Home
JoVE Journal
Biochemistry
Ters Faz Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi Ile Hücresiz Protein Sentezmetabolizmasının Mutla...

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Research Article

Ters Faz Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi Ile Hücresiz Protein Sentezmetabolizmasının Mutlak Niceliği

DOI: 10.3791/60329

October 25, 2019

, , , ,

1Robert Frederick Smith School of Chemical and Biomolecular Engineering,Cornell University

Cite Watch Download PDF Download Material list
AI Banner

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

In This Article

Summary Abstract Introduction Protocol Representative Results Discussion Disclosures Acknowledgements Materials References Reprints and Permissions

Summary

Burada, hücre siz protein sentezi reaksiyonlarında merkezi karbon ve enerji metabolizmasında yer alan 40 bileşiği ölçmek için sağlam bir protokol salıyoruz. Hücresiz sentez karışımı ters fazlı sıvı kromatografi kullanılarak etkili ayrıştırma için anilin ile türevize edilir ve daha sonra izotopik olarak etiketlenmiş iç standartlar kullanılarak kütle spektrometresi ile ölçülür.

Abstract

Hücresiz protein sentezi (CFPS), proteinlerin in vitro üretimi için sistemlerde ve sentetik biyolojide gelişen bir teknolojidir. Ancak, CFPS laboratuvar ötesine taşımak ve sadece zaman üretim teknolojisi yaygın ve standart haline gidiyor, biz bu sistemlerin performans sınırlarını anlamak gerekir. Bu soruya doğru, glikoliz, pentoz fosfat yolu, trikarboksilik asit döngüsü, enerji metabolizması ve CFPS reaksiyonlarında kofaktör rejenerasyonu ile ilgili 40 bileşiğin ölçülmesi için sağlam bir protokol geliştirdik. Yöntem, 13C-aniline ile etiketlenmiş dahili standartları kullanırken, örnekteki bileşikler 12C-aniline ile türevleştirilmiştir. İç standartlar ve örnek, ters fazlı sıvı kromatografi-kütle spektrometresi (LC/MS) ile karıştırılarak analiz edildi. Bileşiklerin birlikte elüsyonu iyon bastırma ortadan kaldırarak, ortalama korelasyon katsayısının 0.988 olduğu 2-3 büyüklük sırası üzerinde metabolit konsantrasyonlarının doğru nicelemesini sağladı. Kırk bileşiğin beşi anilin ile etiketlenmemiş, ancak CFPS örneğinde hala tespit edilmiş ve standart bir eğri yöntemi ile ölçüldü. Kromatografik koşunun tamamlanması yaklaşık 10 dakika sürer. Birlikte ele alındığında, tek bir LC/MS çalışmasında CFPS'de yer alan 40 bileşimi ayırmak ve doğru bir şekilde ölçmek için hızlı ve sağlam bir yöntem geliştirdik. Bu yöntem, hücresiz metabolizmayı karakterize etmek için kapsamlı ve doğru bir yaklaşımdır, böylece hücresiz sistemlerin verimini, üretkenliğini ve enerji verimliliğini anlayabilir ve geliştirebiliriz.

