Yöntem makalesi

Ters Faz Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi Ile Hücresiz Protein Sentezmetabolizmasının Mutlak Niceliği

DOI:

10.3791/60329

⸱

25 Ekim 2019

 ,  ,  ,  , 
1Robert Frederick Smith School of Chemical and Biomolecular Engineering, Cornell University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, hücre siz protein sentezi reaksiyonlarında merkezi karbon ve enerji metabolizmasında yer alan 40 bileşiği ölçmek için sağlam bir protokol salıyoruz. Hücresiz sentez karışımı ters fazlı sıvı kromatografi kullanılarak etkili ayrıştırma için anilin ile türevize edilir ve daha sonra izotopik olarak etiketlenmiş iç standartlar kullanılarak kütle spektrometresi ile ölçülür.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücresiz protein sentezi (CFPS), proteinlerin in vitro üretimi için sistemlerde ve sentetik biyolojide gelişen bir teknolojidir. Ancak, CFPS laboratuvar ötesine taşımak ve sadece zaman üretim teknolojisi yaygın ve standart haline gidiyor, biz bu sistemlerin performans sınırlarını anlamak gerekir. Bu soruya doğru, glikoliz, pentoz fosfat yolu, trikarboksilik asit döngüsü, enerji metabolizması ve CFPS reaksiyonlarında kofaktör rejenerasyonu ile ilgili 40 bileşiğin ölçülmesi için sağlam bir protokol geliştirdik. Yöntem, 13C-aniline ile etiketlenmiş dahili standartları kullanırken, örnekteki bileşikler 12C-aniline ile türevleştirilmiştir. İç standartlar ve örnek, ters fazlı sıvı kromatografi-kütle spektrometresi (LC/MS) ile karıştırılarak analiz edildi. Bileşiklerin birlikte elüsyonu iyon bastırma ortadan kaldırarak, ortalama korelasyon katsayısının 0.988 olduğu 2-3 büyüklük sırası üzerinde metabolit konsantrasyonlarının doğru nicelemesini sağladı. Kırk bileşiğin beşi anilin ile etiketlenmemiş, ancak CFPS örneğinde hala tespit edilmiş ve standart bir eğri yöntemi ile ölçüldü. Kromatografik koşunun tamamlanması yaklaşık 10 dakika sürer. Birlikte ele alındığında, tek bir LC/MS çalışmasında CFPS'de yer alan 40 bileşimi ayırmak ve doğru bir şekilde ölçmek için hızlı ve sağlam bir yöntem geliştirdik. Bu yöntem, hücresiz metabolizmayı karakterize etmek için kapsamlı ve doğru bir yaklaşımdır, böylece hücresiz sistemlerin verimini, üretkenliğini ve enerji verimliliğini anlayabilir ve geliştirebiliriz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre içermeyen protein sentezi (CFPS), geleneksel olarak canlı hücreler için ayrılmış bir uygulama olan protein ve kimyasalların üretimi için umut verici bir platformdur. Hücre içermeyen sistemler ham hücre özlerinden türetilmiştir ve hücre büyümesi ile ilişkili komplikasyonları ortadan kaldırır1. Buna ek olarak, CFPS bir hücre duvarının müdahalesi olmadan metabolitleri ve biyosentetik makine doğrudan erişim sağlar. Ancak, hücresiz süreçlerin performans limitleri temel bir anlayış eksik olmuştur. Metabolit nicelliği için yüksek iş yapma yöntemleri metabolizmanın karakterizasyonu için değerlidir ve metabolik hesaplamalı modellerin2,3,4'ünyapımı için çok önemlidir. Metabolit konsantrasyonlarını belirlemek için kullanılan yaygın yöntemler nükleer manyetik rezonans (NMR), Fourier transform-kızılötesi spektroskopi (FT-IR), enzim bazlı tahliller ve kütle spektrometresi (MS)5,6,7 ,8. Ancak, bu yöntemler genellikle verimli bir kerede birden fazla bileşikleri ölçmek için onların yetersizlik ile sınırlıdır ve genellikle tipik hücre içermeyen reaksiyonlar daha büyük bir örnek boyutu gerektirir. Örneğin, enzim bazlı tahliller genellikle yalnızca bir çalışmada tek bir bileşiği ölçmek için kullanılabilir ve hücre içermeyen protein sentezreaksiyonları (genellikle 10-15 μL ölçekte çalıştırılır) gibi örnek boyutu küçük olduğunda sınırlıdır. Bu arada, NMR algılama ve nicelleştirme5için metabolitlerin yüksek bir bolluk gerektirir.  Bu eksikliklere doğru, kütle spektrometresi (LC/MS) ile birlikte kromatografi yöntemleri, yüksek duyarlılık ve aynı anda birden fazla türü ölçme yeteneği de dahil olmak üzere çeşitli avantajlar sağlar9; ancak, analitik karmaşıklık ölçülen türlerin sayısı ve çeşitliliği ile önemli ölçüde artmaktadır. Bu nedenle, LC/MS sistemlerinin yüksek iş verme potansiyelini tam olarak gerçekleştirecek yöntemler geliştirmek önemlidir. Numunedeki bileşikler sıvı kromatografi ile ayrılır ve kütle spektrometresi ile tanımlanır. Bileşiğin sinyali, iyonlaşmanın bileşikler arasında değişebileceği ve aynı zamanda numune matrisine de bağlı olabileceği konsantrasyon ve iyonizasyon verimliliğine bağlıdır.

