Bu makalede, fare böbreği izole kapsüllü glomeruli glomeruli glomerual hücre outgrowths kültürve analiz için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem parietal epitel hücre çoğalması ve göç ile ilgili yolları incelemek için kullanılabilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Parietal Epitel Hücre Aktivasyonunda Yer Alan Yolları Analiz Etmek Için Ex Vivo Analizi olarak Glomerüler Büyüme
Bu makalede
Özet
Özet
Parietal epitel hücre (PEC) aktivasyonu glomerülosklerozun gelişimi ve ilerlemesinde rol oynayan önemli faktörlerden biridir. Parietal epitel hücre aktivasyonunda yer alan yolların inhibisyonu bu nedenle glomerüler hastalıkların ilerlemesini zayıflatmak için bir araç olabilir. Bu makalede, fare böbreği izole kapsüllü glomeruli parietal epitel hücre büyümesini analiz etmek ve kültür ve analiz etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. İzole fare böbrekleri kesildikten sonra doku doğrlanır ve glomeruli eeving tarafından izole edilir. Kapsüllü glomeruli toplanır ve parietal epitel hücreleringlomerüler outgrowth elde etmek için 6 gün boyunca tek glomeruli kültürlenir. Bu dönemde parietal epitel hücre çoğalması ve göç hücre sayısı veya büyüyen hücrelerin yüzey alanı belirlenerek analiz edilebilir. Bu nedenle bu tetki, değişmiş gen ekspresyonunun transgenik veya nakavt farelerdeki etkilerini veya kültür koşullarının parietal epitel hücre büyüme özellikleri ve sinyalizasyonu üzerindeki etkilerini incelemek için bir araç olarak kullanılabilir. Bu yöntem kullanılarak parietal epitel hücre aktivasyonu ve dolayısıyla glomerüloz sürecinde önemli yollar incelenebilir.
Giriş
Glomerüler hastalıklar böbrek hastalıklarının önemli bir grubudur ve son dönem böbrek hastalığının (ESRD) önemli bir nedenini temsil eder. Ne yazık ki, özel tedavi seçenekleri sınırlıdır ve ESRD ilerlemesi kaçınılmazdır. Glomerüler hastalıklar glomerüler yaralanma varlığı ile tanımlanır ve inflamatuar ve inflamatuar olmayan hastalıklarda gruplandırılabilir. İlk hakaret farklı olmasına rağmen, son çalışmalar da ortak bir hücresel mekanizma glomerüler epitel hücre hiperplazi yol açar ve sonuçta tüm glomerüler hastalıklarda glomerüskleroz yol göstermiştir, ne olursa olsun altta yatan neden1,2,3,4.
Özellikle glomerülülsikerotik lezyonların esas olarak aktive parietal epitel hücrelerinden oluştuğu gösterilmiştir5,6. Fizyolojik koşullar altında, parietal epitel hücreleri glomerulus Bowman kapsül hattı düz quiescent epitel hücreleridir. Ancak, genetik mutasyonlara bağlı glomerüler yaralanmalar (örn. podositspesifik veya mitokondriyal sitopatiler), inflamasyon veya hiperfiltrasyon (örn. böbrek kitlesinin azalması, hipertansiyon, obezite veya diyabetik mellitus nedeniyle) parietal epitel hücrelerinaktivasyonunu tetikleyebilir. Aktif parietal epitel hücreleri çoğalır ve hücre dışı matriks oluşumu ile sonuçlanan hücre dışı matriks mevduat5,7,8. Bu süreçlerin ilerlemesi böbrek fonksiyon kaybı ile sonuçlanır9. Bu nedenle parietal epitel hücre aktivasyonu hem inflamatuar hem de inflamatuar olmayan glomerüler hastalıklarda glomerülozun gelişiminde ve ilerlemesinde önemli bir faktördür1,2,3,4,10.
Parietal epitel hücre aktivasyonuna aracılık eden moleküler süreçler hala büyük ölçüde bilinmemektedir. Son çalışmalar, hücresel proliferasyon ve göçle ilgili farklı yolların aktivasyonu için önemli olan bir reseptör olan aktif parietal epitel hücrelerinin de novo express CD44 olduğunu göstermektedir. Ayrıca, CD44 inhibisyonu parietal epitel hücre aktivasyonunu inhibe etmek ve inflamatuar yanı sıra non-inflamatuar glomerüler hastalıkların hayvan modellerinde hilal oluşumu ve glomeruloskleroz ilerlemesini zayıflatmak gösterilmiştir11,12.
