Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Sürekli Akışta Birincil İnsan Endotel Hücrelerinin Pnömokok Enfeksiyonu

5.9K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/60323

⸱

31 Ekim 2019

 ,  ,  , 
1Institut für Mikrobiologie, Technische Universität Braunschweig, 2Devision of Infection Medicine, Department of Clinical Science, Lund University, 3Medical Microbiology and Hospital Epidemiology, Max von Pettenkofer Institute, Ludwig Maximilians University, 4Department of Molecular Infection Biology, Helmholtz Center for Infection Research

Bu makalede

Özet

Bu çalışmada, tanımlanmış akış koşullarında kesme stresi altında farklılaştırılmış insan primer endotel hücrelerinin yüzeyinde üretilen pnömokok komponent dizelerine bağlıpnozyağının mikroskobik takibi açıklanmaktadır. Bu protokol, diferansiyel immünboyama prosedürleri uygulanarak belirli hücre yapılarının ayrıntılı görselleştirilmesi ve bakterilerin sayısallaştırılması için genişletilebilir.

Özet

Streptococcus pneumoniae'nin endotel hücrelerinin yüzeyi ile etkileşimi Von Willebrand Factor (VWF) gibi mekanosiz proteinler aracılığıyla kan akışında aracılık edilir. Bu glikoprotein, kesme stresine yanıt olarak moleküler konformasyonunu değiştirir ve böylece geniş bir konak-ligand etkileşimi spektrumu için bağlayıcı bölgeleri açığa çıkarır. Genel olarak, tanımlanmış bir kesme akışı altında primer endotel hücrelerinin kültürlenme belirli hücresel farklılaşma ve bir kan damarının iç astar fizyolojisi andıran istikrarlı ve sıkıca bağlı endotel tabakasıoluşumunu teşvik bilinmektedir . Bu nedenle, bakteriyel patojenler ve mekanosensit proteinleri içeren konak vaskülatür arasındaki etkileşimlerin fonksiyonel analizi, yüzeyini etkilediği bilinen fizyolojik akış kuvvetlerini simüle eden pompa sistemlerinin kurulmasını gerektirir. vasküler hücreler.

Bu çalışmada kullanılan mikroakışkan cihaz, tanımlanmış akış hızına sahip sıvıların sürekli ve darbesiz dolaşımını sağlar. Bilgisayar kontrollü hava basıncı pompa sistemi sürekli, tek yönlü ve kontrollü bir ortam akışı oluşturarak endotel hücre yüzeylerine tanımlanmış bir kesme gerilimi uygular. Hücrelerin morfolojik değişimleri ve bakteriyel eki mikroskobik olarak izlenebilir ve mikroskobik görüntüleme için tasarlanmış özel kanal slaytları kullanılarak akışta ölçülebilir. Genel olarak bağışıklık etiketleme ve mikroskobik analizlerden önce örnek fiksasyon gerektiren statik hücre kültürü enfeksiyonunun aksine, mikroakışkan slaytlar hem proteinlerin, bakterilerin hem de hücresel bileşenlerin floresan tabanlı saptanmasını sağlar. örnek fiksasyondan sonra; seri immünofloresan boyama; ve gerçek zamanlı olarak doğrudan floresan tabanlı algılama. Floresan bakteriler ve spesifik floresan etiketli antikorlar ile birlikte, bu enfeksiyon prosedürü vasküler süreçler ile ilgili bilimsel uygulamaların büyük bir spektrum için verimli bir çoklu bileşenli görselleştirme sistemi sağlar.

Giriş

Pnömokok enfeksiyonlarının patogenezi, plazminojen ve VWF1gibi ekstrasellüler matriks bileşikleri ve insan hemostaz bileşenlerinin çeşitliliği ile çok yönlü bir etkileşim ile karakterizedir,2, 3,4,5,6,7,8. Multidomain glikoprotein VWF vasküler trombüs oluşumu yerinde trombosit işe ve fibrin incorporation aracılık ederek dengeli bir hemostaz anahtar düzenleyici olarak hizmet vermektedir9. Kanama kontrolü ve yara iyileşmesi için fonksiyonel, aktif VWF'nin önemi von Willebrand hastalığı ile gösterilmiştir, yaygın bir kalıtsal kanama bozukluğu10.

Globüler VWF kadar bir konsantrasyonda insan kan sisteminde dolaşır 14.0 μg/mL11,10. Vasküler yaralanmaya yanıt olarak, endotel Weibel Palade Organları (WBP) tarafından VWF lokal sürümü belirgin artmıştır11,12. Önceki çalışmalar, pnömokok insan endotel hücrelerine bağlılık ve gözenek oluşturan toksin pnömolysin üretimi önemli ölçüde luminal VWF salgılanmasını uyarır göstermektedir13. Kan akışının hidrodinamik kuvvetleri mechanoresponsive VWF etki alanlarının yapısal bir açılış neden. 10 dyn/cm2 akış hızlarında VWF, subendothelium10,12'yebağlı kalan birkaç yüz mikrometreye kadar uzun protein dizelerine multimerize eder.

Pnömokokların endotel yüzeyi ile etkileşiminde kesme stresi altında oluşturulan çok merize VWF dizelerin işlevini anlamak için mikroakışkan tabanlı hücre kültürü enfeksiyonu yaklaşımı oluşturulmuştur. Yazılım kontrollü hava basıncı pompa sistemine sahip mikroakışkan bir cihaz kullanıldı. Bu, hücre kültürü ortamının tanımlı akış hızına sahip sürekli, tek yönlü bir sirkülasyonunu sağladı. Bu nedenle, sistem endotel hücrelerinin yüzeyinde tanımlanmış bir kesme stresi uyguladı, hangi özel kanal slaytlar içinde bağlı kaldı. Bu yaklaşım, VWF dizelerinin tanımlanmış sabit akış koşullarında farklılaştırılmış endotel hücrelerinde üretildiği insan vasküler sisteminin kan dolaşımı içindeki kesme kuvvetinin simülasyonuna olanak sağladı. Bu amaçla, endotel hücreleri akış sırasında mikroskobik analizler için uyarlanmış belirli kanal slaytlarında (bkz. Malzemeler Tablosu)yetiştirilmiştir. Mikroakışkan pompa sistemi, yoğun endotel hücre tabakasıüzerinde genişletilmiş VWF dizeleri oluşumu için gerekli olan yüksek tanımlı ve kontrollü kesme gerilimi durumunu sağlamıştır. Konfluently yetiştirilen insan göbek ven endotel hücrelerinin VWF-salgılanması uyarılmasından sonra (HUVEC) histamin takviyesi tarafından, dize oluşumu bir kesme stresi uygulanarak indüklendi () 10 dyn / cm2. Kesme gerilimi hücre tabakasıüzerinde hareket eden kuvvet olarak tanımlanır. Yaklaşık cornish et göre hesaplanır. 1. denklem 1 ile al.14:
figure-introduction-1

Dyn/cm2'dekikesme gerilimi , η = viskozite (dyn)/cm2, h =kanal yüksekliğinin yarısı, w = kanal genişliğinin yarısı ve Φ = mL/dk'da akış hızı.