Analizleri ölçmek için LC/MS kullanırken örnek ve standartlar arasında aynı iyonizasyon verimliliğini sağlamak zordur. Ayrıca, proton afinite ve polarite10sinyal bölünmesi ve heterojenite nedeniyle metabolit çeşitliliği ile nicel daha zor hale gelir. Son olarak, numunenin eş-eluting matris de bileşiklerin iyonizasyon verimliliğini etkileyebilir. Bu sorunları gidermek için, metabolitler kimyasal olarak türevlenebilir, LC/MS sistemleri tarafından ayırma çözünürlüğü ve hassasiyeti artırılarak, bazı durumlarda sinyal bölünmesi aynı anda azalırken10,11. Kimyasal türevleştirme, iyonizasyon verimliliğini artırmak için yük veya hidrofobiklik gibi fiziksel özelliklerini ayarlamak için belirli işlevsel metabolit gruplarını etiketleyerek çalışır11. Farklı fonksiyonel grupları (örneğin, aminler, hidroksiller, fosfatlar, karboksilik asitler vb.) hedeflemek için çeşitli etiketleme ajanları kullanılabilir. Anilin, böyle bir tür türtürasyon ajan, aynı anda birden fazla fonksiyonel grupları hedefler ve hidrofilik moleküller içine bir hidrofobik bileşen ekler, bu nedenle onların ayırma çözünürlüğü ve sinyal12artırarak. Birlikte eluting matris iyon bastırma etkisi ele almak için, Yang ve iş arkadaşları standart 13C anilin izotopları ile etiketlenir ve örnek ile karıştırılır Grup Özel İç Standart Teknolojisi (GSIST) etiketleme dayalı bir teknik geliştirdi 12,13. Metabolit ve buna karşılık gelen iç standart, birlikte elute beri aynı iyonlaşma verimliliğine sahip, ve onların yoğunluk oranı deneysel örnek konsantrasyonu ölçmek için kullanılabilir.