Parietal epitel hücre aktivasyonu glomerüloz ve hilal oluşumu gelişimi için önemli bir oyuncu olduğundan, bu hücrelerin inhibisyonu glomerüler hastalıkların ilerlemesini yavaşlatabilir. Parietal epitel hücre aktivasyonunu yönlendiren moleküler yolların açıklanması, glomerüler hastalıkta hiperplastik ve glomeruloscl lezyonlarının oluşumunu zayıflatan spesifik terapötik girişimlerin gelişmesine yol açabilir.
Deneysel hayvan modellerinde, parietal epitel hücreleri üzerinde değiştirilmiş gen ekspresyonu (nakavt modelleri veya transgenik fare modelleri) veya ilaç tedavisinin doğrudan etkisi için kanıt sağlamak sıklıkla zordur. Konvansiyonel bir nakavt farede in vivo değişiklikler gözlenen parietal epitel hücrelerinde doğrudan değişiklikler ile açıklanabilir. Ancak, gen ekspresyonu fareiçindeki diğer hücre türlerinde de değiştirildiği için, diğer hücre türleri tarafından aracılık edilen dolaylı etkileri dışlayamaz. Parietal epitel hücrelerinde ağırlıklı olarak aktif organizatörler tarafından tahrik koşullu cre-lox farelerin geliştirilmesi bazı durumlarda bir çözüm sağlamıştır13. Bununla birlikte, koşullu transgenik modeller karmaşıktır ve daha koşullu çizgiler kullanılabilir hale gelmesine rağmen, geleneksel nakavt veya transgenik fare hatlarının çoğu için henüz koşullu bir alternatif yoktur.
Parietal epitel hücreleri üzerindeki doğrudan etkileri incelemek için grubumuz parietal epitel hücre proliferasyonu ve göçlerini ölçmek ve analiz etmek için fare böbreklerinden izole edilmiş tek kapsüllü glomeruli kullanarak bir ex vivo tayini geliştirmiştir. Bu yöntem parietal epitel hücre spesifik etkilerini belirlememize ve parietal epitel hücre aktivasyonu ve bu aktivasyonu inhibe etmek için test tedavi seçenekleri için sorumlu yollar bulmamızı sağlayacaktır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm hayvan deneyleri Radboud Üniversitesi Nijmegen Hayvan Etik Komitesi yönergelerine göre yapılmıştır.
NOT: Tedavi edilmeyen, sağlıklı yabani tip (WT) fareler (n = 4) ve cd44-/- (n = 4) fareler 12−16 haftalıkken kurban edildi. Hem erkek hem de dişi fareler kullanıldı. Tüm fareler C57Bl/6 arka plan vardı.
1. Fare böbrek diseksiyonu
- Kurban sağlıklı WT fareler veya servikal dislokasyon tarafından genetik olarak değiştirilmiş fareler.
- Fareleri feda ettikten sonra farenin tüm böbreklerini doğrudan inceleyin. Bunun için, karın makas kullanarak bir median laparotomi gerçekleştirmek, cilt ve daha sonra karın kasları kesme. Bağırsağı çıkarın ve farenin yanına yerleştirin.
- Doku bağlayan böbrekler ücretsiz ve cerrahi forceps kullanarak böbrek çekin, makas ile böbrek arter, böbrek ven ve üreter kesme.
- Böbrekleri cerrahi forceps ile tutarak böbrek kapsüllerini çıkarın ve başka bir çift forceps kullanarak kapsülü çekin.
- Böbrekleri, Hanks'in dengeli tuz çözeltisinin (HBSS) 2 mL'si ile hazırlanan 6-iyi hücreli kültür plakası (2 böbrek/kuyu) yerleştirin ve buza yerleştirin.
2. Fare böbreğinden glomeruli izolasyonu
- Böbrekleri 100 mm Petri kabına aktarın ve iki neşter kullanarak böbrekleri 1−2 mm'lik küçük parçalara bölün. 1−2 mL HBSS kullanarak kıyılmış böbrek parçalarını ıslak tutun.
- Kıyılmış böbrek parçalarını 300 m'lik metal elek üzerine yerleştirin ve 20 mL'lik bir şırınganın bir pistonkullanarak böbreği elekten geçirin. Elek arasında HBSS ile tekrar tekrar durulayın ve serolojik bir pipet kullanarak temiz bir Petri kabında akışı toplayın. Neşterle kazıyarak elek alt tarafına kalan/yapışan her şeyi toplayın ve toplanan akışa (böbrek homojenate) aktarın.