Denklem 1'in sonucu, kullanılan farklı slaytların farklı yükseklik ve genişliklerine bağlıdır (bkz. Malzemeler Tablosu). Bu çalışmada 0.4 μm'lik bir Luer kanal slaytı kullanılmıştır ve bu slayt 131.6'dır (bkz. formül 2).
figure-introduction-2

37 °C'de ortamın viskozitesi 0.0072 dyn/cm² olup, 10 dyn/cm² kesme gerilimi kullanılmıştır. Bu da 10,5 mL/dk akış hızıile sonuçlandı (bkz. formül 3).
figure-introduction-3

Burada, konak vaskülatürde bakteriyel enfeksiyon mekanizmalarının araştırılması ve görüntülenmesi için tek yönlü laminar akış sistemi kullanılarak mikroakışkan hücre culturing prosedürünün uyarlanma ve ilerlemesi ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Endotel tabakalarında VWF dizeleri üretimi de sürekli ve sürekli kesme stresi uygulamak mümkün diğer pompa sistemleri kullanılarak uyarılabilir15.

VWF dize oluşumunun akışı ve uyarılmasında biraraya gelmek için birincil endotel hücrelerinin ekiminden sonra, kırmızı floresan proteini (RFP)16'yı sürekli mikroskobik kontrol altında endotel hücre tabakasına eklenmiştir. Endotel hücrelerinin yüzeyindeVWF dizeleri bakteri eki mikroskobik görselleştirilmiş ve VWF özgü floresan etiketli antikorlar kullanılarak gerçek zamanlı olarak üç saate kadar izlendi. Bu yaklaşımla VWF'nin vasküler endotel'e bakteriyel bağlanmasını teşvik eden bir yapışma kofaktör olarak rolü8olarak belirlenmiştir.

Protein salgısı nın mikroskobik görselizasyonu na ve konformasyonel değişikliklere ek olarak, bu yöntem bakteriyel enfeksiyon süreçlerinin tek adımlarını gerçek zamanlı olarak izlemek ve farklı zaman noktalarındaki bağlı bakteri miktarını ölçmek için kullanılabilir. Enfeksiyon. Özel yazılım kontrollü pompa sistemi de birkaç gün için tanımlanmış sabit akış koşullarında endotel hücreleri kültür imkanı sağlar ve tanımlanmış darbeli orta akış kuluçka sağlar. Ayrıca, bu yöntem farklı hücre türleri kullanılarak uygulanabilir. Boyama protokolünün uyarlanması aynı zamanda ökaryotik hücrelere dahil edilen bakterilerin algılanmasını ve görüntülenmesini sağlar.

Bu makale, patofizyolojik süreçlerin verimli ve çok yönlü bir karakterizasyonu için tanımlanmış, güvenilir ve tekrarlanabilir bir yaklaşım olarak kullanılabilecek bu gelişmiş deneysel protokolü açıklamaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Mikroakışkan hücre ekimi ticari birincil insan göbek ven endotel hücreleri (HUVEC) ile yapıldı. Şirket, donörün bilgilendirilmiş onayı ile hücreleri izole etti. Bu çalışma, Federal Eyalet Baden-Wuerttemberg Doktorlar Odası Etik Komitesi tarafından referans numarası 219-04 ile onaylanmıştır.

NOT: Protokol malzemeleri için Malzeme Tablosu'na bakın.

1. Primer Endotel Hücrelerinin Preresitresi

  1. 37 °C'de üç farklı donörden 1 x 105 primer HUVEC içeren dondurulmuş gliserol şişesini 37 °C'de eritin ve hücreleri önceden ısıtılmış endotel hücre büyüme ortamının 7 mL'lik (ECGM, takviyelerle kullanıma hazır) 25 cm2 hücreli bir şişede tohumlayın.
    NOT: Primer endotel hücreleri 5'ten fazla proliferasyon döngüsünden sonra ayırımkapasitelerini kaybederler. Bu nedenle, hücre farklılaşmasının yüksek derecelerde olması gerektiğinde sadece 5 pasajdan az olan hücreler kullanılabilir.
  2. 37 °C'de hücreleri %5 CO2 atmosferde 60 dk boyunca geliştirin ve eGM hücre kültür ortamının kriyokorumadan kalıntılardan kurtulması için değiştirin.
  3. Hücreleri %5 CO2 atmosferinde 37 °C'de bir alt hücre tabakası oluşturana kadar karıştırmaya devam edin.
    NOT: HUVEC, sıkı hücre-hücre kontatları daha sonra akışta kararlı bir hücre tabakasının oluşumunu önlediği için bir konfluent tabakaya büyümemelidir.

2. Streptococcus pneumoniae precultivation

DİkKAT: Streptococcus pneumoniae bir biyogüvenlik düzeyi 2 ajandır ve sadece biyogüvenlik seviyesi 2 laboratuarlarında kültürlenebilir. Tüm bakteriyel tedaviler için güvenlik seviyesi 2 için sınıflandırılmış temiz bir tezgah kullanın, kesinlikle aerosol oluşumunu önlemek, ve bakterilerin sedimantasyon için aerosol korumalı bir santrifüj kullanın.

  1. Streptococcus pneumoniae klinik izole ATCC11733 sürekli -80 °C'de depolanan bir gliserol stok elde ile bir Columbia kan agar plaka aşılamak ve 37 °C ve% 5 CO2gecede agar plaka yetiştirmek .
  2. Hazırlamak 40 Todd Hewitt sıvı suyu% 1 maya ekstresi ile takviye (THY) ve steril fosfat tamponlu salin 15 mL (PBS) pH 7.4, bakteri yetiştiriciliği ve yıkama adımları için.
  3. Bakteriyel ekimi için steril bir tüp kullanın ve bakteri kitlesi ile sıvı kültür suyu aşılamak. Referans olarak aşısız sıvı suyu karşı 600 nm'de 1 mL aliquots fotometrik ölçüm ile aşılama miktarını kontrol edin. 0,15 600 nm (OD600)optik yoğunluğa ulaşana kadar sıvı suyu içine bakteri kütlesi doldurun.
  4. Aşılanmış sıvı suyu 37 °C ve %5 CO2'de sallamadan kuluçkaya yatırın ve plastik cuvettes kullanarak 1 mL aliquots ölçerek her 30 dakikada bir OD600'ü belirleyin.
  5. Bakteri kültürü, üstel büyüme aşamasına karşılık gelen 0,4'ün OD600'üne ulaşır ulaşmaz, oda sıcaklığında (RT) 10 dk'da bakteri kültürünün süspansiyonuna 10 dakika süreyle santrifüj edin.
    NOT: Yüksek pnömokok kültür yoğunluğu genel bakteriyel fitness etkileyebilir bakteriyel otoliz tetiklediği bilinmektedir, çünkü bir pnömokok kültürü, 1.0'dan fazla bir OD600 ulaşmak için izin vermeyin.
  6. Bakteriyel tortuyu 10 mL PBS ile hafifçe yeniden askıya alın ve 10 dk 10 dk'da RT'de 1.000 x g.'ya geri alın.
  7. Yıkanmış bakteriyel tortuyu 1 mL PBS'de hafifçe askıya alın ve referans olarak 1 mL PBS kullanarak bakteriyel süspansiyonun 10 μL'lik OD600'ü belirleyin.
  8. PBS'deki bakteri miktarını 2.0'lık Bir OD600'e ayarlayın. Önceden belirlenen bakteriyel sayıma göre, 2.0'lık bir OD600 2 x 109 koloni şekillendirme birimine (CFU) karşılık gelmektedir. Bakteriyel otolizi önlemek için hemen enfeksiyon prosedürüne devam edin.

