Yöntem makalesi

Formalin-sabit Parafin gömülü Hydatidiform Molar Dokuların Mikrouydu DNA Genotipleme ve Akış Sitometri Ploidy Analizleri

DOI:

10.3791/60366

⸱

20 Ekim 2019

 ,  ,  , 
1Department of Experimental Medicine, McGill University, 2Department of Human Genetics, McGill University, 3Department of Obstetrics and Gynecology, McGill University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hydatidiform benler, morfolojik özelliklerine ve molar genomlara ebeveyn katkısına göre sınıflandırılabilen heterojen etiyolojileri olan anormal insan gebelikleridir. Burada formalin-sabit parafin gömülü azı laksamalarının multipleks mikrouydu DNA genotipleme ve akış sitometrisi protokolleri, sonuçların yorumlanması ve entegrasyonu ile birlikte ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hidatidiform mol (HM), aşırı trofoblastik proliferasyon ve anormal embriyonik gelişim ile karakterize anormal bir insan gebeliğidir. Mikroskobik morfolojik değerlendirmeye dayalı iki tip HM vardır: komple HM (CHM) ve kısmi HM (PHM). Bunlar, molar genomlarına ebeveyn katkısına göre daha fazla alt bölümlere ayrılabilir. HM'nin morfoloji ve genotip analizleri ile böyle bir karakterizasyonu, hasta yönetimi ve bu ilginç patolojinin temel anlayışı için çok önemlidir. HM'nin morfolojik analizinin geniş bir gözlemci ler arası değişkenliğe tabi olduğu ve HM'yi CHM ve PHM'ye doğru bir şekilde sınıflandırmak ve bunları hidropik molar olmayan düşüklerden ayırmak için tek başına yeterli olmadığı belgelenmiştir. Genotipleme analizi çoğunlukla optimal kaliteden daha az olan ve sonuç olarak yanlış sonuçlara yol açabilecek formalin-sabit parafin gömülü (FFPE) döllenme ürünlerinden DNA ve dokular üzerinde yapılır. Bu makalede FFPE molar dokularının çokk genotipleme ve akış sitometri analizleri için ayrıntılı protokoller, bu yöntemlerin sonuçlarının yorumlanması, bunların sorun giderme ve morfolojik değerlendirme ile entegrasyon ile birlikte sağlanmaktadır. , p57KIP2 immünohistokimya, ve floresan yerinde hibridizasyon (FISH) doğru ve sağlam bir tanı ulaşmak için. Burada yazarlar, son 10 yılda yaklaşık 400 conception ürününün analizinden öğrenilen yöntem ve dersleri paylaşıyorlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hydatidiform mol (HM), anormal embriyonik gelişim, trofoblastın hiperproproproproproproprobu ve koryonik villinin hidropik dejenerasyonu (CV) ile karakterize anormal bir insan gebeliğidir. Tarihsel olarak, HM iki tip, tam HM (CHM) ve kısmi HM (PHM) sadece morfolojik değerlendirme1dayalı bölünmüş olması için kullanılır. Ancak, morfolojik değerlendirmenin tek başına HM'yi iki alt tipe (CHM ve PHM) ayırmak ve bunları molar olmayan düşüklerden ayırmak için yeterli olmadığı gösterilmiştir2,3,4.

CHM ve PHM'nin malignitelere göre farklı eğilimleri olduğundan, hastalara uygun takip ve yönetimi sağlamak için genotik HM tipini doğru bir şekilde belirlemek önemlidir. Sonuç olarak, son yıllarda, azı laklarına ebeveyn katkısını belirlemek ve HM'nin doğru bir sınıflandırmasına ulaşmak amacıyla çeşitli metodolojiler geliştirilmiş ve geliştirilmiştir. Bunlar arasında karyotip analizi, kromozom bantlama polimorfizmi, insan lökosit antijeni (HLA) serolojik yazma, restriksiyon parça uzunluğu polimorfizmi, değişken tandem tekrarı sayısı, mikrouydu genotipleme, akış sitometrisi ve p57 KIP2 immünohistokimya. Bu, hm gebelerinin genomlarına ebeveyn katkısına dayalı doğru bir alt bölüme sahip olmasına olanak sağlamıştır: Dploid androgenetik monospermik veya diploid androgenetik dispermik olan CHM ve triploid olan PHM, %99 ve olguların %1'inde monospermik5,6,7,8. Ayrıca, son yirmi yılda ortaya çıkan başka bir genotypic HM tipi vardır, hangi diploid biparental olduğunu. İkincisi çoğunlukla tekrarlayan ve tek bir aile üyesi etkileyebilir (simpleks durumlarda) veya en az iki aile üyesi (ailesel durumlarda). Bu diploid biebeveyn benler çoğunlukla NLRP7 veya KHDC3L hastalarda9,10,11,12resesif mutasyonlar neden olur. NLRP7'de resesif mutasyonu olan hastalarda diploid biebeveynLI HM morfolojik analiz ile CHM veya PHM tanısı konabilir ve bu hastalardamutasyonların şiddeti ile ilişkili gibi görüner13,14. HM'nin genotiplerine göre sınıflandırılmasına ek olarak, çeşitli genotipleme yöntemlerinin tanıtımı ve kullanımı, çeşitli molar varlıkların molar olmayan düşüklerden, örneğin aneuploid diploid biebeveyn kavramları ndan ayırt edilebilmiştir ve diğer kavram türleri5,15. Bu tür kavramlar bazı trofoblast proliferasyonu ve bir dereceye kadar HM bazı morfolojik özellikleri taklit anormal villous morfolojisi olabilir.