- HBSS ile 75 μm elek ile homojen böbrek durular. Akış tantana layın ve daha sonra bu akışı 53 μm'lik bir elekten durulayın. Tüm küçük yapıları kaldırmak için HBSS kullanarak her iki elek yıkayın.
NOT: Bu adımda akış sadece durulanır ancak 75 μm ve 53 μm elekten geçirilir. HBSS ile yıkama, elekteki enkaz ve daha küçük yapıları gidermek için gereklidir. Bu nedenle normalde toplam 200−300 mL HBSS kullanılır. - 75 μm ve 53 m eleküzerinde kalan böbrek yapılarını/malzemesini, %20 fetal baldır serumu (FCS) ile desteklenen Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamı (DMEM) ile eleklerin üst yüzeyini yıkayarak toplayın ve malzemeyi 6-iyi ultra-düşük ek mikroplakaya aktarın.
NOT: Elek üst yüzeyini yıkamak için eleği eğik bir pozisyonda (>45°) durulayın ve elek kenarında böbrek malzemesini toplayın. Toplanan malzeme kapsüllü yanı sıra decapsulated glomeruli için zenginleştirilmiş, sadece birkaç boru parçaları gösteren. Kapsüllü glomeruli çok yapışkan. Tek glomeruli toplamak için, bu nedenle glomeruli bir Petri çanak veya iyi plaka yüzeyine uymak önlemek için önemlidir. Yapışmayı önlemek için % 20 FCS ile orta kullanın ve bu adım için ultra düşük ek plakaları kullanın.
3. Glomerüler büyümenin culturing
- Ultra düşük eki mikroplakayı ters ışık mikroskobuna getirin ve 20 μL pipetle tek kapsüllü ve/veya decapsulated glomeruli toplayın. Diğer yapıları ve enkaz borulama kaçının. Pipet ucunda tek bir glomerulus topladıktan sonra, aynı pipet ucuna 20 μL'lik bir hacme böbrek malzemesi toplamadan taze DMEM ortamı ekleyin.
- Glomerulusun kuyunun merkezine bağlanmasıiçin 20°L DMEM ortamına sahip tek glomerülü 24 kuyulu hücre kültür plakasının ortasına aktarın ve 37 °C'de 3 saat ve %5 (v/v) CO2'de kuluçkaya yatırın. Glomerulusun kuyunun yatılılarına sıçramasını önlemek için plakayı dikkatlice hareket ettirin.
- 3 saat kuluçkadan sonra glomerulus kuyunun merkezine bağlanır. Dikkatle hidrokortizon içeren bir büyüme faktörü kiti ile desteklenen endotel bazal orta (EBM) 500 μL ekleyin, insan endotel büyüme faktörü, sığır beyin ekstresi ve gentamicin sülfat-amphotericin B (Malzeme Tablosu) ve ek 5% (v / v) FBS ve 1% (v / v) penisilin / streptomisin (kalem / streprep) her iyi.
- Kültür tek glomeruli için 6 gün için 37 °C, 5% (v /v) CO2.
NOT: 6 gün içinde parietal epitel hücrelerinden oluşan büyüme oluşur. Belirli bileşiklerin veya ilaçların parietal epitel hücreleri üzerindeki etkilerini test etmeyi amaçlıyorsa, bu altı günlük süre içinde ortama eklenmelidir.
4. Parietal epitel hücre proliferasyonunun analizi
- 6 gün sonra glomerüler büyümeyi analiz edin. Dijital ters ışık mikroskobu kullanarak mikroskobik görüntüler alın.
- Yüzey alanını ve glomerüler büyümenin çapını ve büyüyen hücrelerin sayısını veya büyüyen glomerül sayısını belirlemek için bir görüntü analizi yazılımı (örneğin, ImageJ/FIJI) kullanın.
- Glomerüler büyümenin yüzey alanını belirlemek için tif'i açın. ImageJ ölçek çubuğu ile glomerüler outgrowth dosyası. Ölçek çubuğuna düz bir çizgi çizin ve analiz ve ölçme (örneğin, 1 mm = 460 piksel) tıklayarak pikselmesafesini belirleyin.