Introduction

Hücre içermeyen protein sentezi (CFPS), geleneksel olarak canlı hücreler için ayrılmış bir uygulama olan protein ve kimyasalların üretimi için umut verici bir platformdur. Hücre içermeyen sistemler ham hücre özlerinden türetilmiştir ve hücre büyümesi ile ilişkili komplikasyonları ortadan kaldırır1. Buna ek olarak, CFPS bir hücre duvarının müdahalesi olmadan metabolitleri ve biyosentetik makine doğrudan erişim sağlar. Ancak, hücresiz süreçlerin performans limitleri temel bir anlayış eksik olmuştur. Metabolit nicelliği için yüksek iş yapma yöntemleri metabolizmanın karakterizasyonu için değerlidir ve metabolik hesaplamalı modellerin2,3,4'ünyapımı için çok önemlidir. Metabolit konsantrasyonlarını belirlemek için kullanılan yaygın yöntemler nükleer manyetik rezonans (NMR), Fourier transform-kızılötesi spektroskopi (FT-IR), enzim bazlı tahliller ve kütle spektrometresi (MS)5,6,7 ,8. Ancak, bu yöntemler genellikle verimli bir kerede birden fazla bileşikleri ölçmek için onların yetersizlik ile sınırlıdır ve genellikle tipik hücre içermeyen reaksiyonlar daha büyük bir örnek boyutu gerektirir. Örneğin, enzim bazlı tahliller genellikle yalnızca bir çalışmada tek bir bileşiği ölçmek için kullanılabilir ve hücre içermeyen protein sentezreaksiyonları (genellikle 10-15 μL ölçekte çalıştırılır) gibi örnek boyutu küçük olduğunda sınırlıdır. Bu arada, NMR algılama ve nicelleştirme5için metabolitlerin yüksek bir bolluk gerektirir.  Bu eksikliklere doğru, kütle spektrometresi (LC/MS) ile birlikte kromatografi yöntemleri, yüksek duyarlılık ve aynı anda birden fazla türü ölçme yeteneği de dahil olmak üzere çeşitli avantajlar sağlar9; ancak, analitik karmaşıklık ölçülen türlerin sayısı ve çeşitliliği ile önemli ölçüde artmaktadır. Bu nedenle, LC/MS sistemlerinin yüksek iş verme potansiyelini tam olarak gerçekleştirecek yöntemler geliştirmek önemlidir. Numunedeki bileşikler sıvı kromatografi ile ayrılır ve kütle spektrometresi ile tanımlanır. Bileşiğin sinyali, iyonlaşmanın bileşikler arasında değişebileceği ve aynı zamanda numune matrisine de bağlı olabileceği konsantrasyon ve iyonizasyon verimliliğine bağlıdır.

Analizleri ölçmek için LC/MS kullanırken örnek ve standartlar arasında aynı iyonizasyon verimliliğini sağlamak zordur. Ayrıca, proton afinite ve polarite10sinyal bölünmesi ve heterojenite nedeniyle metabolit çeşitliliği ile nicel daha zor hale gelir. Son olarak, numunenin eş-eluting matris de bileşiklerin iyonizasyon verimliliğini etkileyebilir. Bu sorunları gidermek için, metabolitler kimyasal olarak türevlenebilir, LC/MS sistemleri tarafından ayırma çözünürlüğü ve hassasiyeti artırılarak, bazı durumlarda sinyal bölünmesi aynı anda azalırken10,11. Kimyasal türevleştirme, iyonizasyon verimliliğini artırmak için yük veya hidrofobiklik gibi fiziksel özelliklerini ayarlamak için belirli işlevsel metabolit gruplarını etiketleyerek çalışır11. Farklı fonksiyonel grupları (örneğin, aminler, hidroksiller, fosfatlar, karboksilik asitler vb.) hedeflemek için çeşitli etiketleme ajanları kullanılabilir. Anilin, böyle bir tür türtürasyon ajan, aynı anda birden fazla fonksiyonel grupları hedefler ve hidrofilik moleküller içine bir hidrofobik bileşen ekler, bu nedenle onların ayırma çözünürlüğü ve sinyal12artırarak. Birlikte eluting matris iyon bastırma etkisi ele almak için, Yang ve iş arkadaşları standart 13C anilin izotopları ile etiketlenir ve örnek ile karıştırılır Grup Özel İç Standart Teknolojisi (GSIST) etiketleme dayalı bir teknik geliştirdi 12,13. Metabolit ve buna karşılık gelen iç standart, birlikte elute beri aynı iyonlaşma verimliliğine sahip, ve onların yoğunluk oranı deneysel örnek konsantrasyonu ölçmek için kullanılabilir.

Bu çalışmada, CFPS reaksiyonlarında glikoliz, pentoz fosfat yolu, trikarboksilik asit döngüsü, enerji metabolizması ve kofaktör rejenerasyonu ile ilgili 40 bileşiğin saptanması ve ölçülmesi için bir protokol geliştirdik. Yöntem, ters fazLC/MS kullanarak metabolitleri etiketlemek, tespit etmek ve ölçmek için 12C-aniline ve 13C-aniline kullandığımız GSIST yaklaşımına dayanmaktadır. Tüm bileşiklerin doğrusal aralığı 0,988 ortalama korelasyon katsayısı ile 2-3 büyüklük sırasını kapsıyordu. Böylece, yöntem hücresiz metabolizma sorgulamak için sağlam ve doğru bir yaklaşımdır, ve muhtemelen bütün hücre özleri.