3. Mikroakışkan Koşullarda HUVEC Endotel Hücre Ekimi

  1. Hücre kültürü şişesinden birincil endotel hücrelerini kontrollü proteolysis ile ayırın. Temiz bir tezgah kullanarak steril bir ortamda aşağıdaki adımları gerçekleştirin. Yıkama adımları için 15 mL steril PBS hacmi hazırlayın.
    1. EkGM'yi alt tabakadan çıkarılan HUVEC tabakasından çıkarın ve hücre kültürü ortamından kurtulmak için serolojik pipet kullanarak hücre tabakasını 10 mL PBS ile yıkayın.
    2. Yıkanmış HUVEC'i 37 °C önceden ısıtılmış hücre ayrıştırma çözeltisi ile 37 °C'de 5 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın. Her dakika mikroskobik izleyerek proteolitik hücre ayrışma gözlemleyin.
    3. Pipet, proteozisi durdurmak ve rt'de 220 x g'de hücreleri 3 dakika boyunca tortul etmek için %2 fetal baldır serumu (FCS) ile desteklenerek 7 mL ECGM içeren bir tüpe ayrılmış hücre süspansiyonu.
    4. %5 FCS ve 1 mM MgSO4ile desteklenen 250 μL ECGM'de süpernatantı çıkarın ve HUVEC'i yeniden askıya alın. Neubauer hücre sayma odası nı kullanarak hücre sayımı için hücre süspansiyonunun 10 μL'sini kullanın ve hücre sayısını %5 FCS ve 1 mM MgSO4ile desteklenen 4 x 106 hücre/mL ECGM olarak ayarlayın.
      NOT: Her akış deneyi için %5 FCS ve 1 mM MgSO4 ile desteklenen 30 mL ECGM ortamı gerekecektir. Buradan bu orta kompozisyon ECGMS-medium olarak adlandırılır. Kültür ortamındaki FCS konsantrasyonunun %2'den %5'e yükselmesi, kanal slaytında bulunan HUVEC'nin hücre eki ve hücre canlılığını destekler. Orta takviyeleri FCS ve MgSO4 önemli ölçüde kesme stres koşulları altında HUVEC hücre eki stabilize.
  2. Tohum ve bir kanal slayt HUVEC yetiştirmek. Temiz bir bank kullanarak steril bir ortamda çalışın. Hücreler 2 gün boyunca kesme stresi altında yetiştirilecek ve ardından bakterilerle enfeksiyon ve 2 saat boyunca mikroskobik izleme yapılacaktır.
    1. Hava kabarcıklarının sayısını azaltmak için 37 °C'de %5 CO2 atmosferine sahip bir kuvözde 24 saat boyunca, bir kanal slaytını, 1,6 mm çapında ve 50 cm uzunluğunda bir perfüzyon seti, ECGMS-orta sının bir aliquot'u ve 0,4 m yüksekliğinde luer kanal lı kaydırağı dengeleyin.
      NOT: Bu prosedür plastik ekipman gaz dan arındırmak ve orta, perfüzyon tüpleri ve rezervuarlar önceden ısınmak için tavsiye edilir. Rt'de veya buzdolabında malzeme veya sıvı depolanmışsa, deney sırasında kuvözde ısıtıldığında plastik ve sıvılarda çözünmüş gazlar serbest bırakılır. Gaz kabarcıkları daha sonra görünür. Deneyden önce tüm plastik bileşenlerin gazdan arındırılanması bu etkiyi ortadan kaldıracaktır. Sistem her kuvözden çıkarıldığında gaz emme işlemi yeniden başlar. Bu nedenle, RT'de hızlı çalışın ve akışkan üniteyi asla daha uzun süre kuvöz dışında bırakmayın.
    2. PBS çözeltisinde %2 steril filtrelenmiş domuz jelatin çözeltisinin 100 μL'sini sıcaklık dengesi olan kanal kaydırağının rezervuarlarından birine enjekte etmek için bir pipet kullanın. Jelatin çözeltisini 37 °C'de 1 saat boyunca kuluçkaya yatırın ve 1 mL Luer şırınga kullanarak steril koşullar altında 1 mL PBS ile slayt kanalını durulayın.
    3. Jelatin kaplı kanal kaydırağini ince bir polistiren veya strafor plakaüzerine yerleştirin ve slayt sıcaklığında bir düşüş önleyin. Slayta 1 mL Luer şırınga ile 4 x 106/mL HUVEC süspansiyonunun 100 μL'sini ekleyin.
      NOT: Kanal kaydırağının temiz tezgahın soğuk metal yüzeyine yerleştirilmesi, slayt alt ısısını düşürerek endotel hücrelerine soğuk stres yaratabilir. Hücre pipetleme sırasında hava kabarcıkları yükselişi ve slayt içinden kaybolmasına izin slayt biraz yukarı tutun.
    4. 37 °C ve %5 CO2'de 60 dk HUVEC ile kanal slaytını kuluçkaya yatırın ve kanalın her iki ucundaki orta rezervuarları 60 μL ECGMS-orta ile doldurun. 37 °C'de 1 saat ve %5 CO2'dekuluçka .
  3. Mikroakışkan pompayı ve yazılım ayarlarını ayarlayın.
    1. Dengedeki perfüzyon setini pompa ünitesine bağlayın, 13,6 mL ECGMS-medium ile doldurun ve pompa kontrol yazılımını çalıştırın. Akışkan birim kurulumu menüsündeki kaydırma pencereleri kullanarak yeterli perfüzyon kümesini ve oda slayt türünü seçin. Orta viskozite için yazılımda 0,007 (dyns/cm2)seçin. (Ek Şekil 1'dekikırmızı oklarla işaretlenmiş basınç pompası yazılım ayarlarına bakın).
    2. Kuvöz dışında, kurutma silika boncukları ile dolu bir cam şişeyi hava basıncı tüpüne bağlayın (Şekil 1, Inset 3'ebakın). Basınç pompası hava perfüzyon rezervuarları ve pompa arasında dolaşır ve pompa cihazı yeniden girmeden önce kuru olmalıdır. Yazılım menüsünde Akış Parametreleri'ni seçin, basıncı 40 mbar'a ayarlayın ve pompa tüplerini sürekli orta akışı başlatarak sıvı ortamla yıkayın. (Bu ayarlar ek şekil 1'dekırmızı oklarla da gösterilir).