- Analiz etıklayarak ölçeği belirleyin, ölçeği ayarlayın ve bilinen mesafeyi piksele yazın (örn. 460), bilinen mesafeyi (örn. 1) ve uzunluk birimini (örn. 1 mm) yazın. Tamam'ıtıklatın.
- Analiz e tıklayarak sonuç tablosunda hangi sonuçların görüneceğini belirleyin ve ölçümleri ayarlayın. Glomerüler büyümenin yüzey alanını belirlemek için seçenekler alanını etkinleştirin ve etiketi görüntüleyin. Tamam'ıtıklatın.
- Glomerüler büyüme yüzey alanını belirlemek için, glomerüler büyüme etrafında bir serbest seçim çizin. Analiz ve sonra ölçmek tıklayın, bir sonuç tablosu ImageJ önceki belirlenen ölçekte outgrowth yüzey alanını gösteren açılır (adım 4.4, örneğin, mm2bakınız).
5. Glomerüler hücre büyümesinin karakterizasyonu
NOT: Büyümenin hücresel bileşimini değerlendirmek için, hücreye özgü belirteçler için immünororesans boyama t = 6 gün glomerüler çıkıntılar üzerinde yapılır.
- Dikkatle orta çıkarın ve yavaşça fosfat tamponlu salin (PBS) kullanarak iki kez glomeruli yıkayın.
- PBS'de %4 (w/v) sakaroz ile takviye edilen %2 (w/v) paraformaldehit (PFA) kullanarak oda sıcaklığında 10 dakika boyunca sabitlein ve PBS kullanarak 2 kat dikkatlice yıkayın.
- Uygun konsantrasyonda birincil antikor(Malzeme Tablosu)ile inkübatPBS-ovine serum albumin (BSA) 1% (v/v) oda sıcaklığında 1 saat seyreltilmiş.
- Antikor solüsyonu çıkarın ve PBS ile 3x dikkatlice yıkayın.
- Oda sıcaklığında 45 dakika boyunca karanlıkta PBS-BSA%1 (v/v) seyreltilmiş ikincil antikor(Malzeme Tablosu)ile kuluçka.
- Dikkatle PBS ile 3x yıkayın ve 4 ile sulu montaj orta 1−2 damla kullanarak monte,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) çekirdekleri görselleştirmek ve yuvarlak bir kapak kayma ile kuyu kapağı.
- Floresan mikroskop kullanarak mikroskobik görüntüler alın.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Glomerüler büyüme çıktısını gerçekleştirmek için yöntemin sistematik bir diyagramı Şekil 1'degösterilmiştir. Şekil 2A-D, ışık mikroskobu kullanılarak gözlenen farklı zaman noktalarında kapsüllü glomeruli glomerüler çıkıntıları göstermektedir. Büyümeler fare böbreğiglomerulus izolasyonundan sonra kültürde 2, 4 ve 6(Şekil 2B-D)gün lerinde gösterilmiştir. Büyüyen hücrel...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu makalede açıklanan protokolü kullanarak, parietal epitel hücre aktivasyonunun bir sonucu olan parietal epitel hücre proliferasyonunu değerlendirmek için tek kapsüllü glomeruli kullanabilirsiniz. Bu ex vivo modeli, parietal epitel hücre aktivasyonunda rol oynayan moleküler yolları ayrıntılı olarak incelememizi sağlayacaktır. Açıklanan yöntem, glomeruli kapsüllü glomeruli izole etmek ve kültür ve farklı deneysel koşullar altında parietal epitel hücrelerinin çoğalması ve / veya göç karşılaştırmak için böbrek diseksiyonu ...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Bu araştırma Hollanda Böbrek Vakfı (grant 14A3D104) ve Hollanda Bilimsel Araştırma Örgütü (NWO VIDI hibe: 016.156.363) tarafından desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 24 oyuklu hücre kültürü plakası | Corning Costar | ||
| anti-CD31 | BD Pharmingen | Endotel hücre belirteci (kullanılan konsantrasyon 1:200) | |
| tavuk-sıçan önleyici Alexa 647 | Thermo Fisher | ( kullanılan konsantrasyon 1:200) | |
| DAPI-Fluoromount G | Southern Biotech | DAPI | |
| Dijital ters çevrilmiş ışık mikroskobu | Westburg, EVOS fl mikroskobu | ||
| eşek-anti-keçi Alexa 568 | Thermo Fisher | ( kullanılan konsantrasyon 1:200) | |
| eşek-anti-tavşan Alexa 568 | Thermo Fisher | ( kullanılan konsantrasyon 1:200) | |
| Dulbecco'nun Modifiye Kartal ortamı | Lonza | ||
| EBM Orta | Lonza | ||
| EBM-MV Tek Quots kiti | Lonza | hidrokortizon, hEGF, GA-1000, FBS ve BBE | |
| içeren Fetal Sığır Serumu | Lonza | ||
| Fetal Buzağı Serumu | Lonza | ||
| Floresan mikroskobu | Leica Microsystems GmbH | ||