Protocol

1. Aniline etiketleme için reaktiflerin hazırlanması

  1. pH 4.5'te 6 M aniline çözeltisi hazırlayın. Bir başlıkta çalışarak, 550 μL anilin il 337,5 l LCMS sınıfı su ve 112,5 μL 12 M hidroklorik asit (HCl) ile bir santrifüj tüpünde birleştirin. Girdap iyi ve 4 °C'de saklayın.
    NOT: Anilin 4 °C'de 2 ay saklanabilir.
    DİkKAT: Anilin son derece zehirlidir ve duman kaputunda çalışılmalıdır. Hidroklorik asit son derece aşındırıcıdır.
  2. pH 4.5'te 6 M 13C aniline çözeltisi hazırlayın. 250 mg 13C6-aniline 132 μL su ve 44 μL 12 M HCl. Vortex iyi ve 4 °C'de saklayın.
  3. Hazırlamak 200 mg/mL N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylkarbodiimid hidroklorür (EDC) çözeltisi. Etiketlenecek her numune için 10 μL suda 2 mg EDC çözünve girdap iyi.
    NOT: EDC çözeltisi reaksiyonla aynı gün hazırlanmalıdır. EDC anilin12ile bileşiklerin türevi için bir katalizör görevi görür.

2. Standartların hazırlanması

  1. LC/MS sınıfı suda çözünmüş tüm bileşiklerin ayrı stok çözeltilerini yapın(Tablo 1).
  2. Dahili standart stok çözeltisinin hazırlanması
    1. Nikotinamid adenin dinükleotid (NAD), nikotinamid adenin dinükleotid fosfat (NADP), flavin adenin dinükleotid (FAD), asetil koenzim A (ACA) ve gliserol 3 fosfat (Gly3P) hariç tüm bileşikleri tüm bileşiklerin 2 mM stok çözeltisi oluşturun.
  3. 2 mM'lik bir stok çözümü oluşturmak için NAD, NADP, FAD, ACA ve Gly3P'yi uygun hacimlerle birleştirin.

3. Numunenin hazırlanması (Şekil 1)

  1. Reaksiyona eşit hacimde buz soğuğu 0 etanol ekleyerek hücre içermeyen protein sentezreaksiyonundaki proteinleri söndürün ve çökeltin. Numuneyi 12.000 x g'de 15 dakika 4 °C'de santrifüj edin. Supernatant'ı yeni bir santrifüj tüpüne aktarın.
    NOT: Numuneler bu noktada -80 °C'de saklanabilir ve daha sonra analiz edilebilir

4. Etiketleme reaksiyonu

  1. Numuneyi 12C-aniline çözeltisi ile etiketleme
    1. 6 μL numuneyi yeni bir santrifüj tüpüne aktarın ve hacmi su yla birlikte 50°L'yegetirin.
      NOT: Birim örneklem boyutu belirli CFPS reaksiyonuna bağlı olabilir.
    2. 200 mg/mL EDC çözeltisi 5 μL ekleyin.
    3. 5 μL 12C-aniline çözeltisi ekleyin.
      NOT: Aniline çözeltisi iki aşamaya ayrılır. Reaksiyona eklemeden önce iyice karıştırın.
    4. Oda sıcaklığında 2 saat boyunca hafif sallayarak reaksiyon girdap.
    5. 2 saat sonra, çalkalayıcı tüpleri çıkarın ve bir duman kaputunda reaksiyona triethylammine (TEA) 1.5 μL ekleyin.
      NOT: Trietitamin anilin etiketleme reaksiyonunu durduran ve bileşikleri stabilize eden çözeltinin pH'ını yükseltir.
      DİkKAT: Trietitamin toksiktir ve gözlerde ve solunum yollarında tahrişe neden olur.
    6. Santrifüj 13.500 x g 3 dk.
  2. İç standartları 13C-aniline çözeltisi ile etiketleme
    1. Son hacmi 50 μL olan iç stok çözeltisini 80 μM'ye seyreltin.
      NOT: İç standartların konsantrasyonu deneysel örneğe yakın seviyelere ayarlanabilir.
    2. 200 mg/mL EDC çözeltisi 5 μL ekleyin.
    3. 5 μL 13C-aniline çözeltisi ekleyin.
    4. Oda sıcaklığında 2 saat boyunca hafif sallayarak reaksiyon girdap.
    5. 2 saat sonra, çalkalayıcı tüpleri çıkarın ve bir duman kaputunda reaksiyona TEA 1.5 μL ekleyin.
    6. Santrifüj 13.500 x g 3 dk.
  3. Etiketli dahili standardı ve etiketli örneği birleştirme
    1. 25 μL 12C-aniline etiketli numuneyi 25 μL 13C-aniline etiketli standartla karıştırın.
    2. Otomatik numune leyici şişeye aktarın ve LC/MS yordamı ile analiz edin.
  4. Etiketlenmemiş metabolitler için standart bir eğri oluşturma
    1. Etiketlenmemiş metabolitlerin (NAD, NADP, FAD, ACA ve Gly3P) 320 μM, 80 μM, 20 μM ve 5 μM'lik son konsantrasyonlara 50 μL hacimli seyreltilmiş stok çözeltisi.
    2. 200 mg/mL EDC çözeltisi 5 μL ekleyin.
    3. 5 μL 12C-aniline çözeltisi ekleyin.
    4. Oda sıcaklığında 2 saat boyunca hafif sallayarak reaksiyon girdap.
    5. 2 saat sonra, çalkalayıcı tüpleri çıkarın ve bir duman kaputunda reaksiyona TEA 1.5 μL ekleyin.
    6. Santrifüj 13.500 x g 3 dk.
    7. Supernatant'ı otomatik numuneleyici şişesine aktarın ve LC/MS yordamı ile analiz edin.
      NOT: Etiketsiz metabolitler, benzer iyonizasyon verimliliğini korumak için örnek matrisi çoğaltmak için örnekle aynı yordamı izlerler.