    3. Akış ekiminin istenilen kesme gerilim döngülerini programla. 5 dyn/cm2ile başlayın, dengeli rezervuar pompalarını kontrol edin ve pompa sisteminde hava kabarcıklarının dolaşmayacağından emin olun.
      NOT: Bir kanal kaydırağındaki duvar kesme gerilimi akış hızına ve perfüzyon ortamının viskozitelerine bağlıdır. Başka bir pompa sistemi kullanıyorsanız, lütfen istenilen kesme gerilim ibarat düzeyini üreten bir akış hızı ayarlamak için girişte açıklanan denklemlere bakın. Açıklanan ayarlar 5,42 mL/dk akış hızına karşılık gelir (Basınç pompası yazılımındaki yeterli akış parametre ayarlarını gösteren örnek bir ekran görüntüsü Ek Şekil 2'degösterilmiştir).
    4. Pompa kontrol yazılımındaki akış sirkülasyonunu durdurun ve Luer bağlantılarının yakınındaki tüpleri sıkıştırarak perfüzyon borusundaki orta akışı tutun. Kanal slaytını bağlayın, bu nedenle hava kabarcıklarından kaçının ve akışkan üniteyi bağlı kanal kaydırağıyla 37 °C ve %5 CO2'deco2 kuluçka makinesine yerleştirin. Kesme gerilimini 30 dk için 5 dyn/cm2'de başlatarak, kesme gerilimini hızlandırmadan önce hücreleri kesme geriliminin oluşturduğu kuvvetlere sorunsuz bir şekilde uyarlayınız (Bkz. Ek Şekil 3).
      NOT: Akıştaki hava kabarcıklarının hareketi hücre kopmasına yol açabileceğinden, tüp sisteminde veya kaydırakta hiçbir hava kabarcığı kalmamasına dikkat edin.
    5. Kesme gerilimini 10 dyn/cm2'ye (bu akış ayarında 10,86 mL/dk'ya karşılık gelir) hızlandırın ve hücre farklılaşmasına izinvermek için 37 °C'de küçük bir CO2 kuluçka makinesinde 48 saat boyunca kanal kaydıraği sürekli kesme geriliminde kuluçkaya yatırın ( ilgili yazılım settinngs Ek Şekil 4kırmızı oklar ile gösterilir.
      NOT: HUVEC hücreleri, akış ekimine doğrudan 10 dyn/cm2'debaşlanırsa kanal yüzeyinden kopma eğilimindedir. Akış ekimi en az 30 dk için 5 dyn/cm2 kullanılarak daha az kesme gerilimi ile başlatılırsa hücreler oda yüzeyine bağlı kalır ve ardından makas gerilimini istenilen 10 dyn/cm2'yekadar yavaşça artırmaktadır. 10 dyn/cm2'lik kesme gerilimi, VWF dize oluşumu için gerekli olan bu perfüzyon ayarındaki minimum değerdir.
    6. Mikroakışkan hücre ekimi 24 saat sonra, tam olarak dengeli bir orta seviyeye her iki orta rezervuarlarda ulaşıldığında pompa kontrol yazılımı ile orta akışı durdurmak. Akışkan üniteyi temiz bir tezgaha yerleştirin ve perfüzyon rezervuarlarının 10 mL'lik sirkülasyon ortamını 10 mL serolojik pipet kullanarak çıkarın. Ortamı yenilemek için rezervuarlara 10 mL ECGMS-medium ekleyin, akışkan üniteyi 37 °C ve %5 CO2'deCO2 kuluçka makinesine geri yerleştirin ve pompa kontrol yazılımını kullanarak akışkan ekimini yeniden başlatın.
      NOT: Basınç pompası nın işlevi aniden güçlü bir manyetik alan bozukluğu oluşturabilirsiniz büyük santrifüjler gibi laboratuvar makineleri tarafından bozulabilir. Bu ani bozulma hücre kopmasına yol açabilir. Bu tür makinelerin deney sırasında basınç pompasıyakınında aktif olmayana dikkat edin.
    7. Mikroskobik görüntülemeden 24 saat önce sıcaklık dengesi için floresan mikroskobun evresini kapsayan sıcaklık kuluçka odasının 37 °C'ye önceden ısınmasına başlayın. Mikroskop önceden ısındıktan sonra, mikroskop yazılım kontrolünü başlatın ve uygun filtre ayarlarını seçerek floresan mikroskobik izleme için temel ayarları ayarlayın (RFP ifade eden bakterilerin tespiti için 540 nm/590 nm ve FITC konjuge VWF spesifik antikorların floresan emisyonunun saptanması için 470 nm/515 nm). 37 °C'de akışkan ünitenin kuluçkaya yatması için ek bir ısıtma odasını önceden ısıtın.
      NOT: Enfeksiyon analizleri ve mikroskobik izleme sırasında kanal slayt ve sirkülasyon ortamı sıcaklığı önemli ölçüde azalmamalıdır, bu hücreler üzerinde soğuk stres üretecek çünkü. Genel olarak, mikroskop aşamasını kaplayan sıcaklık odalarının büyüklüğü tüm akışkan üniteyi kapsayacak kadar yeterli değildir. Bu nedenle, 37 °C'ye önceden ısıtılmış ek bir ısıtma odası kullanılması tavsiye edilir.
    8. Mikroskobik görüntüleme için, akışkan üniteyi 37 °C önceden ısıtılmış ısıtma odasına yerleştirin ve kanal kaydırasını 37 °C önceden ısıtılmış mikroskobun bir sahnesine yerleştirin.
      NOT: Mikroskobik görüntüleme için, perfüzyon borusu sınırlı uzunluğu nedeniyle co2 inkübatörden akışkan birim ve kanal slaytının çıkarılması gerekiyordu. PH tamponlama için %5 CO2 atmosferinin dışında enfeksiyon süreleri ve 180 dk'dan uzun mikroskobik izleme gerekiyorsa, mikroakışkan ekimi için pH tamponlu bir ortam kullanılmalıdır.
    9. Akış deneyi boyunca akış dolaşımına histamin ve bakterilerin enjeksiyonundan önce ve mikroskobun parlak alan modunu kullanarak akış deneyini tamamladıktan sonra hücre morfolojisini ve HUVEC tabakasının bütünlüğünü kontrol edin.

