüm dondurulmuş maddelerin tam bir histolojik karakterizasyonu elde etmek ve her iki tarafın her alanında nsonuçlarını karşılaştırma fırsatı verir. Girişte de belirtildiği gibi, açıklanan yöntem bize beyin dokusundan mümkün olduğunca çok bilgi elde etmek için izin verir. Ayrıca, ABB yöntemi hemen hemen tüm bilinen beyin proteinopatileri ve vasküler patoloji de dahil olmak üzere temel ama tam bir nöropatolojik karakterizasyon, verir. Bilişsel bozukluğun belirlenmesinde vasküler yaralanmaların tartışmalı rolü nedeniyle, vasküler yük^30,53için bir çift puanlama kullanmaya karar verdi.

Protokolde açıklandığı gibi, çok disiplinli bir yaklaşım kullanıyoruz. Bu zaman alıcı ve emek li bir yöntem olmasına rağmen, araştırma için çeşitli avantajlar sağladığına inanıyoruz. Örneğin, bir önceki çalışmada, biz kendi başına yüksek tHcy veya APOE-ε4 alel ile ilişkili MTHFR C677T TT, bellek kaybı yerine yönetici işlev bozuklukları ile ilgili olabileceğini gösterdi⁸¹. Bu nedenle, nöropatolojik düzeyde bu özel genetik profili olan konuları değerlendirmek ilginç olabilir. Bu, bankamızda toplanan biyolojik materyallerin araştırılması yoluyla doğrulanabilir yeni araştırma hipotezleri oluşturmada bu tür derinlemesine takibin nasıl yararlı olduğuna bir örnektir. Yaklaşımımızın avantajının bir diğer göstergesi de QEEG'nin, orijinalliği ve göreceli kullanım kolaylığı açısından rutin olarak gerçekleştirdiğimiz değerlendirmeler arasında yer alan bir diğer gösteridir. Nitekim, EEG kortikal piramidal nöronlar⁸²ait dendritlerin elektriksel potansiyelleri kaydederek serebral korteksin sinaptik aktivitesini algılar . QEEG biliş⁸³ile ilgili kortikal sinaptik aktivite nin tahmini için bir biyomarker olarak kabul edilebilir. Özellikle, düşük frekanslarda genel bir artış ile beynin arka kısmında alfa ritimlerinde bir azalma (teta ve delta ritimleri) kortikal bağlantı arıza ile ilgili olmuştur. Bu tanı korelasyon çalışmalarının çoğu sadece olası ve kesin bir tanı^84,85,86,87bir klinik tanı dayalı olduğu düşünülmelidir. Sadece çok az hedeflenen çalışmalar QEEG ve LTS varyantları arasındaki korelasyon araştırmak için nöropatolojik resim ile QEEG verileri karşılaştırdık^88,89, ftld ve AD⁸³arasındaki ayrım . Çalışmamızı nöropatolojik tanı tanımı ile bitirerek, serebral elektriksel aktivite üzerine yapılan gözlemleri doğru bir şekilde yorumlamak mümkündür. Ayrıca her konuda seri QEEG'yi gerçekleştirerek, intra-bireysel EEG dalgalarının yörüngesini ve nöropatolojik resimle olan bağıntılarını takip edebiliriz. Zaman içinde kortikal elektriksel aktivitebireysel değişiklikler aşağıdaki incipient demans için bir biyomarker olarak anlamını daha iyi anlaşılmasına yol açabilir.