Bu çalışmada, CFPS reaksiyonlarında glikoliz, pentoz fosfat yolu, trikarboksilik asit döngüsü, enerji metabolizması ve kofaktör rejenerasyonu ile ilgili 40 bileşiğin saptanması ve ölçülmesi için bir protokol geliştirdik. Yöntem, ters fazLC/MS kullanarak metabolitleri etiketlemek, tespit etmek ve ölçmek için 12C-aniline ve 13C-aniline kullandığımız GSIST yaklaşımına dayanmaktadır. Tüm bileşiklerin doğrusal aralığı 0,988 ortalama korelasyon katsayısı ile 2-3 büyüklük sırasını kapsıyordu. Böylece, yöntem hücresiz metabolizma sorgulamak için sağlam ve doğru bir yaklaşımdır, ve muhtemelen bütün hücre özleri.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Aniline etiketleme için reaktiflerin hazırlanması

  1. pH 4.5'te 6 M aniline çözeltisi hazırlayın. Bir başlıkta çalışarak, 550 μL anilin il 337,5 l LCMS sınıfı su ve 112,5 μL 12 M hidroklorik asit (HCl) ile bir santrifüj tüpünde birleştirin. Girdap iyi ve 4 °C'de saklayın.
    NOT: Anilin 4 °C'de 2 ay saklanabilir.
    DİkKAT: Anilin son derece zehirlidir ve duman kaputunda çalışılmalıdır. Hidroklorik asit son derece aşındırıcıdır.
  2. pH 4.5'te 6 M 13C aniline çözeltisi hazırlayın. 250 mg 13C6-aniline 132 μL su ve 44 μL 12 M HCl. Vortex iyi ve 4 °C'de saklayın.
  3. Hazırlamak 200 mg/mL N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylkarbodiimid hidroklorür (EDC) çözeltisi. Etiketlenecek her numune için 10 μL suda 2 mg EDC çözünve girdap iyi.
    NOT: EDC çözeltisi reaksiyonla aynı gün hazırlanmalıdır. EDC anilin12ile bileşiklerin türevi için bir katalizör görevi görür.

2. Standartların hazırlanması

  1. LC/MS sınıfı suda çözünmüş tüm bileşiklerin ayrı stok çözeltilerini yapın(Tablo 1).
  2. Dahili standart stok çözeltisinin hazırlanması
    1. Nikotinamid adenin dinükleotid (NAD), nikotinamid adenin dinükleotid fosfat (NADP), flavin adenin dinükleotid (FAD), asetil koenzim A (ACA) ve gliserol 3 fosfat (Gly3P) hariç tüm bileşikleri tüm bileşiklerin 2 mM stok çözeltisi oluşturun.
  3. 2 mM'lik bir stok çözümü oluşturmak için NAD, NADP, FAD, ACA ve Gly3P'yi uygun hacimlerle birleştirin.

3. Numunenin hazırlanması (Şekil 1)

  1. Reaksiyona eşit hacimde buz soğuğu 0 etanol ekleyerek hücre içermeyen protein sentezreaksiyonundaki proteinleri söndürün ve çökeltin. Numuneyi 12.000 x g'de 15 dakika 4 °C'de santrifüj edin. Supernatant'ı yeni bir santrifüj tüpüne aktarın.
    NOT: Numuneler bu noktada -80 °C'de saklanabilir ve daha sonra analiz edilebilir

