Demir sınırlı Mycobacteria tarafından üretilen Ekstrasellüler Veziküllerin İzolasyon ve Karakterizasyonu

Özet

Mycobacterium tuberculosis düşük demir koşullarına yanıt olarak ekstrasellüler üretimi ve salınımını gösterir. Bu çalışma, demir eksikliğine yanıt olarak salınan mikobakteriyel ekstrasellüler saflaştırma ve karakterizasyonu için düşük demir koşulları ve yöntemleri oluşturmak için bir protokol ayrıntıları.

Özet

Mikobakteriler, Mycobacterium tuberculosis de dahil olmak üzere (Mtb), insan tüberkülozunun nedensel ajan, doğal olarak immünolojik olarak aktif moleküller içeren ekstrasellüler veziküller (EVs) serbest. Vezikül biyogenezinin moleküler mekanizmaları, veziküllerin içeriği ve patojen-konak arabirimindeki fonksiyonları hakkında bilgi çok sınırlıdır. Bu soruların ele alınması, eVs'lerin yalıtımı, saflaştırılması ve doğrulanması için sıkı prosedürler gerektirir. Daha önce, M. tüberküloz demir kısıtlamasına maruz kaldığında vezikül üretiminin artırılmış olduğu bulunmuştur, ev sahibi ortamda Mtb'nin karşılaştığı bir durum. Burada sunulan demir eksikliği mikobakterilerden EVs izole etmek ve arındırmak için tam ve ayrıntılı bir protokoldür. Arındırılmış EVs doğrulamak için nicel ve nitel yöntemler uygulanır.

Giriş

Mikobakteriyel ekstrasellüler (MEV) membrana bağlı nano taneciklerdir, 60−300 nm boyutundadır, doğal olarak hızlı ve yavaş büyüyen mikobakteriler tarafından serbest bırakılır^1. Patojenik mikobakteriler tarafından salınan MEV'ler, immünolojik olarak aktif proteinler, lipidler ve konsantre ve korunan bir şekilde salgılanan glikolipidler aracılığıyla konakla etkileşimedebilen bir mekanizma oluşturur^2,3,4. MEVs karakterize etmek ve biyogenez ve işlevlerini anlamak için, vezikül arınma ve doğrulama sıkı ve verimli yöntemler çok önemlidir. Şimdiye kadar, MEVs bir demir açısından zengin orta^1,5,6,7,8yetiştirilen mikobakterilerin kültür filtrates izole edilmiştir.

Ancak, önceki çalışma demir sınırlama büyük ölçüde Mtb vezikül salınımını uyarır gösterdi, muhtemelen mycobactin üzerinden demir yakalamak için, MEVs salgılanan bir siderophore⁹. Yüksek demir ortamda yetiştirilen Mtb'lerden MEV izolasyonu prosedürleri tanımlanmış olsa da, düşük demir kültürlerinden MEV elde etmek için etkili bir metodoloji bildirilmemiştir. Bu nedenle, bu yöntemin amacı, biyokimyasal ve fonksiyonel tahliller ve mikobakterilerde vezikül üretiminin genetik belirleyicilerinin analizi için kullanılabilmesi için düşük demir kültürlerinden elde edilen MEV'leri izole etmek, arındırmak ve ölçmektir.

Protokol

1. Demir Tükenmiş Tanımlı Ortamın Hazırlanması

1. 5 g KH₂PO_4,5 g L-asparagin, 20 mL gliserol ve plastik bir kapta 900 mL deiyonize su da dekstroz 2 g dekstroz eriterek minimal orta (MM) 1 L hazırlayın. Demir kontaminasyonunu önlemek için camdan kaçının. PH'ı 5 N NaOH ile 6,8'e, hacmi ni suyla 1 L'ye ayarlayın.
2. 50 g metal şelin reşaden (MCR) ekleyin ve 4 °C'de 24 saat boyunca manyetik bir karıştırma çubuğu kullanarak hafifçe çalkalayın. Plastik alıcılı 0,22 μm filtre ünitesi nden sızma yoluyla MCR'yi sterilize edin ve çıkarın. Filtrasyonu hızlandırmak ve filtre tıkanmasını önlemek için, rezorbsün filtrasyondan önce yaklaşık 30 dakika boyunca tortulanmasına izin verin.
   NOT: Bu ortam, atomik absorpsiyon spektroskopisi ile belirlenen 2°M'den az demir içerir.
3. ZnCl 0.5 mg/L ile ek MM₂,_MgSO4 4 4 mg/L, mnSO₄0.1 mg/L . Ayrıca, deiyonize suda metal takviyeleri her konsantre stokları (1.000x) hazırlamak ve MM takviyesi önce filtrasyon ile sterilize. Demir-tükenmiş, metal takviyeli MM burada düşük demir MM (LIMM) olarak anılacaktır.
4. 10 mM HCl'de çözünmüş 50 mM'lik FeCl₃ stoğundan, yüksek demir MM (HIMM) hazırlamak için 1 mL ila 1 L LIMM (50 μM son konsantrasyon) ekleyin.