4. VWF-release indüksiyon ve Multimerized VWF Dizeleri Görselleştirme

  1. VWF'nin 200 MDa'ya kadar uzun dizelere çoklu merizasyonunu tetiklemek için 10 dyn/cm2'lik bir kesme gerilimi gerektiğinden, akış ayarını koruyun. VwF'nin endotel WPB'den salgılanmasına neden olarak 100 mM histamin stok çözeltisinin 136 mL'lik kısmını bir enjeksiyon portu kullanarak perfüzyon tüpünde dolaşan ECGMS-orta koğur içine enjekte edin. Akış ortamındaki histaminin son konsantrasyonu 1 mM olacaktır. Enjeksiyon portu yoksa, histamin pompa rezervuarlarının orta içine pipetleme ile alternatif olarak eklenebilir.
  2. Multimerized VWF dizelerin immünoresans tespiti için, rezervuarlarda dengeli bir orta seviyeye ulaşıldığında akışı durdurun ve 200 μL PBS (pH 7,4) hacminde 20 μg VWF'ye özgü FITC konjuge antikor enjekte edin. EcGMS-orta bir enjeksiyon portu kullanarak. Enjeksiyon portu yoksa, antikor pompa rezervuarlarının orta içine pipetleme ile alternatif olarak eklenebilir. Bu da 1.3 g/mL'lik son antikor konsantrasyonu ile sonuçlanır.
  3. Kısa sürede çeşitli görüş alanlarının mikroskobik taraması için, mikroskobun floresan ünitesini %30 güçte bir Ksenon floresan cihazı ve epifloresan kamera ile kullanın. VWF dizeleri görselleştirme için uygun temsil hücreleri seçmek için parlak alan modu ile HUVEC tabakasının şekil ve morfolojisini izleyin.
  4. Yeşil floresan VWF dizelerin görselleştirilmesi için mikroskop yazılımının (LasX) floresan ünitesi menüsünde 63x/1.40 yağ hedefi ve 470 nm algılama filtresi seçin. Her biri yaklaşık 10 morfolojik olarak bozulmamış HUVEC içeren en az 50 temsili alan görünümünden oluşan Z yığınlarının anlık görüntülerini oluşturun. Yeşil floresan VWF dizelerin farklı zaman noktalarında ölçülmesi için, çeşitli görüş alanlarını tarayabilirsiniz.

5. Gerçek Zamanlı AkışVWF-dizeleri Bakteriyel Eki Mikroskobik Değerlendirilmesi

  1. Immünororesans tespiti yoluyla HUVEC hücre yüzeylerinde üretilen VWF-string'lere pnökokok eki ölçün.
    1. Akışı tutun ve enjeksiyon portu kullanarak ECGMS-orta içine 1 mL maksimum hacimde 1.35 x 108 CFU/mL RFP ifade pnömokok enjekte. Alternatif olarak, pipet pompa rezervuar orta içine bakteri. 10 dyn/cm2'de kesme gerilimini yeniden başlatın ve bakterilerin pompa sistemi içinde dolaşmasını sağlar.
    2. Mikroskop büyütme için 63 x yağ daldırma hedefi seçin ve mikroskop yazılımındaki floresan filtre ayarlarını RFP-expressing pnömokokların tespiti için RFP kanalına (540 nm algılama filtresi) ayarlayın.
    3. VWF dizeleri bakteriyel eki nicelik için, akışı durdurmak ve en az 30 temsili alan görünümleri Z-yığınları anlık oluşturmak, her yaklaşık 10 morfolojik olarak bozulmamış HUVEC içeren, ve pnömokok miktarını saymak.
    4. Verileri değerlendirmek için ANOVA tek faktörlü istatistik algoritmasını kullanın ve ardından ayrıntılı istatistiksel karşılaştırma için iki kuyruklu olmayan örneklem testi nin ardından. <0.05 p değerleri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

6. Örnek Fiksasyon Sonrası VWF-string'lere Bakteriyel Bağlanmanın Mikroskobik Değerlendirilmesi

  1. İmmünofluoresans boyama dan önce fiksasyon örneği.
    1. Akışı durdurun, pompa haznelerinden 10 mL ECGMS-orta yıkın ve %5 paraformaldehit (PFA) ile birlikte 10 mL PBS ekleyin. PFA çözeltisi 10 dyn/cm2'likbir kesme geriliminde 10 dakika boyunca dolaşsın.
    2. Kanal kaydıranını pompa ünitesinden çıkarın.
  2. Hücre yüzeyinde ki spesifik olmayan bağlanma alanlarını engelleyin ve VWF dizeleri ve bağlı bakterilerin immünositasyon gerçekleştirmek.
    1. Tüm yıkama adımları için %4 sakaroz ile takviye edilmiş 100 mM Na2CO3 (pH 9.2) içeren 4 mL yıkama çözeltisi hazırlayın. Spesifik olmayan bağlama bölgelerinin engellenmesi için %4 sakaroz ve %2 büyükbaş hayvan serum albumini (BSA) ile takviye edilmiş 100 mM Na2CO3 (pH 9.2) içeren bir bloklama çözeltisinin 1 mL'sini hazırlayın.
    2. 200 μL yıkama çözeltisine 200 μL enjekte etmek ve 200 μL engelleme çözeltisi ile 120 dakika boyunca rt'de kaydırağı kuluçkaya yatırmak için 1 mL Luer şırınganı kullanarak PFA inküböz kanal slayt3x yıkayın.
    3. Antikorların seyreltilmesi için %4 sakaroz ve %0,5 BSA ile takviye edilmiş 100 mM Na2CO3(pH 9.2) içeren başka bir bloklama çözeltisinin 4 mL'sini hazırlayın. Pnömokok spesifik tavşan antiserum1:100 seyreltmek için bu engelleme çözeltisinin 200 μL kullanın. VWF'ye özgü fare antikor1:50'yi seyreltmek için bu engelleme çözeltisinin 200 μL'sini kullanarak VWF'ye özgü 4 μg/mL antikor konsantrasyonu kullanın. 20g/mL'lik son konsantrasyonu oluşturmak için 2 mg/mL'lik bir stok çözeltisinden 2 mg/mL'lik pBS (pH 7.4) 1:100'den AlexaFluor488 konjuge sekonder antikor seyreltin.
      NOT: Açıklanan immünorfloresan ayarlarında, antikorlar yukarıda bahsedilen alkali karbonat tamponunda seyreltildiğinde antikor tespiti en iyi sonuçları vermiştir. Önceki sonuçlara göre, önerilen engelleme çözümleri ve antikor miktarı birçok uygulama için uygundur. Ancak, farklı deneyler antikor kombinasyonu, antikor konsantrasyonu, kuluçka süresi ve engelleme tampon anayasa bireysel optimizasyonu gerektirebilir. Alternatif olarak, nötr pH aralığına sahip fosfat tamponlu bir sistem uygun olabilir ve hatta kuluçka tamponu olarak tercih edilebilir. Zayıf floresan sinyalleri durumunda sekonder antikor konsantrasyonu artırılmalıdır. Çok fazla spesifik olmayan floresan arka plan gürültüsü tespit edilirse, bloke edici maddelerin miktarı artırılmalıdır.
    4. VWF-immünoreskans boyama için kanal slaytını 1 mL Luer şırıngonu kullanarak yıkama kakması 3x'lik 200 μL'lik yıkama solüsyonu enjekte ederek ve 30 dakika boyunca seyreltilmiş VWF spesifik antikorla kaydırağı inkübün. μL yıkama çözeltisi ve RT 30 dakika için 1:100 seyreltilmiş AlexaFluor488-konjuge fare özgü antikor ile slayt inkübün. Son olarak, kanal kaydırasını yıkama çözeltisinin 200 μL'si ile 3x tekrar yıkayın.
      NOT: AlexaFluor-floroforlar beyazlatmaya duyarlıdır. Bu nedenle, slayt florofor konjuge antikorlar ile kuluçka adımları sırasında karanlık bir odada tutularak korunmalıdır.
    5. Pnömokokların immünosital tespiti için, rt.'de 30 dakika boyunca 1:100 seyreltilmiş pnömokok özgü tavşan antikoru ile slaytı kuluçkaya yatırın, daha sonra kanal slaytını yıkama çözeltisinin 200 μL'si ile yıkayın ve 1:100 seyreltilmiş slaytı kuluçkaya yatırın AlexaFluor568-konjuge tavşan özgü antikor 30 dk RT. Yıkama çözeltisi 200 μL ile tekrar 3x kanal slayt yıkayın.
    6. Hücresel aktin sitoiskeletini floresan phalloidin ile lekelemek için HUVEC'yi 120 μL 0,1 Triton X-100 ile inkübasyon la permeabilize edin. AlexaFluor350 konjuge phalloidin. Bu kuluçka adımı polimerize aktin sitoiskeletini görselleştirecek ve hücre şeklinin ve olası strese bağlı morfolojik değişikliklerin izlenmesine olanak sağlayacaktır.
    7. Kanal kaydırasını 3x yıkama çözeltisinin 200 μL'si ile yıkayın. Son olarak, 200 μL ddH2O ile slayt 4x yıkayın ve floresan mikroskop uygun filtre ayarlarını kullanarak yeşil floresan VWF dizeleri, kırmızı floresan bakteri ve mavi floresan aktisin sitoskeleton görselleştirmek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Sürekli tek yönlü akış ta birincil HUVEC Culturing mechanosensitive VWF13ile dolu hücresel WPBs üretimi teşvik bir confluent ve sıkıca paketlenmiş hücre tabakasıoluşumunda sonuçlanır,14. Bu protokol, insan kan akışında makas stres durumunu taklit gerektiren enfeksiyon analizi için bir hava basıncı pompa tabanlı, darbesiz sirkülasyon sisteminin kullanımını açıklar.