4. Etiketleme reaksiyonu

  1. Numuneyi 12C-aniline çözeltisi ile etiketleme
    1. 6 μL numuneyi yeni bir santrifüj tüpüne aktarın ve hacmi su yla birlikte 50°L'yegetirin.
      NOT: Birim örneklem boyutu belirli CFPS reaksiyonuna bağlı olabilir.
    2. 200 mg/mL EDC çözeltisi 5 μL ekleyin.
    3. 5 μL 12C-aniline çözeltisi ekleyin.
      NOT: Aniline çözeltisi iki aşamaya ayrılır. Reaksiyona eklemeden önce iyice karıştırın.
    4. Oda sıcaklığında 2 saat boyunca hafif sallayarak reaksiyon girdap.
    5. 2 saat sonra, çalkalayıcı tüpleri çıkarın ve bir duman kaputunda reaksiyona triethylammine (TEA) 1.5 μL ekleyin.
      NOT: Trietitamin anilin etiketleme reaksiyonunu durduran ve bileşikleri stabilize eden çözeltinin pH'ını yükseltir.
      DİkKAT: Trietitamin toksiktir ve gözlerde ve solunum yollarında tahrişe neden olur.
    6. Santrifüj 13.500 x g 3 dk.
  2. İç standartları 13C-aniline çözeltisi ile etiketleme
    1. Son hacmi 50 μL olan iç stok çözeltisini 80 μM'ye seyreltin.
      NOT: İç standartların konsantrasyonu deneysel örneğe yakın seviyelere ayarlanabilir.
    2. 200 mg/mL EDC çözeltisi 5 μL ekleyin.
    3. 5 μL 13C-aniline çözeltisi ekleyin.
    4. Oda sıcaklığında 2 saat boyunca hafif sallayarak reaksiyon girdap.
    5. 2 saat sonra, çalkalayıcı tüpleri çıkarın ve bir duman kaputunda reaksiyona TEA 1.5 μL ekleyin.
    6. Santrifüj 13.500 x g 3 dk.
  3. Etiketli dahili standardı ve etiketli örneği birleştirme
    1. 25 μL 12C-aniline etiketli numuneyi 25 μL 13C-aniline etiketli standartla karıştırın.
    2. Otomatik numune leyici şişeye aktarın ve LC/MS yordamı ile analiz edin.
  4. Etiketlenmemiş metabolitler için standart bir eğri oluşturma
    1. Etiketlenmemiş metabolitlerin (NAD, NADP, FAD, ACA ve Gly3P) 320 μM, 80 μM, 20 μM ve 5 μM'lik son konsantrasyonlara 50 μL hacimli seyreltilmiş stok çözeltisi.
    2. 200 mg/mL EDC çözeltisi 5 μL ekleyin.
    3. 5 μL 12C-aniline çözeltisi ekleyin.
    4. Oda sıcaklığında 2 saat boyunca hafif sallayarak reaksiyon girdap.
    5. 2 saat sonra, çalkalayıcı tüpleri çıkarın ve bir duman kaputunda reaksiyona TEA 1.5 μL ekleyin.
    6. Santrifüj 13.500 x g 3 dk.
    7. Supernatant'ı otomatik numuneleyici şişesine aktarın ve LC/MS yordamı ile analiz edin.
      NOT: Etiketsiz metabolitler, benzer iyonizasyon verimliliğini korumak için örnek matrisi çoğaltmak için örnekle aynı yordamı izlerler.

5. LC/MS prosedürünün kurulumu

  1. Çözücülerin hazırlanması
    1. Asetik asit ile pH 4.75'e ayarlanmış 5 mM tri-bülalamin (TBA) sulu çözelti hazırlayın.
      NOT: Mobil fazdaki TBA, analitlerin iyi çözünürlük ve ayırma elde edilmesine yardımcı olur14.
    2. Asetonitril (ACN) içinde 5 mM TBA hazırlayın.