5. LC/MS prosedürünün kurulumu

  1. Çözücülerin hazırlanması
    1. Asetik asit ile pH 4.75'e ayarlanmış 5 mM tri-bülalamin (TBA) sulu çözelti hazırlayın.
      NOT: Mobil fazdaki TBA, analitlerin iyi çözünürlük ve ayırma elde edilmesine yardımcı olur14.
    2. Asetonitril (ACN) içinde 5 mM TBA hazırlayın.



    11. Equation 1

Representative Results

Kavram kanıtı olarak, yeşil floresan proteini (GFP) ifade eden E. coli tabanlı CFPS sistemindeki metabolitleri ölçmek için protokolü kullandık.  CFPS reaksiyonu (14 μL) söndürüldü ve etanol ile deproteinize edildi. CFPS örneği daha sonra 12C-aniline ile etiketlenirken, standartlar 13C-aniline ile etiketlendi. Etiketlenen örnek ve standartlar daha sonra birleştirildi ve LC/MS'ye enjekte edildi (Şekil 1). Protokol, iç standartlar kullanılarak merkezi karbon ve enerji metabolizmasında yer alan 40 metaboliti tespit ve ölçtü, anilin ile etiketlenmemiş metabolitlerin 5'i için standart bir eğri de geliştirilmiştir(Şekil 2). Bu yollarda yer alan çeşitli metabolitler fosforilasyonlu şekerler, fosfokarboksilik asitler, karboksilik asitler, nükleotitler ve kofaktörlerden oluşan bir sınıftı. Anilin ile türevleştirme ters faz kromatografi12kullanarak daha etkili ayırma kolaylaştırdı hidrofilik moleküller içine bir hidrofobik moiety tanıttı. Buna ek olarak, yöntem tek bir LC/MS çalışmasında glikoz 6-fosfat ve fruktoz 6-fosfat gibi yapısal izomer çiftlerin ayrılmasını sağladı. Deneyden önce her bileşiğin yük (m/z) üzerindeki kütlesi ve bekletme süresi, bir seferde bir bileşiğin 1 mM'si enjekte edilerek ve kütle spektrumunun boşla karşılaştırılması yla tespit edilmiştir(Tablo 1).

Tüm bileşikler için algılama ve doğrusallık aralığı, 0,10 μM ile 400 μM arasında değişen standart bir eğri üretilerek tahmin edilmiştir(Tablo 2). Tüm bileşikler için ortalama korelasyon katsayısı (R2)0.988 idi ve çoğu bileşik 3-büyüklük sırası doğrusal bir aralık vardı. Üç bileşiğin önemli doygunluk etkileri vardı, özellikle 0.1 μM ile 25 μM arasında doğrusal bir aralıkta olan alfa-ketoglutarate isocitrate ve sitrat da 100 μM'nin üzerinde doygunluk etkileri vardı.

Figure 1
Şekil 1: Aniline etiketleme için iş akışının şeması. Hücre içermeyen protein sentezreaksiyonu deproteinize edilir ve 12C-aniline ile etiketlenirken, standart bir stok karışımı 13C-aniline ile etiketlenir. Her iki karışım daha sonra 1:1 hacimsel oranda karıştırılır ve LC /MS tarafından analiz edilir.