Gelecekteki uygulamalar ve yöntemin yönü
Doku dağılımının uygulanması ana hedeflerimizden biridir. Bunu yapmak için, biz sadece GC Vakfı (geriatri), Pavia Üniversitesi Nöroloji bir akademisyen, gc Vakfı ve Geriatri Hastanesi ASP Golgi-Redaelli hem de bir nörolog ve bir patolog direktörü de dahil olmak üzere bilimsel bir komisyon kurdu. Beyin dokusu, histolojik slaytlar ve diğer biyolojik örnekleri dağıtırken, bağışçıların araştırma amacıyla bağışı kabul ettiğini hatırlamak önemlidir. Bu nedenle malzeme nin dağıtımı, BNE Davranış Kuralları^40'taaçıklandığı gibi ihtiyatlı bir şekilde gerçekleşmelidir. Malzeme için bir istek tespül eden taraflar, gerekli numunenin türünü ve miktarını belirtmeli, araştırma projesinin açıklamasını ve numunelerin nasıl kullanılacağını ve mümkün olduğunda önceki yayınların kanıtlarını sağlamalı (transfer anlaşması için Şekil 9'abakınız). Beyin bankası finansal kazanç için çalışmıyor. Yani, araştırmacılar tarafından ödenen ücretler sadece doku temini, işleme, depolama ve dağıtım giderlerini kapsamalıdır.

Proteomik ve transkripsiyon gibi ekzom dizilimi ve Omics teknikleri ile vakaları analiz etmeye başlama planları harekete geçti. Alternatif örnekleme metodolojimiz, her iki yarımküreden histolojik olarak iyi tanımlanmış dokular üzerinde omik çalışmalarının yapılmasına olanak sağlayacaktır. Bu yaklaşım la aynı yarımkürenin farklı beyin bölgelerinde ve diğer yarımkürenin ilgili bölgelerinde gen aktivasyon paterni karşılaştırmak mümkün olacak ve histopatoloji ile gen aktivasyonu ilişkilendirmek mümkün olacaktır. Bu alanda, histolojik slaytların bilgisayarlı analizi ve klinik, histolojik ve omik verilerin en son korelasyonunu içeren derin öğrenme uygulamaları büyük ilgi göstereceği dir. Birçok farklı değişken arasındaki diğer korelasyonlar ve diğer olası teknolojik uygulamalar tanımlanabilir. Her iki yarımküreden gelen dondurulmuş maddelerin kullanılabilirliği gen aktivasyonu ve protein dağılımının doğru bir topografyasını sağlayacaktır. Bu sağlıklı konularda bile özellikle ilgi olacaktır, hem beyin fonksiyonları ve bazı hastalıklar asimetrik olduğu göz önüne alındığında.

Ayrıca, iyi karakterize beyin donörlerinden hücre kültürleri elde edebilirsiniz. Gerçekten de, hasat beyinleptomeninges gelen hücre kültürleri hastalık veya yaşlanma mekanizmaları daha fazla araştırma için kullanılabilir canlı hücreleri kaynağı, indüklenen pluripotent kök hücreleri sayesinde (iPSCs) leptomeningeal fibroblastlar yeniden programlama ve ileri modellerde nöral hücrelere ayırarak içerir⁹⁰.

Beyin yaşlandıkça, farklı değişim profilleri moleküler, hücresel ve doku düzeyinde oluşabilir. Her beyin eşsizdir. Her iç ve dış stres yanıt kendi yolu vardır; bazıları direnirken, diğerleri farklı patolojiler gösterir. Klinik tablo ile nöropatolojik tablo arasındaki tutarsızlıklar genellikle vardır, çünkü lezyonların topografyası moleküler doğalarından çok klinik sunumu belirler. Doğru ve kesin tanı ancak klinik sendrom ile nörolojik bulgularla birleştirilerek elde edilebilir ve bu bulgular hastalıkların patogenezini çözmek için gerekli önemli etiyolojik ipuçlarını eklemektedir. Avrupa'da nöropatolojik tanıya standart bir yaklaşım oluşturma çabası vardır. Tanı protokolümüz neredeyse tamamen beyin bankacılığı için nöropatolojik tanı ile ilgili son yayınlanan yönergeleri izler^91. Bu bize toplamak ve iyi belgelenmiş beyin dokusu paylaşmak için izin verecektir, ilk İtalyan Beyin Bankası kurma potansiyel amacı ile. Nitekim, İtalya'da beyin depoları ama kohort çalışmalara dayalı beyin bankaları vardır. Amacımız, İtalya genelinde yaygın olarak uygulanabilecek beyin dokusu hasat için ortak bir protokol kullanan ve benzer materyalleri paylaşan bir ağ kurmak için bir yöntem geliştirmektir. Bunu yapmak için, diğer araştırma merkezlerinin katılımı ve belirli bir web sitesinin oluşturulması gelecek için ana hedefler arasında yer almaktadır.