    11. figure-protocol-1

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kavram kanıtı olarak, yeşil floresan proteini (GFP) ifade eden E. coli tabanlı CFPS sistemindeki metabolitleri ölçmek için protokolü kullandık.  CFPS reaksiyonu (14 μL) söndürüldü ve etanol ile deproteinize edildi. CFPS örneği daha sonra 12C-aniline ile etiketlenirken, standartlar 13C-aniline ile etiketlendi. Etiketlenen örnek ve standartlar daha sonra birleştirildi ve LC/MS'ye enjekte edildi (Şekil 1). Protokol, iç standartlar kullanılarak merkezi karbon ve en...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücresiz sistemlerin hücre duvarı yoktur, bu nedenle karmaşık numune hazırlamaya gerek kalmadan metabolitlere ve biyosentetik makinelere doğrudan erişim vardır. Ancak, hücreiçermeyen reaksiyon sistemlerini nicel olarak sorgulamak için kapsamlı ve sağlam protokoller geliştirmek için çok az çalışma yapılmıştır. Bu çalışmada, hücresiz reaksiyon karışımlarında ve potansiyel olarak tüm hücre ekstrelerinde metabolitleri ölçmek için hızlı ve sağlam bir yöntem geliştirdik. Hücreiçermeyen reaksiyonlarda veya tüm hücre özlerinde b...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Açıklanan çalışma, Ulusal Kanser Enstitüsü'nden (https://www.cancer.gov/) 1U54CA210184-01 ödül numarası ile Kanser Metabolizması Fiziği Merkezi tarafından desteklenmiştir. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Kanser Enstitüsü'nün veya Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmemektedir. Fon layıcıların çalışma tasarımı, veri toplama ve analiz, makalenin yayımlama kararı veya hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
12C AnilinSigma-Aldrich242284Anilin 12C
13C etiketli anilinSigma-Aldrich485797Anilin 13C6
3-Fosfogliserik asitSigma-AldrichP88773PG
Asetik AsitFisherScientificAC222140010ACE
Asetonitril, LCMSJT BAKER9829-03ACN
Asetil-koenzim A, Sigma-AldrichA2056ACA
Doğruluğu, UPLC, BEH, C18, 1.7 & mu; M, 2.1 x 150 mm KolonSuları186002353Kolon
Adenozin difosfatSigma-AldrichA2754ADP
Adenozin monofosfatSigma-AldrichA1752AMP
Adenozin trifosfatSigma-AldrichA2383ATP
Alfa-ketoglutaratSigma-AldrichK1128aKG
SitratSigma-Aldrich251275CIT
Sitidin difosfatSigma-AldrichC9755CDP
Sitidin monofosfatSigma-AldrichC1006CMP
Sitidin trifosfatSigma-AldrichC9274CTP
D-gliseraldehit 3-fosfatSigma-Aldrich39705GAP
Eritroz 4-fosfatSigma-AldrichE0377E4P
EtanolSigma-AldrichEX0276EtOH
Fisher Scientific accuSpin Micro 17 SantrifüjFisherScientificSantrifüj
Flavin adenin dinükleotidSigma-AldrichF6625FAD
Fruktoz 1,6-bifosfatSigma-AldrichF6803F16P
Fruktoz 6-fosfatSigma-AldrichF3627F6P
FumaratSigma-AldrichF8509FUM
Glukonat 6-fosfatSigma-AldrichP78776PG
GlikozSigma-AldrichG8270GLC
Glikoz 6-fosfatSigma-AldrichG7879G6P Gliserol
3-fosfatSigma-AldrichG7886Gly3P
Guanozin difosfatSigma-AldrichG7127GDP
Guanozin monofosfatSigma-AldrichG8377GMP
Guanozin trifosfatSigma-AldrichG8877GTP
Hidroklorik asitSigma-Aldrich258148HCl
İzositratSigma-AldrichI1252ICIT
LaktatSigma-AldrichL1750LAC
MalatSigma-Aldrich02288MAL
myTXTL - Sigma 70 Master Karışım KitiArborBiosciences507024Hücresiz protein sentezi
N- (3-dimetilaminopropil) -N ve prime;-etilkarbodiimid hidroklorürSigma-Aldrich03449EDC
Nikotinamid adenin dinükleotidSigma-Aldrich43410NAD
Nikotinamid adenin dinükleotid fosfatSigma-AldrichN5755NADP
Nikotinamid adenin dinükleotid fosfat indirgenmişSigma-Aldrich481973NADPH
Nikotinamid adenin dinükleotidi indirgenmişSigma-AldrichN8129NADH
OksalasetatSigma-AldrichO4126OAA
FosfoenolpiruvatSigma-AldrichP0564PEP
PirüvatSigma-AldrichP5280PYR
Riboz 5-fosfatSigma-AldrichR7750R5P
Ribuloz 5-fosfatCarboSynthMR45852RL5P
Sedoheptuloz 7-fosfatCarboSynthMS07457S7P
SüksinatSigma-AldrichS3674SUCC
TributylamineSigma-Aldrich90780TBA
TrietilaminFisherScientificO4884ÇAY
ultra saf suFisherScientific10977-015su
Üridin difosfatSigma-AldrichU4125UDP
Üridin monofosfatSigma-AldrichU6375UMP
Üridin trifosfatSigma-AldrichU6625UTP
VWR Ağır Hizmet Vorteks VWRVorteks
Su, LCMSJT BAKER9831-03SU
Suları Doğruluğu H UPLC Sınıfı Kuaterner Solvent YöneticisiSularLCMS
Sular Temin H UPLC Sınıfı Numune Yöneticisi FTNSularLCMS
Sular Acquity Qda dedektörüSularLCMS
Sular Güçlendirmek 3SuYazılımı
Sular LCMS Toplam Geri Kazanım FlakonSular186000384cLCMS Flakon
,