Figure 2
Şekil 2: 40 metabolit için seçili iyon kromatogramları çakışıyor. 40 metabolitin 40 μM standart karışımının tek bir LC/MS çalışmasından kütle kromatogramı. Zirveler, her bileşik için bekletme süresi ve m/z değerleri ile tanımlanmıştır. Tam bileşik adlar ve bunların kısaltmaları Tablo 1'delistelenmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tepe Numarası Metabolit Kısaltma KEGG Kimliği Bekletme Süresi (dk) 12C m/z 13C m/z etiket dışı m/z Cv MS Türleri
1 Gliserol 3-fosfat Gly3P C00093 3.85 153 10 M – H2O – H
2 Nikotinamid adenin dinükleotid Nad C00003 3.96 698 10 M + Cl – H
3 Glikoz Glc C00031 4.06 289.9 296 15 M + A + Cl - H
4 Sedoheptulose 7-fosfat S7P C05382 5.41 364 370 10 M + A – H
5 Fruktoz 6-fosfat F6P C00085 5.48 334 340 10 M + A – H
6 Guanozin monofosfat Gmp C00144 5.57 437.05 443 10 M + A – H
7 Ribulose 5-fosfat RL5P C00199 5.58 304 310 10 M + A – H
8 Sitidin monofosfat CMP C00055 5.59 397.09 403 10 M + A – H
9 Laktat Lac C00186 5.77 164.05 170 10 M + A – H
10 Adenozin monofosfat Amp C00020 5.85 421.1 427.1 10 M + A – H
11 Uridine monofosfat Ump C00105 5.88 398.07 404 10 M + A – H
12 Nikotinamid adenin dinükleotid fosfat NADP C00006 6.39 724 10 M - H2O – H
13 3-Fosfoglisik asit 3PG C00197 6.63 242 248.06 15 M + A – H2O – H
14 Sitidin difosfat Cdp C00112 6.72 477 483 10 M + A – H
15 Guanozin difosfat Gsyih C00035 6.87 517 523 10 M + A – H
16 Adenozin difosfat Adp C00008 6.94 501 507 10 M + A – H
17 Uridin difosfat Udp C00015 6.97 478 484 10 M + A – H
18 Flavin adenin dinükleotid Fad C00016 7.03 784.15 15 M – H
19 Fruktoz 1,6-bifosfat F16P C05378 7.1 395.95 402.1 10 M + A – H2O – H
20 Glukonat 6-fosfat 6 PG C00345 7.11 425.1 437 10 M + 2A – H
21 Nikotinamid adenin dinükleotid azaltılmış NADH C00004 7.23 633.13 639.08 10 M + A + H2O – nikotinamid – H
22 Glikoz 6-fosfat G6P C00668 7.32 409.1 421.1 10 M + 2A – H
23 Riboz 5-fosfat R5P C00117 7.54 379.1 391.1 15 M + 2A – H
24 Erythrose 4-fosfat E4P C00279 7.71 348.9 361 10 M + 2A – H
25 Sitidin trifosfat CTP C00075 7.84 557 563 5 M + A – H
26 Guanozin trifosfat Gtp C00044 7.93 597 603 5 M + A – H
27 Oxalacetate OAA C00036 7.94 281 293 25 M + 2A – H
28 Alfa-ketoglutarate Akg C00026 7.95 295 307.1 15 M + 2A – H
29 Uridin trifosfat Utp C00075 7.97 558 564 10 M + A – H
30 Adenozin trifosfat Atp C00002 8.03 581 587 15 M + A – H
31 Fumarate FUM C00122 8.09 265 277.1 10 M + 2A – H
32 Piruvat Pyr C00022 8.09 162 168 25 M + A – H
33 Malate MAL C00149 8.09 283.06 295.15 10 M + 2A – H
34 D-gliserinaldehit 3-fosfat Boşluk C00118 8.09 319 331.1 5 M + 2A – H
35 Asetil-koenzim A Aca C00024 8.16 790 10 M – H2O – H
36 Nikotinamid adenin dinükleotid fosfat azaltılmış NADPH C00005 8.23 694.92 700.82 10 M + A – nikotinamid – H
37 Fosfoenolpyruvate Pep C00074 8.28 317 329.1 20 M + 2A – H
38 Succinate SUCC C00042 8.64 267.07 279.1 15 M + 2A – H
39 Isokitrat ICIT C00311 10.13 398 416 10 M + 3A – H2O – H
40 Sitrat Cıt C00158 10.46 416.1 434.06 20 M + 3A – H

Tablo 1: Metabolitlerin tanımlanması ve etiketleme sonuçları. Her bileşiğin karşılık gelen tepe numarası, bekletme süresi, etiketlenmemiş için m/z değeri, 12C ve 13C etiketli ve MS türleri. MS Species, A Aniline etiketi anlamına gelir.