| keçi-anti-sinaptopodin, | Santa Cruz | Podosit işaretleyici (kullanılan konsantrasyon 1:200) | |
| Hanks'Dengeli Tuz Çözeltisi | Gibco | ||
| ImageJ yazılımı | FIJI 1.51n | ||
| petri kabı | Sarstedt | boyutu: 100 | |
| tavşan-anti-claudin1 | Abcam | Parietal epitel hücre belirteci (kullanılan konsantrasyon: 1:100) | |
| tavşan-anti-SSeCKS | Roswell Park Kapsamlı Kanser Merkezi, Buffalo, NY, ABD | nazikçe Dr. E. Gelman, Parietal epitel hücre belirteci | |
| sıçan-anti-CD44 | BD Pharmingen | tarafından sağlanmıştır Parietal epitel hücre belirteci (kullanılan konsantrasyon 1:200) | |
| neşter | Dahlhausen | boyut 10 | |
| Elekler ve nbsp; | Endecotts Ltd | boyut 300 ve mikro; M, 75 ve Mikro; M, 53 ve Mikro; m, çelik | |
| şırınga | BD Plastipak | boyutu: 20 ml | |
| Ultra Düşük Bağlantılı Mikroplakalar | Corning Costar | 6 oyuklu plakalar |
Kaynaklar
- Fatima, H., et al. Parietal epithelial cell activation marker in early recurrence of FSGS in the transplant. Clinical journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 7 (11), 1852-1858 (2012).
- Dijkman, H. B., et al. Proliferating cells in HIV and pamidronate-associated collapsing focal segmental glomerulosclerosis are parietal epithelial cells. Kidney International. 70 (2), 338-344 (2006).
- Kuppe, C., et al. Common histological patterns in glomerular epithelial cells in secondary focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 88 (5), 990-998 (2015).
- Dijkman, H., Smeets, B., van der Laak, J., Steenbergen, E., Wetzels, J. The parietal epithelial cell is crucially involved in human idiopathic focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 68 (4), 1562-1572 (2005).
- Smeets, B., et al. Parietal epithelial cells participate in the formation of sclerotic lesions in focal segmental glomerulosclerosis. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 22 (7), 1262-1274 (2011).
- Smeets, B., et al. Tracing the origin of glomerular extracapillary lesions from parietal epithelial cells. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (12), 2604-2615 (2009).
- Smeets, B., Moeller, M. J. Parietal epithelial cells and podocytes in glomerular diseases. Seminars in Nephrology. 32 (4), 357-367 (2012).
- Ryu, M., et al. Plasma leakage through glomerular basement membrane ruptures triggers the proliferation of parietal epithelial cells and crescent formation in non-inflammatory glomerular injury. The Journal of Pathology. 228 (4), 482-494 (2012).
- Eymael, J., Smeets, B. Origin and fate of the regenerating cells of the kidney. European Journal of Pharmacology. 790, 62-73 (2016).
- Smeets, B., et al. Renal progenitor cells contribute to hyperplastic lesions of podocytopathies and crescentic glomerulonephritis. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (12), 2593-2603 (2009).
- Eymael, J., et al. CD44 is required for the pathogenesis of experimental crescentic glomerulonephritis and collapsing focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 93 (3), 626-642 (2018).
- Roeder, S. S., et al. Activated ERK1/2 increases CD44 in glomerular parietal epithelial cells leading to matrix expansion. Kidney International. 91 (4), 896-913 (2017).
- Appel, D., et al. Recruitment of podocytes from glomerular parietal epithelial cells. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (2), 333-343 (2009).
- Yaoita, E., et al. Visceral epithelial cells in rat glomerular cell culture. European Journal of Cell Biology. 67 (2), 136-144 (1995).
- Kuppe, C., et al. Investigations of Glucocorticoid Action in GN. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 28 (5), 1408-1420 (2017).
- Ohse, T., et al. Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 19 (10), 1879-1890 (2008).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