Yenilikçi teknolojiler sürekli nörodejeneratif hastalıkların moleküler doğasının analizi ve biyomarker tanımlama için kullanılmaktadır. Bu bağlamda, nöropatolojik olarak doğrulanmış epidemiyolojik yaklaşımın önemini vurgulayan, uzunlamasına çalışmalarla elde edilen bilişsel ve yaşlanma yörüngeleri hakkında bilgiler eşliğinde beyinlere giderek artan bir ihtiyaç olacaktır⁹².

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
50ml polipropilen konik tüp 30x115mm	BD	405253
Anti-GFAP	Dako	Z0334	poliklonal primer antikoru (anti-tavşan); seyreltme = 1:1000
Anti-NeuN (A60)	Chemicon	MAB377	monoklonal primer antikor (anti-fare); seyreltme = 1:1000
Anti-fosfo TAU (AT8)	ThermoScientific	MN1020	monoklonal primer antikor ( fare karşıtı); seyreltme = 1:200
Anti-fosfo TDP-43 (pS409/410-2)	CosmoBio	TIP-PTD-P02	poliklonal primer antikor (anti-tavşan); seyreltme = 1:4000; ön işlem: Sitrat tamponu ile 2 dk-1 dk-2 dk mikrodalgada üç adım 0.01M pH 6
Anti-&alfa;-SYN (KM51)	Novocastra	NCL-L-ASYN	monoklonal primer antikor (anti-fare); seyreltme = 1:500; ön işlem: 1) Sitrat tamponu 0.01M pH 6 ile 2 dk-1 dk-2 dk mikrodalgada üç adım; 2) 10 dakika Anti-&beta için H2O'da% 70 formik asit
; amiloid (4G8)	BioLegend	800703	monoklonal primer antikor (anti-fare); seyreltme = 1:1000; ön işlem : 10 dakika boyunca H2O içinde% 70 formik asit
Kesme tahtası	BD	352070
DMEM Yüksek Glikoz	Carlo Erba	FA30WL0101500	orta
5d bıçaklı elektrikli testere	CEA	06.06.14/06.00.16
Elektrot pH ölçüm yüzeyi 12mm	CEA	70064.250 HHH
Elektrot pH iğnesi	Fisher Scientific	11796338
EnVision+System-HRP	Dako	K4001	ikincil antikor (anti-fare); seyreltme 1:2
EnVision+System-HRP	Dako	K4003	ikincil antikor (tavşan karşıtı); seyreltme 1:2
Ethylether	SMI	8401530
Tüy güvenliği düzeltmesi bıçak bıçağı 14cm	Fisher Scientific	11749798
Fetal Sığır Serumu	Carlo Erba	FA30WS1810500	orta takviye; seyreltme =% 20
Forseps 15 cm cerrahi veya anatomik	uvex	500XG
eldiven	CEA	01.28.14
Tutkal	Arcobaleno	2624000800002
Baş destekçisi	Lacor	60456
L-Glutamin (100X)	Carlo Erba		FA30WX0550100 orta takviyesi; seyreltme =% 1
Ölçüm bandı	CEABIS	CEATA34
Adsorbe edilemeyen monofilament siyah poliamid	UHU Bostik	8000053131470
Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi (100X)	Life Technologies	11140050	orta takviyesi; seyreltme =% 1
Kalem/Strept Solüsyonu (100X)	Carlo Erba	FA30WL0022100	orta takviye; seyreltme =% 1
Spinal iğne quincke uç noktası 20GA 3.50IN 0.9x90mm	CEA	03.06.16
N° ile steril neşter; 21 bıçaklı
Cerrahi lavabo	Olcelli Farmaceutica	A930857255
Cerrahi tokmak ve cerrahi sisel	CEA	79.68.88
Cerrahi makas	CEA	27.08.45/79.68.64
	Tüy	M130RC