İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinden Beyin Organoidleri Üretmek için Statik Kendi Kendini Yöneten Bir Yöntem

Sayısız pratik ve etik sınırlamalar nedeniyle, insan beynini incelemekte büyük bir zorluk olmuştur. Kemirgenler kullanan çalışmalar insan beyninin anlayışı için kritik olmuştur iken, fare beyin birçok farklılıklar vardır^1,2. İlginçtir, fareler primat^beyin3,⁴en az 7 kat daha az bir nöronal yoğunluğu var. Primatlar insanlara evrimsel açıdan kemirgenlerden daha yakın olsalar da, çoğu araştırmacının onlarla çalışması pratik değildir. Bu protokolün amacı, beyin hücresi çeşitliliği ve hücresel örgütlenmeyi korurken heterolog bir bazal membran matrisine veya eksojen büyüme faktörlerine gerek kalmadan basitleştirilmiş ve daha ucuz bir yöntem kullanarak insan beyninin birçok önemli özelliğini özetlemekti.

Sasai laboratuarından biçimlendirici çalışma sinyalize embriyonik kök hücrelerden iki ve üç boyutlu nöronal hücre tipleri oluşturmak için embriyoid organların serum ücretsiz kültür (SFEBq) yöntemi kullanılır (ESCs)^5,6. Birçok insan beyin organoid yöntemleri sinyalize ESCs nispeten benzer bir yol izlemiştir^7,8. Buna karşılık, bu protokol müstakil insan ESCs kümeleri ile başlar (hESCs), kaplama adımları önce Thomson ve Zhang laboratuvarlarının seminal çalışmanın ilk adımları benzer^9,10 yanı sıra eksojen büyüme faktörlerinin eklenmesinden önce Pasca laboratuvarının beyin organoid protokolünün ilk adım¹¹. Bazal membran matrisler (örneğin, matrigel) birçok beyin organoid protokolleri kullanılmıştır ve etkili bir iskele olduğu gösterilmiştir⁸. Ancak, en sık kullanılan bazal membran matrisler onlar üretim sırasında toplu değişkenlik için toplu büyüme faktörlerinin bilinmeyen miktarlarda co-arındırmak gibi komplikasyonlar olmadan gelmez¹². Buna ek olarak, bu matrisler görüntülemekarmaşık ve kontaminasyon ve maliyet riskini artırabilir.

İnsan beyin organoidler birçok soruya cevap için kullanılabilir iken, akılda tutulması gereken bazı sınırlamalar vardır. İlk olarak, embriyonik kök hücrelerden başlayarak, organoidler daha yakından yaşlı beyinlere göre olgunlaşmamış beyinler benzer ve bu nedenle yaşlılıkta meydana gelen hastalıklar için ideal modeller olmayabilir, Alzheimer hastalığı gibi. İkinci olarak, protokolümüz de konserde birden fazla beyin bölgesinden hücreler üzerinde bir tedavi veya hastalığın etkisini incelemek için yararlı olan ön beyin, orta beyin ve arka beyin gelişimi belirteçleri bulundu, diğer protokoller belirli beyin bölgeleri üzerinde konsantre takip edilebilir^13,14. Son olarak, organoid modellerin bir diğer sınırlama boyutu, bir insan beyninin ortalama uzunluğu ise yaklaşık 167 mm, ajitasyon kullanımı ile yapılan beyin organoidler kadar büyümek 4 mm⁸ ve bu protokol tarafından oluşturulan organoidler 10 hafta 1-2 mm büyür. Yine de, bu protokol insan beyin dokusu ve birden fazla hücre tiplerinin etkileşimi incelemek için önemli bir araç sağlar.