Tepe No Metabolit Kısaltma KEGG Kimliği Konsantrasyon (mM) SD (n = 3) Algılama Sınırı (μM) Doğrusal Aralık Sınırı (μM) R^2
1 Gliserol 3-fosfat Gly3P C00093 0.377 0.034 0.1 400 0.995
2 Nikotinamid adenin dinükleotid Nad C00003 0.052 0.010 0.39 400 0.993
3 Glikoz Glc C00031 0.002 0.000 0.1 400 0.997
4 Sedoheptulose 7-fosfat S7P C05382 0.007 0.000 0.16 400 0.988
5 Fruktoz 6-fosfat F6P C00085 0.029 0.004 0.1 400 0.986
6 Guanozin monofosfat Gmp C00144 0.007 0.001 0.39 100 0.992
7 Ribulose 5-fosfat RL5P C00199 0.035 0.002 0.39 400 0.996
8 Sitidin monofosfat CMP C00055 0.045 0.001 0.1 100 0.992
9 Laktat Lac C00186 2.134 0.048 0.1 400 0.988
10 Adenozin monofosfat Amp C00020 0.020 0.002 0.1 100 0.992
11 Uridine monofosfat Ump C00105 0.021 0.000 0.1 100 0.997
12 Nikotinamid adenin dinükleotid fosfat NADP C00006 0.014 0.002 0.34 400 0.950
13 3-Fosfoglisik asit 3PG C00197 6.125 0.239 0.1 100 0.996
14 Sitidin difosfat Cdp C00112 0.202 0.029 0.39 400 0.997
15 Guanozin difosfat Gsyih C00035 0.146 0.027 1.5625 400 0.984
16 Adenozin difosfat Adp C00008 0.797 0.161 0.39 400 0.995
17 Uridin difosfat Udp C00015 0.212 0.036 0.39 400 0.991
18 Flavin adenin dinükleotid Fad C00016 0.008 0.001 0.1 400 0.958
19 Fruktoz 1,6-bifosfat F16P C05378 3.643 0.105 0.39 400 0.989
20 Glukonat 6-fosfat 6 PG C00345 0.017 0.001 0.39 400 0.989
21 Nikotinamid adenin dinükleotid azaltılmış NADH C00004 0.063 0.028 0.39 100 0.972
22 Glikoz 6-fosfat G6P C00668 0.046 0.002 0.1 400 0.984
23 Riboz 5-fosfat R5P C00117 0.055 0.005 0.39 100 0.999
24 Erythrose 4-fosfat E4P C00279 0.038 0.007 0.39 400 0.979
25 Sitidin trifosfat CTP C00075 0.896 0.078 6.25 100 0.998
26 Guanozin trifosfat Gtp C00044 0.870 0.109 6.25 100 0.993
27 Oxalacetate OAA C00036 0.023 0.008 0.56 400 0.997
28 Alfa-ketoglutarate Akg C00026 0.391 0.020 0.1 25 0.979
29 Uridin trifosfat Utp C00075 0.845 0.092 1.5625 400 0.998
30 Adenozin trifosfat Atp C00002 1.557 0.188 1.5625 400 0.991
31 Fumarate FUM C00122 0.576 0.100 1.5625 100 0.999
32 Piruvat Pyr C00022 5.813 0.804 0.39 400 0.993
33 Malate MAL C00149 2.548 0.269 0.1 400 0.991
34 D-gliserinaldehit 3-fosfat Boşluk C00118 2.194 0.367 0.1 100 0.974
35 Asetil-koenzim A Aca C00024 0.196 0.044 0.1 100 0.991
36 Nikotinamid adenin dinükleotid fosfat azaltılmış NADPH C00005 0.006 0.010 0.14 100 0.990
37 Fosfoenolpyruvate Pep C00074 3.442 0.345 0.1 100 0.962
38 Succinate SUCC C00042 5.683 0.573 0.1 320 0.999
39 Isokitrat ICIT C00311 0.003 0.006 0.39 100 0.998
40 Sitrat Cıt C00158 0.002 0.001 0.1 100 0.981

Tablo 2: Temsili cfps örneğinde metabolit nicelleştirme. Her metabolitin konsantrasyonu ve standart sapma. Algılama sınırı, doğrusallık aralığı ve standart eğrilerden tanımlanan korelasyon katsayısı.