2. Demir Sınırlı Koşullarda Büyüyen Mikobakteriler

1. Mtb dondurulmuş% 15 gliserol stok 50 μL ve çizgi bir agar plaka% 10 ADN zenginleştirme ile desteklenmektedir (5 g / L albumin, 2 g / L dekstroz, ve 0.85 g / L sodyum klorür, 0.2% gliserol ve 0.05% Tween-80)¹⁰. Koloniler görünene kadar plakayı 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
2. ADN zenginleştirme ile desteklenen mikobakteriyel et suyu ortamının(Malzeme Tablosu)2 mL'lik Mtb¹⁰ kolonisini aşılayınız. 37 °C'de ajitasyon ile kuluçka.
3. Mtb kültürü geç logaritmik faz (OD₅₄₀ ~ 0,8) büyümeye izin verin. Bunu kontrol etmek için, bir spektrofotometre kullanarak OD₅₄₀ ölçün.
4. Geç logaritmik kültürün 200 μL'lik kısmını mikobakteriyel agar plakalarına(Malzeme Tablosu)%0.2 gliserol, %0.05 Tween-80 ve ADN ile desteklendi. En az 5 tabak aşılamak. Bakteri üremesi enfluent bir tabaka olarak görülene kadar plakaları 37 °C'de kuluçkaya yatırın. Bu Mtb için ~ 1 hafta sürer.
5. LIMM'de steril pamuklu bir bez isledin. Agar plakalarından bakteri toplamak ve 100 mL LIKM aşılamak için bu bezi kullanarak ~1.0'lık Bir OD₅₄₀ ile konsantre bakteriyel süspansiyon hazırlayın.
6. Bu süspansiyonu LIMM ile 10 ila 1 L arasında seyreltin ve her biri 500 mL kültür içeren iki, 2 L steril plastik şişeye bölün.
7. 2 mL kültür alın ve 5 mL kültür tüpüne aktarın. %10 vol/vol tyloxapol 10 μL ekleyin.
8. Kültürleri 37 °C'de 14 gün bekletin.

3. MEVs koleksiyonu

1. Toplama sırasında 2 mL kültürün OD_540'ı ölçün. ADN ve%0.05 Tween-80 ile agar plakalar üzerinde kültür ve plaka 100 μL her seyreltme 1:10 seri seyreltme olun.
2. Kültürü 20 °C'de 7 dk için 2.850 x g'da beş 225 mL konik santrifüj tüpve santrifüje aktarın.
3. 50 mL'lik pipetle kültür supernatant'ını toplayın ve filtre yi 0,22 μm'lik bir filtre ünitesi nden sterilize edin.

4. MEV'lerin İzolasyon

1. Kültür filtrasyonunu 4 °C'de yerleştirilen bir pil ultrafiltrasyon sistemine aktarın ve 100 kDa kesme membranından <50 psi'deki konsantreyi ~50 mL'ye filtreleyin.
2. Konsantre kültürü 15.000 x g'de 15 dakika 4 °C'de santrifüj edin ve süpernatant toplayın.
3. Polikarbonat ultrasantrifüj tüplerinde 4 °C'de 2 saat için 100.000 x g'de kültür filtrasyonunu santrifüj edin.
4. Membranöz peletleri toplam 1 mL steril fosfat tamponlu salin (PBS) şeklinde hassas pipetleme ile yeniden askıya alın.
5. Adım 4.4'te elde edilen pelet süspansiyonunun 0,5 mL'sini %60 iodixanol çözeltisi ile karıştırın ve %45 wt/vol son iyodixanol konsantrasyonu elde edin.
6. MEV-iodixanol%45 süspansiyonu 1 mL %40, %35, %30, %25 ve %20 (PBS'de vol/vol) iodixanol çözeltileri ve 1 mL PBS ile üstte yer akıtın.
7. 4 °C'de 18 saat için 100.000 x g santrifüj.
8. 1 mL Hamilton şırıngası kullanarak üstten başlayarak 1 mL yoğunluk gradyan fraksiyonları toplayın.
9. Toplanan her bir fraksiyonu 20 mL'ye, PBS ile 20 mL'ye seyreltin ve 4 °C'de 2 saat için 100.000 x g'de santrifüj edin.
10. Supernatant çıkarın ve PBS 0,5 mL pelet askıya. Bu peleti 4 °C'de saklayın.

5. MEV'lerin Nicelleştirilmesi

1. Üreticinin yönergelerini izleyerek, her fraksiyondaki protein konsantrasyonunu bir Bradford tonu(Malzeme Tablosu)ile ölçün.
2. Membran lipid analizi yapın.
   1. Floresan membran probu 1-(4-Trimethylamonniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Heksatriene p-Toluenesulfonat (TMA-DPH) ile her degrade fraksiyonun 10 μL inkübat 10 μL pBS son 50 μL hacmi nde 96 iyi siyah Plaka.
   2. Plakaları 33 °C'de 20 dk kuluçkaya yatırın.
   3. Floresan'ı 360 nm uyarma ve 430 nm emisyonda ölçün.