1. Kök Hücre Bakımı

1. Büyüme faktörü azaltılmış bodrum membran matris bir tabaka üzerinde H9 hESCs korumak (Malzemeler Tablosubakınız , bundan böyle sadece matris olarak anılacaktır) üreticinin talimatlarına göre.
   1. Bir 6-iyi plaka veya bir 10 cm çanak kaplamak için, buz gibi Dulbecco'nun modifiye Eagle orta (DMEM)/F12 medya 5,9 mL ile matris 100 μL birleştirir. Plakaları parafin filmine sarın ve gece boyunca 4 °C'de saklayın. Aşırı matris/ortam aspire edildikten sonra hücreleri geçirmek için ertesi gün kullanın.
2. Kültür hücreleri hafta hafta yaklaşık 1:12 bölünmüş oranı her 7 günde. Hücreleri 37 °C'lik bir mTESR-1 media, düşük oksijen inkübatör (%5 O_2,%5 CO₂₎kullanarak koruyun. Medyayı her gün yenileyin. Cam aletler kullanarak pasajlar arasındaki kültürlerden ayırıcı hücreleri ayırArak ayırın.
3. H9 hücreleri organoidler üretmek için onları kullanmadan önce dört ila altı gün önce geçit edilmelidir. Hücreler hücre kümelerinin yaklaşık 1:8 oranında geçmelidir. Bunu yapmak için, hücreleri DMEM F12 media ile durulayarak başlayın ve hücreleri nötr bir proteaz (örneğin, dispase, bundan böyle sadece proteaz olarak adlandırılır), DMEM/F-12 ile durulayın ve 4 plaka (6-iyi veya 10 cm) arasında ~%20'lik bir arada 30-60 hücre kümesi şeklinde durulayın. Hasattan iki gün önce, onları normal bir kuluçka makinesine geçirin (%21 O_2,%5 CO_2). Organoid formasyona başlarken plakalar ~%80 birleşmeye ulaşmalıdır.

2. Organoid Kültür için HESC'lerin Dissosiyatasyonu

1. Aliquot proteease stok çözeltisi (5 U/mL).
   NOT: Genellikle -20 °C'de 1 mL aliquots aşağı birkaç ay boyunca kullanılmak üzere dondurun.
2. Proteaz stok çözeltisini, her 6 kuyu veya 10 cm'lik hESC'ler için 1 mL stok çözeltisi artı 5 mL DMEM/F12 ekleyerek çalışma konsantrasyonuna seyreltin.
3. Aspire ve hücre kültürü medya kaldırmak, sonra proteaz çözeltisi ile hESCs kapağı. Plakaları 10-15 dakika boyunca kuvöze yerleştirin veya kolonilerin kenarları yuvarlanıp matristen ayırmaya başlayana kadar.
4. Plakayı yatırın, proteaz çözeltisini aspire edin ve hücreleri DMEM/F12 ile üç kez hafifçe yıkayın. 10 cm'lik bir tabak kullanırken 6 kuyulu bir tabak ve 6 mL kullanırken her yıkama için 2 mL/iyi kullanın. Bu adımı gerçekleştirirken kolonilerin matrise bağlı kaldığından emin olun.
5. Her kuyuya yaklaşık 1,5 mL taze mTESR ortam (veya 10 cm plaka için 5 mL) ekleyin ve hücreleri nazik pipetleme kullanarak plakadan temizler.
6. 10 mL'lik pipet kullanarak, hESC'yi orijinal^{boyutlarının} yaklaşık 1/30'una ulaşana kadar plaka içinde hafifçe aspire edin ve dağıtın. Koloni kümeleri bu adımların tamamlanmasında ~250-350 μm ölçekli karelere benzemelidir.