Bu sistem, akış koşullarının tanımlanmış, yazılım kontrollü bir ayarını ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

VWF gibi mekanoduyaran konak proteinleri ile bakteri etkileşiminin simülasyonu, tanımlanmış, tek yönlü ve sürekli sıvı akışını sağlayan ve dolayısıyla güvenilir kesme gerilimi üreten, perfusable bir hücre kültür sistemi gerektirir . Birçok mikroakışkan pompa sistemleri zaten tarif edilmiştir. Bergmann ve ark. kapsamlı bir inceleme farklı iki ve üç boyutlu hücre kültürü modelleri17temel yönlerini özetler.

Mikroakışkan teknoloji çok genç bir teknik 1990'ların başında kont...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Proje DFG (BE 4570/4-1) tarafından S.B.'ye finanse edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1 mL Luer-şırıngaFisher Scientific10303002slaytların luer bağlantısını kullanarak jelatin enjeksiyonu için 1 mL
hacim 2 mL Luer-şırıngaSarstedt9077136Kanal odası kızaklarının luer bağlantılarına sıvıları eklemek/enjekte etmek için
AccutaseeBioscience şimdi Thermo Fisher00-4555-56proteaz karışımı endotel hücrelerinin nazikçe ayrılması için kullanılır
AlexaFluor350-konjuge PhalloidinAbcamab176751üreticiden konsantrasyon temin edilemez, stok çözeltisi 300 tet için yeterlidir, şirket 100 ve mikro kullanılmasını önerir; L 1: 1.000 seyreltme, mavi floresan (DAPI filtre ayarları)
AlexaFluor488 konjuge keçi türevi anti-fare antikoruThermo Fisher SientificA11001stok konsantrasyonu: PFA fiksasyonundan sonra mikroakışkan slaytta insan VWF'sinin immün boyanması için 2 mg/mL, yeşil floresan
AlexaFluor568-konjuge keçi türevi anti-tavşan antikoruThermo Fisher ScientificA-11011stok konsantrasyonu: pFA fiksasyonundan sonra mikroakışkan slaytta pnömokokların immün boyanması için 2 mg/mL, kırmızı floresan
Bacto Todd-Hewitt-BrothBecton Dickinson GmbHBD 249210kompleks bakteri kültürü ortamı
Sığır Serumu Albümini (BSA)Sigma AldrichA2153-25Gçözündürülmüş, bloke edici tamponun hazırlanması için
TPP90026 filtrelihücre kültürü şişeleri25 cm2 yüzeyli kaplamasız hücre kültürü şişelerinde HUVEC'in alt kültivasyonu
Santrifüj Allegra X-12RBeckman Coulter Yaşam Bilimleri392304bakterilerin döndürülmesi (>2 mL hacimlerde)
Santrifüj Allegra X-30Beckman Coulter Yaşam BilimleriB06314ökaryotik hücrelerin döndürülmesi
Santrifüj Z 216 MKHermle305.00 V05 - Z 216 Mbakterilerin geri dönmesi (2 mL'den küçük hacimler)
KloramfenikolCarl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe3886.2kırmızı floresan proteini ve kloramfenikol direnci taşıyan genetik yapı ile dönüştürülmüş pnömokokların yetiştirilmesi için 0.2 mg / mL'lik bir konsantrasyonda kullanılır kaset
Perfüzyon tüpü için kelepçeSıvıyı10821bevor sürgüyü pompa sistemine bağlama
CO2-İnkübatörFisherScientific MIDI 40inkübatör boyutu, bağlı kanal kızağı ile akışkan ünitenin boyutuna mükemmel bir şekilde uyarlanmıştır ve 37 ° C'de akış ekimi için kullanılmıştır; C ve %5 CO2
CO><-İnkübatörSanyoMCO-18 AICtanımlanmış bir atmosferde bakteri ve hücrelerin inkübasyonu için %5 CO2< / sub> ve 37 &°C; C
Kolombiya kan agar plakalarıBecton Dickinson GmbHPA-254005.06S. pneumoniae için agar bazlı kompleks kültür ortamı %7 koyun kanı ile desteklenmiş
BilgisayarDell Latitude 3440Basınç pompası yazılımı ile Comuter
Konfokal Lazer Tarama Mikroskobu (CLSM)LeicaDMi8Floresan filtresi, Xenon-ışık kaynağı (SP8, DMi8) ve DFC 365 ile donatılmış bir floresan ünitesine sahip, ısıtılabilir bir hazne ile kaplanmış bir tablaya sahip bir ters mikroskop FX Kamera (1392 x 1040, 1.4 Megapiksel)
Di Potasyum hidrojen fosfat (KH2Psub4)Carl Roth GmbH + Co. KG, PBStamponu için kullanılan3904.1
Kurutma malzemesiMerck101969bir cam şişede kullanılan kurutma için turuncu silika boncuklar boru adaptörü ile
EKGM takviyesi KarışımıPromocellC-39215takviye karışımı: 0.02 mL/mL Fetal buzağı serumu, 0.004 mL/mL endotel hücre büyüme takviyesi, 0.1 ng/mL epidermal büyüme faktörü, 1 ng/mL bazik fibroblast büyüme faktörü, 90 & g/mL heparin, 1 & mikro; g/mL Hidrokortizonlu
EKGMSPromocellC-22010EKGM, hücre yapışmasını artırmak için %5 [a/a] FCS ve 1 mM MgSO4 ile desteklenmiştir
Endotel Hücre büyüme ortamı (EKGM, kullanıma hazır)PromocellC-22010HUVEC kültür ortamı, zaten ek karışımın tüm bileşenleri ile desteklenmiştir
Fetal Buzağı Serumu (FCS)biyokrom şimdi MerckS 0415enfeksiyon analizleri için kullanılan hücre kültürü takviyesi