Bu makalenin amacı, formalin-sabit parafin gömülü (FFPE) dokuların çokkatlı genotipleme ve akış sitometrisi için ayrıntılı protokoller sağlamak ve bu yöntemlerin sonuçlarının kapsamlı analizleri ve bunların diğer yöntemlerle bütünleştirilmesi azı laklarının doğru ve kesin tanısı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma McGill Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanmıştır. Tüm hastalar çalışmaya katılmak ve ffpe ürünlerinin çeşitli patoloji bölümlerinden alınması için yazılı izin verilmiştir.

NOT: Akış sitometrisi ile genotipleme ve ploidi tayini için çeşitli yöntemler olmakla birlikte, burada sağlanan protokoller her biri için bir platform kullanarak bir analiz yöntemini tanımlar.

1. Genotipleme

  1. En iyi FFPE bloğunun seçimi
    1. Gebeliğin her FF ÜRÜNÜ (POC) için, mikroskopi ile morfolojik değerlendirme için, mevcut her blok için bir tane olan 1.2 ve 1.3 bölümlerinde açıklandığı şekilde 4 μm kalınlığında hematoksilin ve eozin (H&E) lekeli kesitler hazırlayın.
    2. H&E slaytları ve hafif mikroskobu kullanarak, en fazla koroyonik villi (CV) miktarına sahip FFPE bloğunu ve mümkünse, CV'si anne dokularından ayrı ve iç içe olmayan bloğu seçin.
  2. Kesit
    1. Kesiti kolaylaştırmak için seçilen bloğu 15 dakika boyunca buzüzerine yerleştirin.
    2. Mikrotomu mikroskobik morfolojik değerlendirme için 4 μm kalınlığında ve DNA ekstraksiyonu için 10 μm kalınlığında kesecek şekilde ayarlayın.
    3. Soğuk bloğu mikrotome yerleştirin ve DNA ekstraksiyonu için bloktaki CV miktarına bağlı olarak H&E boyama için her bloktan bir bölüm ve seçilen bloktan 10−30 kesit kesin.
      NOT: CV dolu bloklar için DNA ekstraksiyonu için 10 bölüm yeterlidir. Bloğun sadece 'u CV, geri kalanı ise anne dokuları ise yeterli miktarda DNA sağlamak için 20−30 kesite ihtiyaç duyulabilmektedir.
    4. Forceps kullanarak, her bölümü 45 °C su banyosuna aktarın. Daha önce bir kalem kullanarak örnek kimlik numarası ile etiketlenmiş bir pozitif yüklü slayt(Malzeme Tablosu)ile su banyosundan bölümü alın.
    5. Bölümleri içeren slaytları 65 °C'de bir fırına yerleştirin ve bölümlerin slaytlara yapışmasını bekleyin. H&E için slaytları 25 dakika fırında tutun.
      NOT: Daha kısa kuluçka süresi dokuları slaytlara biraz daha az yapışır ve dolayısıyla anne dokularının çıkarılmasını kolaylaştırır.
  3. H&E boyama
    1. Slaytların oda sıcaklığına (10 dk) kadar soğumasını bekleyin.
    2. Reaktif hazırlama
      1. Eosin Y çalışma solüsyonu hazırlayın (%0.25) Tablo 1'egöre . İyi bir şekilde karıştırın ve oda sıcaklığında saklayın.
      2. Hematoksilin 5x'in stok çözeltisini suda seyrelterek hematoksilin çözeltisini hazırlayın (yani 80 mL suyu 20 mL hematoksilin ile karıştırın).
        NOT: Depolama için folyo hematoksilin stok çözeltisi sarın.
    3. Tablo 2'yegöre bir duman kaputunun altında doğru reaktiflerle boyama kavanozları hazırlayın.
    4. Slaytları Tablo 2'yegöre doğru zaman dilimi için uygun boyama kavanozlarına batırarak H&E boyama gerçekleştirin.
    5. Morfolojik analiz için 4 μm kesitleri montaj ortamı ve cam kapaklı kapaklı kapaklı(Malzeme Tablosu) monte edin.
      NOT: Genotipleme için 10 μm kesitler örtülmemelidir.
    6. Zehirli ksilen kokularının dağılabilmesi için duman kaputunun altındaki 10 μm'lik kesitleri en az 3 saat bekletin.
      DİkKAT: Tüm boyama adımları bir duman başlık altında yapılmalıdır. Ksilen kokuları toksik olduğu için ksilen ürünleri her zaman kaputun altında tutulmalıdır. Ayrıca, ksilen ve hematoksilin özel kaplarda atılması gerekir. Bu konteynerler dolduğunda, laboratuvarın güvenlik organizasyonu tarafından tavsiye edildiği şekilde atılmalıdır.
ReaktifMiktar
Eosin Y stok çözeltisi (%1)250 mL