Discussion

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Disclosures

Burada, hücre siz protein sentezi reaksiyonlarında merkezi karbon ve enerji metabolizmasında yer alan 40 bileşiği ölçmek için sağlam bir protokol salıyoruz. Hücresiz sentez karışımı ters fazlı sıvı kromatografi kullanılarak etkili ayrıştırma için anilin ile türevize edilir ve daha sonra izotopik olarak etiketlenmiş iç standartlar kullanılarak kütle spektrometresi ile ölçülür.

Acknowledgements

Açıklanan çalışma, Ulusal Kanser Enstitüsü'nden (https://www.cancer.gov/) 1U54CA210184-01 ödül numarası ile Kanser Metabolizması Fiziği Merkezi tarafından desteklenmiştir. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Kanser Enstitüsü'nün veya Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmemektedir. Fon layıcıların çalışma tasarımı, veri toplama ve analiz, makalenin yayımlama kararı veya hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.

Materials

,
12C AnilinSigma-Aldrich242284Anilin 12C
13C etiketli anilinSigma-Aldrich485797Anilin 13C6
3-Fosfogliserik asitSigma-AldrichP88773PG
Asetik AsitFisherScientificAC222140010ACE
Asetonitril, LCMSJT BAKER9829-03ACN
Asetil-koenzim A, Sigma-AldrichA2056ACA
Doğruluğu, UPLC, BEH, C18, 1.7 & mu; M, 2.1 x 150 mm KolonSuları186002353Kolon
Adenozin difosfatSigma-AldrichA2754ADP
Adenozin monofosfatSigma-AldrichA1752AMP
Adenozin trifosfatSigma-AldrichA2383ATP
Alfa-ketoglutaratSigma-AldrichK1128aKG
SitratSigma-Aldrich251275CIT
Sitidin difosfatSigma-AldrichC9755CDP
Sitidin monofosfatSigma-AldrichC1006CMP
Sitidin trifosfatSigma-AldrichC9274CTP
D-gliseraldehit 3-fosfatSigma-Aldrich39705GAP
Eritroz 4-fosfatSigma-AldrichE0377E4P
EtanolSigma-AldrichEX0276EtOH
Fisher Scientific accuSpin Micro 17 SantrifüjFisherScientificSantrifüj
Flavin adenin dinükleotidSigma-AldrichF6625FAD
Fruktoz 1,6-bifosfatSigma-AldrichF6803F16P
Fruktoz 6-fosfatSigma-AldrichF3627F6P
FumaratSigma-AldrichF8509FUM
Glukonat 6-fosfatSigma-AldrichP78776PG
GlikozSigma-AldrichG8270GLC
Glikoz 6-fosfatSigma-AldrichG7879G6P Gliserol
3-fosfatSigma-AldrichG7886Gly3P
Guanozin difosfatSigma-AldrichG7127GDP
Guanozin monofosfatSigma-AldrichG8377GMP
Guanozin trifosfatSigma-AldrichG8877GTP
Hidroklorik asitSigma-Aldrich258148HCl
İzositratSigma-AldrichI1252ICIT
LaktatSigma-AldrichL1750LAC
MalatSigma-Aldrich02288MAL
myTXTL - Sigma 70 Master Karışım KitiArborBiosciences507024Hücresiz protein sentezi
N- (3-dimetilaminopropil) -N ve prime;-etilkarbodiimid hidroklorürSigma-Aldrich03449EDC
Nikotinamid adenin dinükleotidSigma-Aldrich43410NAD
Nikotinamid adenin dinükleotid fosfatSigma-AldrichN5755NADP
Nikotinamid adenin dinükleotid fosfat indirgenmişSigma-Aldrich481973NADPH
Nikotinamid adenin dinükleotidi indirgenmişSigma-AldrichN8129NADH
OksalasetatSigma-AldrichO4126OAA
FosfoenolpiruvatSigma-AldrichP0564PEP
PirüvatSigma-AldrichP5280PYR
Riboz 5-fosfatSigma-AldrichR7750R5P
Ribuloz 5-fosfatCarboSynthMR45852RL5P
Sedoheptuloz 7-fosfatCarboSynthMS07457S7P
SüksinatSigma-AldrichS3674SUCC
TributylamineSigma-Aldrich90780TBA
TrietilaminFisherScientificO4884ÇAY
ultra saf suFisherScientific10977-015su
Üridin difosfatSigma-AldrichU4125UDP
Üridin monofosfatSigma-AldrichU6375UMP
Üridin trifosfatSigma-AldrichU6625UTP
VWR Ağır Hizmet Vorteks VWRVorteks
Su, LCMSJT BAKER9831-03SU
Suları Doğruluğu H UPLC Sınıfı Kuaterner Solvent YöneticisiSularLCMS
Sular Temin H UPLC Sınıfı Numune Yöneticisi FTNSularLCMS
Sular Acquity Qda dedektörüSularLCMS
Sular Güçlendirmek 3SuYazılımı
Sular LCMS Toplam Geri Kazanım FlakonSular186000384cLCMS Flakon