FITC konjuge keçi anti-insan VWF antikoruAbcamab8822stok konsantrasyonu: 10 mg / mL, akışta küresel ve multimerize VWF'nin immünotespiti için
Akışkan ÜniteIBIDI10903akış yetiştiriciliği için akışkan ünite
Jelatin (domuz)Sigma AldrichG-1890-100gmikroslide kanal yüzeyinin ön kaplaması için
Endotelyal Weibel Palade Cisimciklerinden VWF sekresyonunun indüksiyonu içinhistamin dihidroklorürSigma AldrichH-7250-10MG
İnsan Umbilikal Ven Endotel Hücresi (HUVEC)PromocellC-12203 Lot-No. 396Z042havuzlanmış donörden alınan primer endotel hücreleri, sıvı nitrojen içinde kripkoservte depolanmış,
Santa Cruzsc73268'dentüretilen insan VWF'ye özgü antikorustok konsantrasyonu: 200 & PFA fiksasyonundan sonra mikroakışkan slaytta VWF'nin immün boyanması için g/mL
Enjeksiyon PortuAkış sirkülasyonu sırasında rezervuar borusuna histamin veya bakteri enjeksiyonu içinibidi10820
Işık mikroskobuZeissAxiovert 35Mters ışık mikroskobu 400x büyütmeye izin veren 40x su objektifi kullanarak ökaryotik hücre ayrılması ve hücre sayımının kontrolü için 400x büyütmeye
izin verirLuer-slaytlar I0.4 (ibiTreat472microslides)ibidi80176fludik yetiştirme için fiziksel olarak modifiye edilmiş slaytlar (μ – Slayt I0.4Luer, kanal yüksekliği 0.4 mm, kanal hacmi 100 μ l, 2,5 cm'lik bir büyüme alanı ve 25,4 cm'lik bir kaplama alanı 2< / sup>) Her türlü akış tahlili için uygun olan fiziksel işlem, hidrofilik ve yapışkan bir yüzey oluşturur.
Magnezyum sülfat (MgSO4, susuz)Sigma AldrichM7506-500GEKGMS ortamının hazırlanması için
Mikroakışkan Pompaibidi10905hava basıncı pompası
Neubauer hücre sayma odasıKarl Hecht GmbH & Co KG40442002HUVEC'ler için mikroskobik sayma odası
Paraformaldehit %16 (PFA)Elektron Mikroskobu Bilimleri15710-Snumunelerin çapraz bağlanması için
Perfüzyon Seti ibidi10964Perfüzyon Seti Sarı/Yeşil 1,6 mm boru çapına, 50 cm tüp uzunluğuna, toplam 13,6 mL çalışma hacmine, 2,8 mL ölü tüp hacmine ve 10 mL rezervuar boyutuna sahiptir. &mikro;-slayt L0.4Luer ile birlikte, 37 & derecede; C ve 0.0072 dyn x s/cm2 viskoziteye 3.8mL/dk ila 33.9 mL/dk akış hızı aralığı ve 3.5 dyn/cm2 ve 31.2 dyn/cm2 arasında kesme gerilimine ulaşılabilir. mikroakışkan
Fosfat tamponlu salin (PBS)uzunluğunda, çözelti aşağıdaki kimyasallar kullanılarak hazırlandı: 0.2 g / L KCl, 1.44 g / L Na2< / sub>HPO4< / sub>, 0.24 g / L KH2< / sub>PO4< / sub>, pH 7.4
Plastik küvetlerSarstedt67,741(2 x optik) 600 nm'de OD ölçümü için
Pnömokok'a özgü antiserumPineda, ısıyla inaktive edilmiş Streptococcus pneumoniae NCTC10319 ve D39 kullanılarak tavşanda yetiştirildi, proteinA-sefaroz kolonu kullanılarak IgG ile saflaştırıldı.
Polistiren veya strafor plakaBu, kanal slaytlarında ekilen hücreler üzerinde soğuk stresi önlemek için bir önlem adımıdır. Ambalaj kutusu-malzemesi gibi her türlü strafor kullanılabilir. Plaka 0,5 cm kalınlığında olabilir ve 20 cm2 boyutunda olmalıdır.
Potasyum klorür (KCl)Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe6781.1PBS tamponu için kullanılır
Pompa Kontrol Yazılımı (PumpControl v1.5.4)ibidiv1.5.4Basınç pompasını kontrol etmek, akış koşullarını ayarlamak ve akışı başlatmak/sonlandırmak için bilgisayar yazılımı
Reaksiyon tüpleri 1.5/2.0 mLSarstedt72.706/ 72.695.500antikor dilüsyonları için gereklidir
50 mL'lik reaksiyon tüpleri hacimSarstedt6,25,48,004
RFP eksprese eden pnömokoklarUlusal Tip Kültürleri Koleksiyonu, Halk Sağlığı İngiltere10,319Streptococcus pneumoniae serotip 47, genoma entegre edilmiş ahiston benzeri proteine kaynaşmış RFP'yi eksprese eder
Serolojik pipetler 5, 10 mLSarstedt86.1253.025/ 86.1254.025büyük hacimleri
pipetlemek içinSodyum Karbonat (Na2< / sub>CO<>3< / sub>, susuz)Sigma Aldrich451614-25G100 mM Sodyum Karbonat tamponu hazırlanması için
Sodyum dihidrojen fosfat (NaH2< / sub>PO4< / sub>)Carl Roth GmbH + Co. KG, KarlsruheP030.2PBS tamponu için kullanılır
Spektral Fotometre Libra S22Biochrom80-2115-20600 nm'de bakteriyel süspansiyonun optik yoğunluğunun (OD) ölçümü
Blokaj tamponunun hazırlanması içinSucroseSigma AldrichS0389-500G
Triton X-100Sigma AldrichT9284-500MLPFA fiksasyonundan sonra ökaryotik hücre geçirgenliği için dH20'da seyreltilmiş% 0.1 uç konsantrasyonda kullanılır
Maya özütüoksoidLP0021bakteriler, %1 [a/a] maya özütü ile THB takviyesinde yetiştirilir = tam bakteri yetiştirme ortamı THY
, , tüpte tutmak için ibidi , Karlsruhe Endotel hücrelerinin ön kültivasyonu için gerekli olan EKGM ortamı için fare (monoklonal) için 50 cm daha ,