&E

    1. &E-lekeli

figure-protocol-1

figure-protocol-2



figure-protocol-3


figure-protocol-4





figure-protocol-5

    1. &E
    2. &E

figure-protocol-6
&E

figure-protocol-7
&E&E









      3. figure-protocol-8
      5. figure-protocol-9

      7. figure-protocol-10

      10. figure-protocol-11

figure-protocol-12

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Azı laklarının karmaşıklığı ve çeşitli genotiplere sahip olmaları, morfolojik değerlendirme, p57 immünohistokimyası, mikrouydu genotipleme, akış sitometrisi ve FISH gibi çeşitli yöntemlerin kullanılmasını gerektirir. Örneğin, bir hastaya (1790) sadece POC'ların mikrodizi analizi ile triploid olduğu tespit edilen iki PHM ile sevk edildi. Bu nedenle hastaya tekrarlayan PHM tanısı konuldu. Hastanın dna'sı ve partneri ile birlikte iki "PHM"in mikrouydu genotiplemesinde hastanın ilk köstebeği ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HM heterojen etiyolojileri ile anormal insan gebelikleri ve farklı histolojik ve genotik türleri vardır, hangi onların doğru sınıflandırma ve tanı zor hale getirir. Histopatolojik morfolojik değerlendirme genellikle yanlış kanıtlanmıştır ve bu nedenle HM'yi CHM ve PHM olarak sınıflandırmak ve bunları molar olmayan düşüklerden ayırt etmek için tek başına güvenilmezdir. Bu nedenle, HM doğru bir tanı multiks mikrouydu DNA genotipleme, akış sitometri sitometri sitometri sitomi ile ploidi analizi, FISH ploidy analizi ve p57

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar sophie Patrier ve Marianne Parésy orijinal akış sitometri protokolü paylaşımı için teşekkür ve Promega ve Qiagen malzemeleri ve reaktifler sağlamak için. Bu çalışma Réseau Québécois en Reprodüksiyon ve Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüsü (MOP-130364) tarafından R.S.'ye destek lenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
BD FACS Canto IIBD BioSciences338960
Kılcal elektroforez cihazı: Genomlar Uygulamalı Biyosistemler 3730xl DNA AnalizörüUygulamalı biyosistemler313001RUygulamalı Genomik Merkezi tarafından sunulan hizmet
(http://www.tcag.ca)
Sitrik asitSigma251275
Cytoseal 60, histopatoloji montaj ortamıFisher
Eosin Y stok çözeltisi (%1)FisherSE23-500D
FCSalyzer - akış sitometrisi analiz yazılımıSourceForge-https://sourceforge.net/projects/fcsalyzer/
FFPE Qiagen kitiQiagen80234
ForsepsGüzel Bilim Araçları11295-51Kesit alma ve temizleme işlemi için
Buzul Asetik Asit (Konsantre)SigmaA6283-500mL
Cam lameller: Kapak CamıFisher12-541a
HematoksilenFisherCS401-1D
Yüksek oranda deiyonize formamid: Hi-Di FormamidThermofisher4311320
IHC platformu: Benchmark UltraRoche-Kimwipes
Ultident30-34120
MikrotomLeicaRM2135
Mikrotom bıçaklarıFisher12-634-1C
Nitex filtreleme ağı, 48 μ mFilmar74011http://www.filmar.qc.ca/index.php?filet=produits&id=51&lang=en ; Başka herhangi bir filtre uygundur, ancak bu, araştırma dışı bir şirketten ucuz ve etkili bir seçenektir
P57Antikoru Hücre Markası457M
Pasteur pipetiVWR53499-632
PCR makinesiPerkin Elmer, Uygulamalı BiyosistemlerGeneAmp PCR Sistemi 9700
Genotipleme analizi içinPeakScanner 1.0Uygulamalı Biyosistemler4381867
Domuz mide mukozasından pepsinSigmaP7012
Polistiren yuvarlak tabanlı tüplerBD Falcon352058
Pozitif yüklü slaytlar: Superfrost Plus 25x75mmFisher1255015
PowerPlex 16 HS SistemiPromega CorporationDC2102
Propidyum İyodürSigmaP4864
Sığır pankreasından ribonükleazA SigmaR4875
Ayırma matrisi: POP-7 PolimerTermofisher4352759
UltraPure AgarozFisher16500-500
KsilenFisherX3P1GAL
23244257 Yazılımı.