6. MEV'lerin nitel analizi

1. Protein elektroforezi gerçekleştirin.
   1. 16°L'de yaklaşık 1 μL'lik MEV numunelerini 4 μL 5x numune yükleme tamponu (%10 w/v SDS, 10 mM dithiothreitol, %20 v/v gliserol 0,2 M Tris-HCl, pH 6.8 0.05% w/v bromophenol mavi) ile karıştırın ve numune tamponunda numune tamponunda 85 °C'de 85 °C'de ısıtın.
   2. %10 Tris/Glisin SDS-poliakrilamid jel¹¹ yükve çalışan tampon (25 mM Tris baz, 190 mM glisin, 0.1% SDS) çalıştırın mavi boya ön jel in altına ulaşana kadar.
   3. Jeli ultrahassas bir protein boyama solüsyonu(Malzeme Tablosu)ile lekele.
2. Nokta lekesini gerçekleştirin.
   1. Yaklaşık 0,5 g/μL konsantrasyonu olan bir MEV süspansiyonunun 2 μL'sini ve bir nitroselüloz membranüzerinde iki kat seri seyreltme ler yükleyin ve üreticinin talimatlarına göre nokta lekesi için proses yapın.
   2. Birincil antikor ve bir keçi anti-fare horseradish peroksidaz (HRP) birleştiğinde 1:10.000 ikincil antikor olarak bir seyreltme olarak 1:5.000 bir seyreltme mevs bir hazırlık karşı farelerde yükseltilmiş bir antiserum kullanın. Uygun bir HRP substrat Blotting Algılama Reaktifi ve görüntüleme sistemi ile antijen-antikor komplekslerini sapta.
3. Negatif boyama ve elektron mikroskobu gerçekleştirin.
   1. 250 μL'lik MEV'leri %2 glutaraldehit ile 0,1 M oda sıcaklığında 2 saat kacodylate ve gece boyunca %4 formaldehit, %1 glutaraldehit ve %0,1 PBS'de kuluçkaya yatırın.
   2. 90 dk için% 2 osmiyum tetroksit ile sabit örnekleri leke.
   3. Seri etanol örnek dehydrate ve Spurr epoksi reçine gömmek.
   4. Bir iletim elektron mikroskobu altında MEVs gözlemleyin.

Sonuçlar

MEV'ler bir yoğunluk gradyanda diferansiyel sedimantasyon ile saflaştırılmıştı (Şekil 1, Şekil 2). Açıklanan koşullar altında, MEVs çoğunlukla degrade kesir 3 (F3), hangi% 25 iodixanol karşılık ayrılmıştır. Bu sonuç protein, membran lipid, bozulmamış MEV'lerin mikroskobik görüntülemesi, nanopartikül boyut dağılımı ve antivezile antiserum ile pozitif reaktivitenin saptanması üzerine kuruludur(Şekil 2,...

Tartışma

Ökaryotik hücre kaynaklı ekzozomları arındırmak için birden fazla yöntem geliştirilmiştir¹². Buna karşılık, bakteri kaynaklı EVs⁷arındırmak için etkili yöntemler hakkında sınırlı bilgi vardır. Mtb kaynaklı EV'lerin verimli bir şekilde izole edilmesi, bu patojenik mikobacterium'un yetiştirimindeki içsel zorlukları göz önünde bulundurmak gerekir. Mtb uzun bir bölünme süresine sahiptir (~24 saat) ve biyogüvenlik seviyesi üç (BSL-3) koşullarda kullanılmalıdır. Bu nedenle, MEV i...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Amicon karıştırılmış hücre Model 108	EMD Milipore	UFSC40001	Hücresi Ultrafiltrasyon sistemi
BD Polipropilen 225 mL konik tüpler	Fisher	05-538-61	Konik santrifüj tüpleri
Biomax 100 kDa kesme ultrafiltrasyon membranı	EMD Milipore PBHK07610		Ultrafiltrasyon membranı
Chelex-100 reçine	Bio-Rad	142-2842	Metal şelatlama reçinesi
Middlebrook 7H10 Agar	BD Difco	262710	Mikobakteriyel Agar plakaları
Middlebrook 7H9 Et suyu	BD Difco	271310	Mikobakteriyel et suyu ortamı
Nitro selüloz lekeleme membranı	GE Healthcare	10600001	Kurutma Membranı
Optiprep	Sigma	D1556	İodiksanol
Polikarbonat ultra santrifüjleme tüpler 25 mm x 89 mm	Beckman Coulter		355618 Polikarbonat ultra santrifüj tüpleri 25 mm x 89 mm
Polipropilen ince cidarlı santrifüj tüpü 13 mm x 15 mm	Beckman Coulter	344059	Polipropilen ince cidarlı santrifüj tüpü 13 mm x 15 mm
Protein Tahlil boyası	BioRad	5000006	Bradford Protein Boyama
SYPRO Yakut	Moleküler Problar	S12000	Ultra hassas protein lekesi
TMA-DPH	Moleküler Problar	T204	1- (4-Trimetilamonyumfenil) -6-Fenil-1,3,5-Hekzatrien p< / em>-Toluensülfonat
Vakum filtrasyon şişeleri	CellPro	V50022	Filtre Ünitesi