3. Organoidlerin Üretimi

1. Hücreleri, temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) olmadan 30 mL mTESR ortam içeren tek bir ultra düşük eki T75 şişesine aktarın.
2. Ertesi gün, köşede canlı hücre havuzu (bu ilk gün 5-10 dakika sürebilir, ancak kümeleri büyüdükçe daha hızlı alacak) gibi şişe (ler) tilt.
   NOT: Bu adımda veya sonraki adımlarda şişenin altına yapışmış çok sayıda hücre varsa, hücreleri yeni bir şişeye aktarın. İlk iki gün yüksek sayıda ölü hücreye sahip olması normaldir. Ortam değişiklikleri gerçekleştirirken, hücre enkazının mümkün olduğunca çoğunu kaldırdığınızdan emin olun.
3. Hücreler yerleştikten sonra, canlı hücreleri içeren yaklaşık 10 mL'lik ortam bırakarak ortam ve ölü hücreleri aspire edin.
4. 1x N2, 1x B27, 1x L-glutamin, 1x NEAA, %0.05 sığır serum albumini (BSA) ve 0.1 mM monotiyogliserol (MTG) ile birlikte 30 ng/mL bFGF ile desteklenen ~ 20 mL düşük bFGF medya (DMEM/F12) ekleyin.
5. 2. günde hücreleri kontrol edin. Hücrelerin çoğu sağlıklı ve parlak görünüyorsa, bir şey yapmanıza gerek yoktur. Ancak, hücrelerin üçte birinden fazlası koyu renk görünürse, ortamı (adım 3.2'deki yle aynı yatırma tekniğini kullanarak) ~20 mL düşük bFGF medya ile 20 ng/mL bFGF ile tamamlanır.
6. 3. günde, 10 ng/mL bFGF ile desteklenen 20 mL düşük bFGF ortamile ortamın yarısını (adım 3.2'deki yatırma tekniğini kullanarak) değiştirin.
7. 5. günde, ortamın yarısını (adım 3.2'deki yatırma tekniğini kullanarak) 20 mL nöral indüksiyon media (NIM: DMEM/F12, 1x N2 takviyesi, 0.1 mM MEM NEAA, 2 μg/mL heparin) ile değiştirin.
   NOT: Diğerlerinden çok daha büyük büyük hücre veya organoid kümeleri varsa, kültürden uzaklaştırılmalıdır. Boyut mikroskop altında görünüm tarafından tahmin edilmektedir; örneğin, reticle ile bir gözlük kullanarak. Organoidlerin çoğu benzer büyüklüktedir (kabaca 100 ± 20 μm). Diğerlerinden yaklaşık 2 kat daha küçük veya daha büyük olan organoidleri çıkardık.
8. Ortamın yarısını (~15 mL) (yatırma tekniğini kullanarak) nim ile her gün değiştirin.
9. Kültürde 3 hafta sonra, ortama 100x penisilin/streptomisin ekleyin (NIM: DMEM/F12, 1x N2 takviyesi, 0.1 mM MEM NEAA, 2 μg/mL heparin) istenirse 1x son konsantrasyonunda. Medyayı her gün yenileyin.
   NOT: Bu şekilde, kültürde 6 aya kadar organoidleri koruduk.

4. RNA Çıkarma ve Hazırlama

1. 10 mL'lik bir pipet kullanarak şişeden yaklaşık 15 organoidi (boyuta bağlı olarak) hafifçe ayıklayın ve 1,5 mL'lik bir tüpe yerleştirin.
   1. Santrifüjdeki (1 dk için 200 x g) organoidleri hafifçe peletleyin ve 1x Dulbecco'nun PBS 'si (DPBS) ile üç kez durulayın.
2. Doğrulanmış sistem veya protokol (örn. RNeasy kiti) kullanarak RNA ayıklayın.
3. Her numunenin optik yoğunluk değerini 260 ve 280 nm olarak ölçün.
4. Doğrulanmış bir sistem veya protokol (örneğin, iScript cDNA sentez kiti) kullanarak cDNA hazırlayın.
5. En az bir temizlik geni de dahil olmak üzere önceden onaylanmış astarlar(Tablo 1)kullanarak qRT-PCR gerçekleştirin.