References

  1. Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: thinking outside the cell. Metabolic Engineering. 14, 261-269 (2012).
  2. Vilkhovoy, M., et al. Sequence specific modeling of E. coli cell-free protein synthesis. ACS Synthetic Biology. 7 (8), 1844-1857 (2018).
  3. Vilkhovoy, M., Minot, M., Varner, J. D. Effective dynamic models of metabolic networks. IEEE Life Sciences Letters. 2 (4), 51-54 (2016).
  4. Horvath, N., et al. Toward a genome scale sequence specific dynamic model of cell-free protein synthesis in Escherichia coli. bioRxiv. , 215012 (2017).
  5. Dettmer, K., Aronov, P. A., Hammock, B. D. Mass spectrometry-based metabolomics. Mass spectrometry reviews. 26 (1), 51-78 (2007).
  6. Hajjaj, H., Blanc, P. J., Goma, G., François, J. Sampling techniques and comparative extraction procedures for quantitative determination of intra- and extracellular metabolites in filamentous fungi. FEMS Microbiology Letters. 164 (1), 195-200 (1998).
  7. Ruijter, G. J. G., Visser, J. Determination of intermediary metabolites in Aspergillus niger. Journal of Microbiological Methods. 25 (3), 295-302 (1996).
  8. Mailinger, W., Baltes, M., Theobald, U., Reuss, M., Rizzi, M. In vivo analysis of metabolic dynamics in Saccharomyces cerevisiae: I. Experimental observations. Biotechnology and Bioengineering. 55 (2), 305-316 (1997).
  9. Dunn, W. B., et al. Mass appeal: metabolite identification in mass spectrometry-focused untargeted metabolomics. Metabolomics. 9 (1), 44-66 (2013).
  10. Huang, T., Toro, M., Lee, R., Hui, D. S., Edwards, J. L. Multi-functional derivatization of amine, hydroxyl, and carboxylate groups for metabolomic investigations of human tissue by electrospray ionization mass spectrometry. Analyst. 143 (14), 3408-3414 (2018).
  11. Huang, T., Armbruster, M. R., Coulton, J. B., Edwards, J. L. Chemical Tagging in Mass Spectrometry for Systems Biology. Analytical Chemistry. 91 (1), 109-125 (2019).
  12. Yang, W. C., Sedlak, M., Regnier, F. E., Mosier, N., Ho, N., Adamec, J. Simultaneous quantification of metabolites involved in central carbon and energy metabolism using reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry and in vitro 13C labeling. Analytical Chemistry. 80 (24), 9508-9516 (2008).
  13. Jannasch, A., Sedlak, M., Adamec, J., Metz, T. O. Quantification of Pentose Phosphate Pathway (PPP) Metabolites by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS). Metabolic Profiling. Methods in Molecular Biology 708 (Methods and Protocols). , 159-171 (2011).
  14. Luo, B., Groenke, K., Takors, R., Wandrey, C., Oldiges, M. Simultaneous determination of multiple intracellular metabolites in glycolysis, pentose phosphate pathway, and tricarboxylic acid cycle by liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1147 (2), 153-164 (2007).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request Permission

Play Video

Ters Faz Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi Ile Hücresiz Protein Sentezmetabolizmasının Mutlak Niceliği
Contact Us Recommend to Library
Research
Business
Education
Solutions
About JoVE
Others
Contact Us Recommend to Library
JoVE logo

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. All rights reserved

Privacy Terms of Use Policies