Bu makalede, fare böbreği izole kapsüllü glomeruli glomeruli glomerual hücre outgrowths kültürve analiz için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem parietal epitel hücre çoğalması ve göç ile ilgili yolları incelemek için kullanılabilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Parietal Epitel Hücre Aktivasyonunda Yer Alan Yolları Analiz Etmek Için Ex Vivo Analizi olarak Glomerüler Büyüme
Bu makalede
Özet
Özet
Parietal epitel hücre (PEC) aktivasyonu glomerülosklerozun gelişimi ve ilerlemesinde rol oynayan önemli faktörlerden biridir. Parietal epitel hücre aktivasyonunda yer alan yolların inhibisyonu bu nedenle glomerüler hastalıkların ilerlemesini zayıflatmak için bir araç olabilir. Bu makalede, fare böbreği izole kapsüllü glomeruli parietal epitel hücre büyümesini analiz etmek ve kültür ve analiz etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. İzole fare böbrekleri kesildikten sonra doku doğrlanır ve glomeruli eeving tarafından izole edilir. Kapsüllü glomeruli toplanır ve parietal epitel hücreleringlomerüler outgrowth elde etmek için 6 gün boyunca tek glomeruli kültürlenir. Bu dönemde parietal epitel hücre çoğalması ve göç hücre sayısı veya büyüyen hücrelerin yüzey alanı belirlenerek analiz edilebilir. Bu nedenle bu tetki, değişmiş gen ekspresyonunun transgenik veya nakavt farelerdeki etkilerini veya kültür koşullarının parietal epitel hücre büyüme özellikleri ve sinyalizasyonu üzerindeki etkilerini incelemek için bir araç olarak kullanılabilir. Bu yöntem kullanılarak parietal epitel hücre aktivasyonu ve dolayısıyla glomerüloz sürecinde önemli yollar incelenebilir.
Giriş
Glomerüler hastalıklar böbrek hastalıklarının önemli bir grubudur ve son dönem böbrek hastalığının (ESRD) önemli bir nedenini temsil eder. Ne yazık ki, özel tedavi seçenekleri sınırlıdır ve ESRD ilerlemesi kaçınılmazdır. Glomerüler hastalıklar glomerüler yaralanma varlığı ile tanımlanır ve inflamatuar ve inflamatuar olmayan hastalıklarda gruplandırılabilir. İlk hakaret farklı olmasına rağmen, son çalışmalar da ortak bir hücresel mekanizma glomerüler epitel hücre hiperplazi yol açar ve sonuçta tüm glomerüler hastalıklarda glomerüskleroz yol göstermiştir, ne olursa olsun altta yatan neden1,2,
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm hayvan deneyleri Radboud Üniversitesi Nijmegen Hayvan Etik Komitesi yönergelerine göre yapılmıştır.
NOT: Tedavi edilmeyen, sağlıklı yabani tip (WT) fareler (n = 4) ve cd44-/- (n = 4) fareler 12−16 haftalıkken kurban edildi. Hem erkek hem de dişi fareler kullanıldı. Tüm fareler C57Bl/6 arka plan vardı.
1. Fare böbrek diseksiyonu
- Kurban sağlıklı WT fareler veya servikal dislokasyon tarafından genetik olarak değiştirilmiş fareler.
- Fareleri feda ettikten sonra farenin tüm böbreklerini doğrudan inceleyin. Bunun için, karın makas kullanarak bir median laparotomi gerçekleştirmek, cilt ve....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Glomerüler büyüme çıktısını gerçekleştirmek için yöntemin sistematik bir diyagramı Şekil 1'degösterilmiştir. Şekil 2A-D, ışık mikroskobu kullanılarak gözlenen farklı zaman noktalarında kapsüllü glomeruli glomerüler çıkıntıları göstermektedir. Büyümeler fare böbreğiglomerulus izolasyonundan sonra kültürde 2, 4 ve 6(Şekil 2B-D)gün lerinde gösterilmiştir. Büyüyen hücrel.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu makalede açıklanan protokolü kullanarak, parietal epitel hücre aktivasyonunun bir sonucu olan parietal epitel hücre proliferasyonunu değerlendirmek için tek kapsüllü glomeruli kullanabilirsiniz. Bu ex vivo modeli, parietal epitel hücre aktivasyonunda rol oynayan moleküler yolları ayrıntılı olarak incelememizi sağlayacaktır. Açıklanan yöntem, glomeruli kapsüllü glomeruli izole etmek ve kültür ve farklı deneysel koşullar altında parietal epitel hücrelerinin çoğalması ve / veya göç karşılaştırmak için böbrek diseksiyonu .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Bu araştırma Hollanda Böbrek Vakfı (grant 14A3D104) ve Hollanda Bilimsel Araştırma Örgütü (NWO VIDI hibe: 016.156.363) tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 24 oyuklu hücre kültürü plakası | Corning Costar | ||
| anti-CD31 | BD Pharmingen | Endotel hücre belirteci (kullanılan konsantrasyon 1:200) | |
| tavuk-sıçan önleyici Alexa 647 | Thermo Fisher | ( kullanılan konsantrasyon 1:200) | |
| DAPI-Fluoromount G | Southern Biotech | DAPI | |
| Dijital ters çevrilmiş ışık mikroskobu | Westburg, EVOS fl mikroskobu | ||
| eşek-anti-keçi Alexa 568 | Thermo Fisher | ( kullanılan konsantrasyon 1:200) | |
| eşek-anti-tavşan Alexa 568 | Thermo Fisher | ( kullanılan konsantrasyon 1:200) | |
| Dulbecco'nun Modifiye Kartal ortamı | Lonza | ||
| EBM Orta | Lonza | ||
| EBM-MV Tek Quots kiti | Lonza | hidrokortizon, hEGF, GA-1000, FBS ve BBE | |
| içeren Fetal Sığır Serumu | Lonza | ||
| Fetal Buzağı Serumu | Lonza | ||
| Floresan mikroskobu | Leica Microsystems GmbH | ||
| keçi-anti-sinaptopodin, | Santa Cruz | Podosit işaretleyici (kullanılan konsantrasyon 1:200) | |
| Hanks'Dengeli Tuz Çözeltisi | Gibco | ||
| ImageJ yazılımı | FIJI 1.51n | ||
| petri kabı | Sarstedt | boyutu: 100 | |
| tavşan-anti-claudin1 | Abcam | Parietal epitel hücre belirteci (kullanılan konsantrasyon: 1:100) | |
| tavşan-anti-SSeCKS | Roswell Park Kapsamlı Kanser Merkezi, Buffalo, NY, ABD | nazikçe Dr. E. Gelman, Parietal epitel hücre belirteci | |
| sıçan-anti-CD44 | BD Pharmingen | tarafından sağlanmıştır Parietal epitel hücre belirteci (kullanılan konsantrasyon 1:200) | |
| neşter | Dahlhausen | boyut 10 | |
| Elekler ve nbsp; | Endecotts Ltd | boyut 300 ve mikro; M, 75 ve Mikro; M, 53 ve Mikro; m, çelik | |
| şırınga | BD Plastipak | boyutu: 20 ml | |
| Ultra Düşük Bağlantılı Mikroplakalar | Corning Costar | 6 oyuklu plakalar |
Kaynaklar
- Fatima, H., et al. Parietal epithelial cell activation marker in early recurrence of FSGS in the transplant. Clinical journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 7 (11), 1852-1858 (2012).
- Dijkman, H. B., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
