Organotipik dilim kültürleri nörogelişimsel veya dejeneratif /rejeneratif süreçleri incelemek için güçlü bir araçtır. Burada, fare serebellar dilim kültürlerde Purkinje hücrelerinin nörogelişimsel ölüm modelleri bir protokol açıklar. Bu yöntem nöroprotektif ilaç keşfinde araştırma yada yararlı olabilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Organotipik Serebellar Dilim Kültürlerde Purkinje Hücre Sağkalım
Bu makalede
Özet
Özet
Organotipik dilim kültürü, vivo koşullarda ayrışmış birincil hücre kültürlerinden daha yakından taklit eden güçlü bir in vitro modeldir. Erken doğum sonrası gelişiminde, serebellar Purkinje hücrelerinin programlanmış hücre ölümü sırasında savunmasız bir dönemden geçtiği bilinmektedir. Burada, bu kritik dönemde fare organotipik serebellar dilim kültürünü gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol salıyoruz. Dilimler purkinje hücre sağkalım ve nöroprotektif tedavilerin etkinliğini değerlendirmek için daha fazla etiketlenir. Bu yöntem yeni nöroaktif molekülleriçin ekran için son derece değerli olabilir.
Giriş
In vitro modelleme biyomedikal araştırmalarda önemli bir araçtır. Araştırmacıların kısıtlı hücre tiplerinde veya izole sistemlerde/organlarda belirli mekanizmaları incelemesine ve sıkı bir şekilde kontrol etmesine olanak tanır. Organotipik dilim kültürü özellikle nöroloji alanında in vitro tekniğinde yaygın olarak kullanılan bir kültürdür1. Yöntem ilk Gähwiler tarafından kuruldu, kim roller tüptekniği2 kullanarak beyin dilimleri kültürlü , ve daha sonra Yamamoto ve ark tarafından modifiye, kortikal dilim kültürleri gerçekleştirmek için mikrogözenekli membran kullanımı tanıttı3. Birincil hücre kült....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Hayvanlarla ilgili tüm deneyler Northwestern Üniversitesi Hayvan Araştırmaları komitesine uygun olarak yapılmıştır.
1. Organotipik serebellar dilim kültürleri öncesinde hazırlık
- Önceden %70 etanol püskürtülen bir hücre kültüründe, steril şişe alıcısına bağlı 250 mL şişe üstü vakum filtresinde 200 mL kültür ortamı hazırlayın. 100 mL Bazal Orta Kartal (BME), 50 mL Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS), 50 mL ısı yalıtımlı at serumu, 1 mL 200 mM L-Glutamin (son konsantrasyon 1 mM) ve 5 mL 200 g/L glukoz (son konsantrasyon 5 mg/mL) ekleyin. Kültür ortamını vakumla filtreleyin ve bir aya kadar +4 °C'de tutun.
- Sterilize edilmi....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Şekil 4'tegösterildiği gibi, bu protokol, purkinje hücre sağkalımının immünfloresans ve görüntü edinim adımlarından sonra değerlendirilebileceği organotipik serebellar dilim kültürleri üretmektedir. Purkinje hücreleri anti-Calbindin D-28K (seyreltme 1/200) ve Alexa594 anti-fare (seyreltme 1/300) antikorları kombinasyonu ile etiketlenmiştir. Görüntü dikiş otomatik olarak mikroskop satın alma yazılımı (NIS-Elements) tarafından tüm serebellar dilim bir resim elde etmek için yapıldı. Purkinje di.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Serebellar dilim kültürü, doğum sonrası gelişim sırasında programlanmış Purkinje hücre ölümünü incelemek için güçlü bir araçtır. Bu teknik, aday molekülleri nöroprotektif potansiyellerine göre hızla taramak için kullanılabilir. Ana avantajı kurulum basit ve çok uygun maliyetli olmasıdır, ve sadece ekipman mütevazı bir yatırım gerektirir (bir vibratom kadar mal olabilir 3 kat daha fazla bir doku helikopteri). Ayrıca, 10 ila 15 sağlıklı dilimler bir fare yavrusu ndan oluşturulabilir, böylece tek bir hayvan kullanılarak par.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Northwestern Üniversitesi İleri Mikroskopi Merkezi'nde NCI CCSG P30 CA060553 tarafından cömertçe desteklenen ve Robert H Lurie Kapsamlı Kanser Merkezi'ne verilen görüntüleme çalışmaları gerçekleştirildi. Biz sean McDermott onun teknik yardım ve destek için teşekkür ederim, ve Maya Epstein şekil 1gösterilen elle çizilmiş çizimler için .