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: thinking outside the cell. Metabolic Engineering. 14, 261-269 (2012).
  2. Vilkhovoy, M., et al. Sequence specific modeling of E. coli cell-free protein synthesis. ACS Synthetic Biology. 7 (8), 1844-1857 (2018).
  3. Vilkhovoy, M., Minot, M., Varner, J. D. Effective dynamic models of metabolic networks. IEEE Life Sciences Letters. 2 (4), 51-54 (2016).
  4. Horvath, N., et al. Toward a genome scale sequence specific dynamic model of cell-free protein synthesis in Escherichia coli. bioRxiv. , 215012(2017).
  5. Dettmer, K., Aronov, P. A., Hammock, B. D. Mass spectrometry-based metabolomics. Mass spectrometry reviews. 26 (1), 51-78 (2007).
  6. Hajjaj, H., Blanc, P. J., Goma, G., François, J. Sampling techniques and comparative extraction procedures for quantitative determination of intra- and extracellular metabolites in filamentous fungi. FEMS Microbiology Letters. 164 (1), 195-200 (1998).
  7. Ruijter, G. J. G., Visser, J. Determination of intermediary metabolites in Aspergillus niger. Journal of Microbiological Methods. 25 (3), 295-302 (1996).
  8. Mailinger, W., Baltes, M., Theobald, U., Reuss, M., Rizzi, M. In vivo analysis of metabolic dynamics in Saccharomyces cerevisiae: I. Experimental observations. Biotechnology and Bioengineering. 55 (2), 305-316 (1997).
  9. Dunn, W. B., et al. Mass appeal: metabolite identification in mass spectrometry-focused untargeted metabolomics. Metabolomics. 9 (1), 44-66 (2013).
  10. Huang, T., Toro, M., Lee, R., Hui, D. S., Edwards, J. L. Multi-functional derivatization of amine, hydroxyl, and carboxylate groups for metabolomic investigations of human tissue by electrospray ionization mass spectrometry. Analyst. 143 (14), 3408-3414 (2018).
  11. Huang, T., Armbruster, M. R., Coulton, J. B., Edwards, J. L. Chemical Tagging in Mass Spectrometry for Systems Biology. Analytical Chemistry. 91 (1), 109-125 (2019).
  12. Yang, W. C., Sedlak, M., Regnier, F. E., Mosier, N., Ho, N., Adamec, J. Simultaneous quantification of metabolites involved in central carbon and energy metabolism using reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry and in vitro 13C labeling. Analytical Chemistry. 80 (24), 9508-9516 (2008).
  13. Jannasch, A., Sedlak, M., Adamec, J. Quantification of Pentose Phosphate Pathway (PPP) Metabolites by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS). Metabolic Profiling. Methods in Molecular Biology 708 (Methods and Protocols). Metz, T. O. , Humana Press. New York, NY. 159-171 (2011).
  14. Luo, B., Groenke, K., Takors, R., Wandrey, C., Oldiges, M. Simultaneous determination of multiple intracellular metabolites in glycolysis, pentose phosphate pathway, and tricarboxylic acid cycle by liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1147 (2), 153-164 (2007).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Metabolit KantifikasyonuTers Faz LC MSAnilin T revlendirmesiStandartlarMerkezi Karbon MetabolizmasEnerji MetabolizmasMetabolit Ayr mLC MS Analizi

İlgili makaleler