5. İmmünohistokimya

1. Fiksasyon
   1. %4 paraformaldehit (PFA) çözeltisi hazırlayın ve 4 °C'ye yerleştirin.
   2. Steril bir jilet kullanarak, steril bir transfer pipetinin ucunu kesin.
   3. Kesme transfer pipetini kullanarak organoidleri yavaşça ayıklayın, çünkü özellikle büyüdüklerinde kolayca parçalanabilirler ve ek ortam veya DPBS ile 6 kuyulu bir tabağa yerleştirin.
   4. Plakayı yatırın, ortama aspire edin ve 1x DPBS ile değiştirin. Hücreleri 1x DPBS ile iki kez daha durulayın.
   5. DPBS'yi %4 PFA çözeltisi ile değiştirin ve 4 °C'de bir çalkalayıcının üzerine yerleştirin.
      NOT: 2 gün (küçük organoidler için) 7 güne (organoidler için >3 ay) sabitlenirken, daha kısa süreler (örn. 16-24 saat) de mümkündür.
   6. DPBS'de %30, %20 ve %10 sakkaroz çözeltisi hazırlayın.
   7. PFA'da fiksasyondan sonra % 10 sakaroz çözeltisi ile değiştirin ve 4 °C'de 24 saat çalkalayın.
   8. %10 sakarozun yerine %20 sakaroz ve 4 °C'de 24 saat boyunca bir shaker üzerine yerleştirin.
   9. %20 sakarozun yerine %30 sakaroz yerleştirin ve 4 °C'de 24 saat boyunca bir shaker üzerine yerleştirin.
2. Dondurulmuş bölümler
   1. Kuru buz düz bir tabaka hazırlayın ve üstüne etiketli bir plastik kalıp yerleştirin.
   2. Kalıbın içine en uygun kesme sıcaklığıorta (OCT) ince bir tabaka dökün ve sertleşmeye başlayalım (birkaç saniye içinde).
   3. İpucu kesilmiş bir transfer pipetkullanarak kalıp OCT üstüne birkaç organoidler yerleştirin ve organoidlerin konumuna yakın dikkat.
   4. Yavaş yavaş kalıp dolu ve organoidler kaplı olana kadar OCT ekleyin. Ek bir 10 dakika boyunca tamamen sertleşsin.
      NOT: 10 dakikanın üzerinde donma, kesit için birden fazla organoidin ideal göreceli yerleşimini sağlamaya yardımcı olurken, daha hızlı donmak için etanol-kuru buz karışımı veya sıvı nitrojen kullanmak mümkündür.
   5. Keserken bulmayı kolaylaştırmak için organoidlerin göreceli konumunu bir işaretle işaretleyin.
   6. Kalıpları bir torbaya veya kutuya yerleştirin ve bölümleri kesmeye hazır olana kadar -80 °C'de saklayın.
   7. Bir kriyostat kullanarak, 10 μm kesitleri dilimleyin ve dokuyu etiketli, pozitif yüklü slaytlara yerleştirin.
3. Boy -ama
   1. Bloke çözeltisi hazırlayın (%0.3 Triton X-100, PBS'de %4 normal eşek serumu).
   2. Doku çevresi etrafında çizmek için bir hidrofobik pap kalem kullanın.
   3. Slaytları PBS ile 3 kez 5 dakika boyunca durulayın.
   4. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBS'yi bloklama çözeltisi ile değiştirin.
   5. Bloke çözeltisini bir gecede 4 °C'de antikor solüsyonu (uygun konsantrasyonda antikor, %0.1 Triton X-100, PBS'de %4 normal eşek serumu) değiştirin.
   6. Ertesi gün, her biri 10 dakika pbs ile 3 kez slayt yıkayın.
   7. PBS'yi oda sıcaklığında 1 saat boyunca antikor çözeltisinde seyreltilmiş uygun ikincil antikorla (uygun konsantrasyonda) değiştirin.
   8. 1x PBS ile her seferinde 10 dakika boyunca 3 kez durulayın.
   9. 4',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) lekesini uygulayın ve 1x PBS ile her biri 10 dakika boyunca üç kez durulayın.
   10. Yapıştırmak kapakları kapakları, montaj çözeltisi ile kaydırakların ön kısmı, karanlıkta oda sıcaklığında kurumasını bekleyin ve 4 °C'de karanlıkta saklayın.

Şekil 1, protokolün farklı aşamalarında hücrelerin/organoidlerin nasıl göründüğünü göstermek için birkaç zaman noktasının temsili parlak alan görüntülerini gösterir. HESC'ler doku kültür plakasından çıkarıldı, küçük parçalara ayrıldı ve küreler oluşturdukları T75 ultra-düşük ek şişesine yerleştirildi. Bu hücrelerin parlak ve benzer boyutlarda, karanlık olmadan, bu kümelerin merkezlerinde ölmekte olan hücreler bakmak dikkat etmek önemlidir. Hücreler yavaş yavaş bFGF kapalı kesildi. 5. gün, nöral indüksiyon ortamına yerleştirildiler ve kültür dönemi boyunca bu medyada kaldılar. Organoidler zamanla daha büyük ve dolayısıyla koyu olsun rağmen, beyin organoid gelişimi boyunca mevcut nöral rozet benzeri yapılar (siyah oklar) dikkat çekmek ve genişletmek önemlidir. Rozetler nöral farklılaşmanın başlangıcını gösterir ve embriyonik nöral tüpün özelliklerini içerir, epitel özellikleri gösteren ve apikal lümeni çevreleyen15.

Kültürde 5 ayda hematoksilin ve eozin ile organoidlerin boyanması, durgun kültür sistemi göz önüne alındığında ilk endişe kaynağı olan merkezlerde bile büyük miktarda nekroz olmadığını göstermiştir(Şekil 2A). Bu organoidler, deneyimli bir nöropatolog tarafından yapılan ışık mikroskobik değerlendirmesine dayanarak insan korteksine benzer histolojik morfoloji göstermiştir(Şekil 2B). Histoloji ile glia (mavi ok başı), nöronlar (kırmızı ok ucu), Cajal-Retzius morfolojisi (siyah oklar) ve nöropil (turuncu ok başı)(Şekil 2B,C)hücrelerine benzeyen birçok benzersiz hücre morfolojisi gözlenmiştir.