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Szulman, A. E., Surti, U. The syndromes of hydatidiform mole. II. Morphologic evolution of the complete and partial mole. American Journal of Obstetrics & Gynecology. 132 (1), 20-27 (1978).
  2. Fukunaga, M., et al. Interobserver and intraobserver variability in the diagnosis of hydatidiform mole. The American Journal of Surgical Pathology. 29 (7), 942-947 (2005).
  3. Gupta, M., et al. Diagnostic reproducibility of hydatidiform moles: ancillary techniques (p57 immunohistochemistry and molecular genotyping) improve morphologic diagnosis for both recently trained and experienced gynecologic pathologists. The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1747-1760 (2012).
  4. Howat, A. J., et al. Can histopathologists reliably diagnose molar pregnancy? Journal of Clinical Pathology. 46 (7), 599-602 (1993).
  5. Banet, N., et al. Characteristics of hydatidiform moles: analysis of a prospective series with p57 immunohistochemistry and molecular genotyping. Modern Pathology. 27 (2), 238-254 (2014).
  6. Lipata, F., et al. Precise DNA genotyping diagnosis of hydatidiform mole. Obstetrics & Gynecology. 115 (4), 784-794 (2010).
  7. Buza, N., Hui, P. Partial hydatidiform mole: histologic parameters in correlation with DNA genotyping. International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (3), 307-315 (2013).
  8. Fisher, R. A., et al. Frequency of heterozygous complete hydatidiform moles, estimated by locus-specific minisatellite and Y chromosome-specific probes. Human Genetics. 82 (3), 259-263 (1989).
  9. Murdoch, S., et al. Mutations in NALP7 cause recurrent hydatidiform moles and reproductive wastage in humans. Nature Genetics. 38 (3), 300-302 (2006).
  10. Parry, D. A., et al. Mutations causing familial biparental hydatidiform mole implicate c6orf221 as a possible regulator of genomic imprinting in the human oocyte. American Journal of Human Genetics. 89 (3), 451-458 (2011).
  11. Nguyen, N. M., Slim, R. Genetics and Epigenetics of Recurrent Hydatidiform Moles: Basic Science and Genetic Counselling. Current Obstetrics and Gynecology Reports. 3, 55-64 (2014).
  12. Sebire, N. J., Savage, P. M., Seckl, M. J., Fisher, R. A. Histopathological features of biparental complete hydatidiform moles in women with NLRP7 mutations. Placenta. 34 (1), 50-56 (2013).
  13. Nguyen, N. M., et al. Comprehensive genotype-phenotype correlations between NLRP7 mutations and the balance between embryonic tissue differentiation and trophoblastic proliferation. Journal of Medical Genetics. 51 (9), 623-634 (2014).
  14. Brown, L., et al. Recurrent pregnancy loss in a woman with NLRP7 mutation: not all molar pregnancies can be easily classified as either "partial" or "complete" hydatidiform moles. International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (4), 399-405 (2013).
  15. Colgan, T. J., Chang, M. C., Nanji, S., Kolomietz, E. A Reappraisal of the Incidence of Placental Hydatidiform Mole Using Selective Molecular Genotyping. The International Journal of Gynecological Cancer. 26 (7), 1345-1350 (2016).
  16. Murphy, K. M., McConnell, T. G., Hafez, M. J., Vang, R., Ronnett, B. M. Molecular genotyping of hydatidiform moles: analytic validation of a multiplex short tandem repeat assay. The Journal of Molecular Diagnostics. 11 (6), 598-605 (2009).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Multipleks K sa Tandem TekrarDNA Ekstraksiyon ProtokolPropidyum yod r Ribon kleazKoriyonik Villus Zenginle tirmeH E Boyama Kesit Almap57KIP2 mm nohistokimyas

İlgili makaleler