Kaynaklar

  1. Weiser, J. N., Ferreira, D. M., Paton, J. C. Streptococcus pneumoniae: transmission, colonization and invasion. Nature Reviews Microbiology. 16 (6), 355-367 (2018).
  2. Bergmann, S., Hammerschmidt, S. Versatility of pneumococcal surface proteins. Microbiology. 152, 295-303 (2006).
  3. Bergmann, S., et al. Integrin-linked kinase is required for vitronectin-mediated internalization of Streptococcus pneumoniae by host cells. Journal of Cell Science. 122, 256-267 (2009).
  4. Bergmann, S., Schoenen, H., Hammerschmidt, S. The interaction between bacterial enolase and plasminogen promotes adherence of Streptococcus pneumoniae to epithelial and endothelial cells. International Journal of Medical Microbiology. 303, 452-462 (2013).
  5. Bergmann, S., Rohde, M., Chhatwal, G. S., Hammerschmidt, S. Alpha-enolase of Streptococcus pneumoniae is a plasmin(ogen)-binding protein displayed on the bacterial cell surface. Molecular Microbiology. 40, 1273-1287 (2001).
  6. Bergmann, S., et al. Identification of a novel plasmin(ogen)-binding motif in surface displayed alpha-enolase of Streptococcus pneumoniae. Molecular Microbiology. 49, 411-423 (2003).
  7. Bergmann, S., Rohde, M., Preissner, K. T., Hammerschmidt, S. The nine residue plasminogen-binding motif of the pneumococcal enolase is the major cofactor of plasmin-mediated degradation of extracellular matrix, dissolution of fibrin and transmigration. Thrombosis and Haemostasis. 94, 304-311 (2005).
  8. Jagau, H., et al. Von willebrand factor mediates pneumococcal aggregation and adhesion in flow. Frontiers in Microbiology. 10, 511(2019).
  9. Tischer, A., et al. Enhanced local disorder in a clinically elusive von willebrand factor provokes high-affinity platelet clumping. Journal of Molecular Biology. 429, 2161-2177 (2017).
  10. Ruggeri, Z. M. Structure of von willebrand factor and its function in platelet adhesion and thrombus formation. Best Practice Research Clinical Haematology. 14, 257-279 (2001).
  11. Spiel, A. O., Gilbert, J. C., Jilma, B. Von willebrand factor in cardiovascular disease: Focus on acute coronary syndromes. Circulation. 117, 1449-1459 (2008).
  12. Springer, T. A. Von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124, 1412-1425 (2014).
  13. Luttge, M., et al. Streptococcus pneumoniae induces exocytosis of weibel-palade bodies in pulmonary endothelial cells. Cellular Microbiology. 14, 210-225 (2012).
  14. Cornish, R. J. Flow in a Pipe of Rectangular Cross-Section. Proceedings of the Royal Society A. 786, 691-700 (1928).
  15. Michels, A., Swystun, L. L., Mewburn, J., Albánez, S., Lillicrap, D. Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation. Journal of Visualized Experiments. 14 (126), (2017).
  16. Kjos, M., et al. fluorescent Streptococcus pneumoniae for live-cell imaging of host-pathogen interactions. Journal of Bacteriology. 197, 807-818 (2015).
  17. Bergmann, S., Steinert, M. From single cells to engineered and explanted tissues: New perspectives in bacterial infection biology. International Reviews of Cell and Molecular Biology. 319, 1-44 (2015).
  18. Harrison, D. J., et al. Micromachining a miniaturized capillary electrophoresis-based chemical analysis system on a chip. Science. 261 (5123), 895-897 (1993).
  19. Magnusson, M. K., Mosher, D. F. Fibronectin: Structure, assembly, and cardiovascular implications. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 18, 1363-1370 (1998).
  20. Zerlauth, G., Wolf, G. Plasma fibronectin as a marker for cancer and other diseases. The American Journal of Medicine. 77 (4), 685-689 (1984).
  21. Li, X. J., Valadez, A. V., Zuo, P., Nie, Z. 2012. Microfluidic 3D cell culture: potential application for tissue-based bioassays. Bioanalysis. 4, 1509-1525 (2019).
  22. Fiddes, L. K., et al. A circular cross-section PDMS microfluidics system for replication of cardiovascular flow conditions. Biomaterials. 31, 3459-3464 (2010).
  23. Schimek, K., et al. Integrating biological vasculature into a multi-organ-chip microsystem. Lab on a Chip. 13, 3588-3598 (2013).
  24. Pappelbaum, K. I., et al. Ultralarge von willebrand factor fibers mediate luminal Staphylococcus aureus adhesion to an intact endothelial cell layer under shear stress. Circulation. 128, 50-59 (2013).
  25. Schneider, S. W., et al. Shear-induced unfolding triggers adhesion of von willebrand factor fibers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 7899-7903 (2007).
  26. Reneman, R. S., Hoek, A. P. G. Wall shear stress as measured in vivo: consequences for the design of the arterial system. Medical & Biological Engineering & Computing. 46 (5), 499-507 (2008).
  27. Valentijn, K. M., Sadler, J. E., Valentijn, J. A., Voorberg, J., Eikenboom, J. Functional architecture of Weibel- Palade bodies. Blood. 117, 5033-5043 (2011).
  28. Freshney, R. I. Culture of animal cells: A manual of basic Technique, 5th edition. , Wiley-Liss Publication, Wiley-Blackwell. (2005).
  29. Shaw, J. A. Epithelial cell culture- a practical approach. Shaw, A. J. , IRL Press at Oxford University Press. 218(1996).
  30. Elm, C., et al. Ectodomains 3 and 4 of human polymeric Immunoglobulin receptor (hpIgR) mediate invasion of Streptococcus pneumoniae into the epithelium. Journal of Biological Chemistry. 279 (8), 6296-6304 (2004).
  31. Nerlich, A., et al. Invasion of endothelial cells by tissue-invasive M3 type group A streptococci requires Src kinase and activation of Rac1 by a phosphatidylinositol 3-kinase-independent mechanism. Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20319-20328 (2009).
  32. Ho, C. T., et al. Liver-cell patterning lab chip: mimicking the morphology of liver lobule tissue. Lab on a Chip. 13, 3578-3587 (2013).
  33. Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328, 1662-1668 (2010).
  34. Harink, B., Le Gac, S., Truckenmuller, R., van Blitterswijk, C., Habibovic, P. Regeneration-on-a-chip? The perspectives on use of microfluidics in regenerative medicine. Lab on a Chip. 13, 3512-3528 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Mikroak kan CihazKayma GerilmesiVon Willebrand Fakt rHUVEC K lt rFloresan MikroskobiBakteriyel TutunmaVWF Zincirleri
Sürekli Akışta Birincil İnsan Endotel Hücrelerinin Pnömokok Enfeksiyonu
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.