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 594 Eşek anti-Fare IgG ikincil antikoru | ThermoFisher scientific | A21203 | |
| Bazal Orta Kartal (BME) | ThermoFisher bilimsel | 21010046 | |
| Biyogüvenlik kabini Sınıf II, Tip A2 | NuAire | NU-540-400 | |
| Sığır serum albümini | Millipore Sigma | A2153 | |
| Fırça | |||
| anti-Calbindin D-28K antikoru (CB-955) | Abcam | ab82812 | |
| CO2 İnkübatörü | NuAire | NU-5700 | |
| Corning Costar Düz Tabanlı 6 Kuyulu Hücre Kültürü Plakaları | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
| Lamel, 22 x 50 mm | Fisher Scientific | 12-545-E | |
| Pansuman forsepsleri, düz | Harvard Aparatı | 72-8949 | |
| Çift kenarlı bıçaklar | Fisher Scientific | 50949411 | |
| Ethanol 200 proof | Decon Labs, Inc | 2701 | |
| Göz Makası, düz | Harvard Aparatı | 72-8428 | |
| İnce forseps | Fisher Scientific | 16-100-127 | |
| L-Glutamin 100X | ThermoFisher bilimsel | 25030149 | |
| Glikoz çözeltisi | ThermoFisher bilimsel | A2494001 | |
| Hanks' Dengeli Tuz Çözeltisi | ThermoFisher scientific | 14025092 | |
| Hoechst 33342, Trihidroklorür, Trihidrat | Fisher Scientific | H21492 | |
| At Serumu, ısı ile etkisiz hale getirilmiş, Yeni Zelanda menşeili | ThermoFisher bilimsel | 26050088 | |
| ImageJ | |||
| McIlwain Doku Doğrayıcı | Fisher Scientific | NC9914528 | |
| Mikroproblar | Fisher Scientific | 08-850 | |
| Milicell Hücre Kültürü Uçları | Millipore Sigma | PICM0RG50 | |
| Nalgene Hızlı Akışlı PES Membranlı Steril Tek Kullanımlık Filtre Üniteleri, 250 mL | ThermoFisher scientific | 168-0045 | |
| Nikon A1R konfokal lazer mikroskop sistemi | Nikon | ||
| NIS-Elements Görüntüleme Yazılımı | Nikon | ||
| Paraformaldehit | Acros Organics | 41678-0010 | |
| Pastör pipetleri | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Potasyum Klorür | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| ProLong Altın Antifade Mountant | ThermoFisher scientific | P10144 | |
| Çalıştırma Makası, düz | Harvard Aparatı | 72-8403 | |
| Orbital çalkalayıcı Dansöz | IBI Scientific | BDRLS0003 | |
| Prizma 8 | GraphPad | ||
| Superfrost Plus Mikroskop Slaytları | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Doku Kültürü Kabı, 60 mm kavrama halkalı | Fisher Scientific | FB012921 | |
| Doku kültürü plakası, 24 kuyulu | Falcon / Corning | ||
| Transfer pipetleri, steril | ThermoFisher scientific | 13-711-21 | |
| Triton X-100 | ThermoFisher scientific | BP151-500 |
Kaynaklar
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Gahwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