Hücrelerdeki gen ekspresyonuna daha derinlemesine bakmak için qRT-PCR uygulandı. Şekil 3'tegösterilen sonuçlar için, her çubuk bağımsız olarak yetiştirilen ve belirtilen zaman noktasında hasat edilen 3 ayrı hücre toplunu temsil eder. Bu örnekler daha sonra temizlik geni, GAPDHek olarak belirtilen gen bir astar çifti ile triplicate çalıştırıldı. Glutamat taşıyıcı, Vglut1 (Şekil 3A), 2.5 hafta olarak ifade edildi, 5 hafta arttı, ve kültür de 5 ay boyunca tutarlı kaldı. Bir ön beyin belirteci, Foxg1 (Şekil 3B), kültürde 5 haftaya kadar düşük seviyelerde ifade edildi. Derin tabaka belirteci, Tbr1 (Şekil 3C), yaklaşık 5 hafta doruğa ulaştı ve daha sonra azaldı, üst tabaka belirteci ise, Satb2 (Şekil 3D), zamanla arttı.

Ventral marker Engrailed1 (Eng1) (Şekil 3E), arka beyin/omurilik belirteci Hoxb4 (Şekil 3F),oligodendrosit belirteci, Olig2 (Şekil 3G), zamanla artmıştır. Buna karşılık, kök hücre belirteci, Sox2 (Şekil 3H), zamanla azalmıştır. Glial marker, FAP (Şekil 3I),5 hafta ile doruğa ulaştı ve daha sonra nispeten sabit kaldı. Buna ek olarak, immünoresans verileri qRT-PCR verileri ile tutarlıydı. 10 hafta orada Foxg1 sağlam bir ifade oldu (Şekil 4A). Sox2 ekspresyonu subventriküler zonu (SVZ)(Şekil 4B,C)benzeyen bölgelerle daha sınırlıydı. İlginçtir, ayrıca dış radyal glial hücre belirteci bazı ifade vardı, HopX (Şekil 4D).

Şekil 1: Organoid büyüme koşullarına ve morfolojiye genel bakış. (A) Medya değişikliklerinin şeması. (B-M) Organoidlerin olgunlaştıkça ki temsili görüntüleri. (B-M) H9 hESCs(B) beyin organoidleri oluşturmak için kullanılmıştır. Organoidler (C) gün 20 ng/mL bFGF medya, ve (D) gün 3 ve (E) gün 4 10 ng/mL bFGF medya. (F-M) 5 (F), 8 (G), 10 (H), 17 (I) 35 (J,K), 70(L,M)gün içinde nöral indüksiyon media (NIM) organoidler. Oklar sinir rozetlerini işaret ediyor. Ölçek çubuğu = 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Organoidler histolojik benzerlikleri insan beyin dokusuna paylaştılar. Organoidlerin H&E 5 ay(A)ile insan korteksine benzeyen bir tabaka ile boyanma(B). Yüksek büyütme de glia (mavi ok başı), nöronlar (kırmızı ok ucu), nöropil (turuncu ok başı) ve Cajal-Retzius morfolojisi (siyah oklar)(B,C)hücreleri gibi birçok hücre morfolojisi gözlenmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Zamanla beyin organoidleri içindeki nörogelişimsel genlerin ekspresyonu. SYBR yeşili kullanılarak yapılan kantitatif RT-PCR verileri Vglut1 (A), Foxg1 (B), Tbr1 (C), Satb2 (D), En1 (E), Hoxb4 (F), Olig2 (G), Sox2 (H) ve GFAP (I) ifadesini değerlendirir. Hata çubukları = ortalama ± standart sapma (n ≥ 3). Bu rakam16'dandeğiştirilmiştir. Astar bilgileri için Tablo 1'e bakınız. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Beyin organoidlerinde nörogelişimsel proteinlerin ekspresyonu 10 hafta. İmmünofloresans Foxg1 sağlam bir ekspresyonu ortaya (A), Sox2 lokalize ekspresyonu (B,C) ve HopX varlığı (D). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Şekil 3'te nicel RT-PCR için kullanılan astar dizileri.

S.G.K. Dansar BT ve Hücre İçi Gen için SAB üyesidir.